NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG THU TỪ SIÊU ÂM VÀ TINH TRÙNG NGOẠI ĐÔNG LẠNH
Hình 2.10. Sơđồ bố trí thí nghiệm nội dung 2.
Ở nội dung 2, các bước làm giống với nội dung 1, chỉ khác ở nguồn trứng. Trứng trong nội dung 2 được thu nhận từ bò sống bằng phương pháp siêu âm, cụ
thể khâu chuẩn bị trứng như sau:
Trứng được thu nhận từ bò cho trứng bằng phương pháp siêu âm qua âm
đạo. Bò cho trứng là bò sữa thế hệ F2 (Holstein Friesian) đã sinh 3 - 4 lần. Việc thu nhận được thực hiện 2 lần/tuần. Trứng được giữ trong môi trường, nhiệt độ được duy trì ở 36oC, nhanh chóng vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tiến hành lọc lại dịch chứa trứng để giảm thể tích dịch, và rót dịch vào đĩa Petri nhỏ, tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi.
Chọn những trứng loại A và loại B đem nuôi cấy (xem phần 2.1). Sau khi nuôi 22 – 24h, chọn những trứng chín để chuẩn bị thụ tinh trong ống nghiệm.
Hình 2.11. Một số hình ảnh siêu âm thu nhận trứng bò. 2.3. NỘI DUNG 3: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG ĐÔNG LẠNH VÀ TINH TRÙNG NGOẠI ĐÔNG LẠNH
Hình 2.12. Sơđồ bố trí thí nghiệm nội dung 3.
Ở nội dung này, khâu chuẩn bị tinh trùng, tạo phôi, nuôi phôi và đông lạnh phôi giống nhưở nội dung 1, chỉ riêng trứng phục vụ cho thí nghiệm này là trứng đông lạnh.
Trứng sử dụng trong nghiên cứu này là nguồn trứng đông lạnh được từ 2 nơi: - Nguồn 1: trứng tươi thu từ lò mổ, sau đó đông lạnh (trứng do Phòng thí
nghiệm-PTN) (xem nội dung 1)
- Nguồn 2: trứng đông lạnh mua từ nước ngoài (Trứng mua), tại Trung tâm giống Bomed, Inc ; Madison, Wisconsin, Canada.
Giải đông trứng
Trứng mua:
Trứng mua vềở dạng đông lạnh trong cọng rạ hở (0,25ml) phải được giải
đông trước khi sử dụng.
Lấy cọng rạ chứa trứng đang ở nhiệt độ -196oC để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 35 – 37oC trong 30 giây. Sau đó, trứng được chuyển sang đĩa petri trống, thu nhận trứng dưới kính hiển vi soi nổi và chuyển vào đĩa nuôi chứa môi trường OCM đã được làm ấm, để 2 – 3 giờ trong tủ nuôi 38,5oC và 5% CO2
nhằm theo dõi và đánh giá sự sống, chết của trứng.
Trứng đông lạnh tại phòng thí nghiệm: Trứng được rã đông theo 03 bước.
♦ Môi trường RĐ1: TCM–199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose ♦ Môi trường RĐ2: TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose ♦ Môi trường RĐ3: TCM–199 + 10% FBS
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống.
Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trường giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trường RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ
phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứ môi trường nuôi trứng, để trong tủ
nuôi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trước khi đánh giá sự sống chết của trứng.
Lưu ý: mỗi lần chuyển trứng sang các giọt môi trường tương ứng, cần quan sát hình thái của trứng dưới kính hiển vi đảo ngược và thao tác nhanh, tránh làm tổn thương trứng.
Tất cả các trứng (mua và tựđông lạnh) được đánh giá là còn sống sau khi rã đông, không bị tổn thương về mặt hình thái sẽ đem làm thụ tinh trong ống nghiệm.