NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1.6.3. Phản ứng LAMP
Từ kết quả của một nghiên cứu trong nhóm cho thấy sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện giới tính dễ dàng, chính xác và nhạy hơn phương pháp PCR. Khi sử dụng số lượng phôi bào ít (2 phôi bào), PCR cho kết quả yếu, khó phân biệt; trong khi đó, LAMP cho kết quả mạnh, rõ ràng. LAMP có thể cho kết quả tốt khi chạy PCR với lượng DNA của 1 tế bào.
Phương pháp LAMP khuếch đại trình tựđặc hiệu gen SRY trên nhiễm sắc thể Y. Kết quảđiện di, con đực sẽ hiện một smear dài trên vạch điện di, con cái thì không.
Hỗn hợp phản ứng:
- 5µl DNA phôi hay DNA từ thịt bò - 1,6µM mồi trong
- 1,4mM dNTP - 0,6M betaine - 20mM Tris-HCl (pH 8,8) - 10mM KCl - 10mM (NH4)2SO4 - 8mM MgSO4 - 0,1%Tween 20 - 8U Bst DNA polymerase. - Hỗn hợp phản ứng là 25µl.
Thiết lập phản ứng LAMP với các mồi đặc hiệu cho giới tính đực có trình tự như sau: (Theo Hiroki Hirayama và cs., 2003)
FIP:5’AGCTATGTGGCATGTGGATCCTTCCCTGGAAATGTTTAAG TG-3’ BIP:5’TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGCTTCTCTTTCCTG CTTC-3’ F3: 5’-AGCCAAGAAGTGGATGAATC-3’ B3: 5’- GCAGTGCATTTCCTCCTC-3’ Trình tự cặp mồi LAMP đặc hiệu loài cho bò:
FIP:5’-GAGGAACATTGGCTTCTGGACAAGCRGGGGATTGCTCT-3’
BIP:5’-AGTGGAAGCAAAGAACCCCACCCAGTGAGCTCCAA-3’
F3: 5’-AGGCTGCCTCTTGTGTT-3’
B3: 5’- CATGGCCTAGAGACCAATC-3’
Hỗn hợp được đun nóng ở nhiệt độ 95oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh bằng đá, 8U Bst DNA polymerase được thêm vào, sau đó ủở 65oC trong 1 giờ và
đun nóng ở 80oC trong 10 phút để kết thúc phản ứng.
Đọc kết quả
Đánh giá kết quả bằng phương pháp điện di.
Sau khi phản ứng PCR và LAMP đã hoàn tất, các mẫu được chạy điện di trong gel agarose 2% đối với phản ứng LAMP và gel agarose 3% đối với phản
ứng PCR. Gel được đổ bằng TAE 1X.
Điện di đuợc thực hiện trong 30 phút với PCR và 20 phút với LAMP trong TAE 1X.
Sau đó gel được nhuộm trong dung dịch 0,5µg/ml ethidium bromide. Kết quả sẽđược quan sát trên bàn đèn điện di