- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 3537o C trong 30 40 giây.
6. XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KĨ THUẬT PCR
6.1. Tách DNA
DNA phôi được tách chiết bằng phương pháp nhiệt
- Bổ sung 5 µl Tris-HCl 10 mM pH 8,0 vào các eppendorf 0,2 ml chứa sẵn cụm 2-8 tế bào sau khi sinh thiết.
- Đun eppendorf này ở 95o C trong 5 phút để tách DNA (sử dụng máy PCR).
- DNA phôi có thể lưu trữ trong tủ lạnh -20oC.
6.2. Phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi S4
Tiến hành
Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
- 5 µl DNA phôi (từ việc tách trên) - 15 pmol mỗi mồi
- 1,25 U Taq polymerase - 0,2 mM dNTP
- 1X Taq buffer.
- Hỗn hợp phản ứng là 25µl.
Mồi cho xác định giới tính ở bò là cặp mồi S4B có trình tự như sau: (Theo Kageyama và cs., 2004)
S4BF: CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG
Chu kì phản ứng PCR:
- Phản ứng PCR được thực hiện trong 45 chu kỳ
- Mỗi chu kì: 95oC, 30s; 52oC, 45s; 72oC, 45s
- Với 5 phút pre-heat và 5 phút ở 720C sau khi hoàn tất 45 chu kì, sau
đó hỗn hợp sẽđược giảm nhiệt độ xuống 40oC trong 5 phút.
Xác định kết quả: Nếu là con cái sẽ hiện một vạch ở vị trí 145 bp, con đực sẽ có hai vạch ở 178 bp và 145 bp.
7. ĐÔNG LẠNH PHÔI Chuẩn bị dung dịch Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch 1: Môi trường PBS + 15% FCS Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol
Tiến hành
Hút phôi vào cọng rạ
Phôi sau khi được đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn được rửa bằng dung dịch 1 ít nhất 3 lần, tiếp theo chuyển phôi sang dung dịch 2 trong 5 phút và cuối cùng nạp phôi vào cọng rạ (1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ bằng máy ép, để cân bằng trong cọng rạ 15 phút.
Để tránh nhầm lẫn trong việc chọn phôi, trên cọng rạ phải ghi một số
thông tin như: giống, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển của phôi.
Quy trình đông lạnh phôi
Đặt sẵn chương trình trên máy đông lạnh như sau:
- Đưa phôi vào máy, hạ nhiệt độ xuống – 7oC, giữ phôi 5 -10 phút. Tốc độ
hạ nhiệt 1oC/phút.
- Tạo đá: lấy pank và bông nhúng vào nitơ lỏng, sau đó, kẹp vào phía đầu của cọng rạ (đầu có nút bấc), sau đó để vào máy 5 phút, nếu môi trường đã thành đá là quá trình tạo đá đã hoàn thành.
- Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -33oC hoặc 35oC với tốc độ 0,2 - 0,4oC/phút. Giữ phôi ở nhiệt độ này 5 -10 phút. Sau đó, đưa cọng rạ có chứa phôi thẳng vào nitơ lỏng -196oC bảo quản với thời gian mong muốn.
PHỤ LỤC 3
QUY TRÌNH TẠO PHÔI BẰNG TRỨNG ĐÔNG LẠNH VỚI TINH TRÙNG ĐÔNG LẠNH TRÙNG ĐÔNG LẠNH