NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. NỘI DUNG 1: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG THU NHẬN TỪ LÒ MỔ VÀ TINH TRÙNG NGOẠI NHẬ P
ĐÔNG LẠNH
Hình 2.1. Sơđồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 2.1.1. CHUẨN BỊ TRỨNG
- Hóa chất
NaCl 0,9%: nước muối sinh lý sử dụng để rửa và giữ mẫu buồng trứng trong thời gian vận chuyển từ lò mổđến PTN. Dung dịch nước muối sinh lý được hấp khử trùng, để nguội dưới 450C, trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma).
Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng. Trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml và ủấm ở 37oC.
Môi trường Flushing (FLUSH 050, Fertipro) (môi trường W1): sử dụng để
rửa trứng trước khi IVM.
TCM-199 (M3769, Sigma) + 10% FBS (Gibco) (môi trường C1): môi trường nuôi chín trứng chứa 10% huyết thanh bò là một trong những môi trường
quan trọng giúp trứng phát triển và trưởng thành. Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế
bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
Môi trường VS1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dung để
cần bằng trứng
Môi trường VS2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dung để bảo quản trứng ở -196oC
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ lỏng, một số
dụng cụ thủy tinh: bercher, erlen…
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủấm CO2 (Sanyo, Nhật)
Thu nhận trứng
Buồng trứng bò được thu nhận tại lò mổ Vissan (Đợt 1) và lò mổ tại Đức Hòa, Đức Huệ, Long An (Đợt 2) được bảo quản trong nước muối sinh lí ấm, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (PTN). Tại PTN, lọ mẫu buồng trứng được lau sạch bằng cồn 70o, rửa sạch máu, mỡ và chuyển vào tủ cấy vô trùng. Dùng kẹp vô trùng chuyển mẫu ra khay, rửa buồng trứng từ 2 đến 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh đã làm ấm 37oC (Hình 2.2). Cho buồng trứng vào
đĩa Petri d = 90mm có chứa NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh được làm ấm 37oC
để giữ mẫu. Dùng gạc vô trùng lau khô buồng trứng rồi chuyển vào becher chứa D – PBS có kháng sinh đã làm ấm để giữ mẫu.
Thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút: Sử dụng đầu kim 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml dung dịch D –PBS có kháng sinh đã làm ấm trong
becher (không phải becher giữ mẫu). Đâm mũi kim vào các nang có đường kính từ 2 - 8mm (Hình 2.3), hút dịch nang cho đến khi được khoảng 3ml thì chuyển dịch vào đĩa petri nhựa Φ60 và các đĩa chứa dịch nang trứng được chuyển vào tủ ấm 38,5oC từ 5–10 phút để lắng. Sau đó soi tìm và phân loại trứng dưới kính hiển vi đảo ngược (hoặc kính hiển vi soi nổi) ởđộ phóng đại 40 lần.
Hình 2.2. Rửa buồng trứng Hình 2.3. Thu nhận trứng từ buồng trứng
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở
lên) từđĩa D – PBS cho vào các giếng có môi trường W1 và C1để rửa.
- Sau đó cho khoảng 10 đến 20 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trường C1 (loại đĩa 4 giếng chứa 100 µl/giếng và phủ dầu khoáng).
- Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Lưu ý: Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử
dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, chuyển các trứng có cumulus giãn nở rộng sang các vi giọt sạch môi trường C1 chờđể thụ tinh.
Trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả trưởng thành sau khi IVM, tất cả các trứng sau khi IVM bị tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trưởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều.
Đông lạnh trứng (dùng cho nội dung 3)
Sau 22 – 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bước: Trứng được cân bằng trong môi trường VS1 (TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trường VS2 (TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây.
Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng môi trường VS2, sau
đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trường VS2 (Hình 2.4) và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa. Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh).
Hình 2.4. Cọng rạ chứa trứng