- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 3537o C trong 30 40 giây.
4.NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHÔI Chuẩn bị
Chuẩn bị
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) tinh trùng được chuẩn bị sẵn (đĩa 35mm)
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) môi trường CR1aa (chuẩn bị trước 2 giờ trước khi sử dụng)
- Trứng đã được IVM - Tủấm CO2
Tiến hành
- Chuyển 15 – 20 trứng đã IVM vào mỗi vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng) trong đĩa 35mm có phủ dầu khoáng. Lưu ý, khi chuyển trứng, hút càng ít lượng môi trường nuôi trứng kèm theo thì càng tốt. Đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở
38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ, sau đó quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
4. NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHÔI Chuẩn bị Chuẩn bị
Môi trường nuôi cấy phôi (môi trường CR1aa) ít nhất là 2 giờ trước khi lấy phôi/trứng đã thụ tinh. Môi trường này cũng ủ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước.
Mouth pipette: đường kính pipette 100µm
Tiến hành
Sau khi thụ tinh 5-6 giờ thụ tinh, các tế bào trứng được loại bỏ cumulus bằng mouth pipette có gắn pipette pasteur. Các hợp tử giả định được chuyển vào các vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi được phủ dầu khoáng và nuôi ở 38,5oC; 5% CO2. Sự phân chia của hợp tửđược đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 46 – 48 giờ sau thụ tinh. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc độ phân chia được xác định dựa trên số phôi phân chia trong số phôi/trứng trong một giọt nuôi cấy ban đầu. Sau 5 ngày nuôi cấy bổ sung huyết thanh vào giọt nuôi cấy: Thêm 5µl FBS đã được lọc vô trùng và làm ấm vào mỗi giọt nuôi
cấy. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy đánh giá sự phát triển của phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi đến giai đoạn blastocyst.