- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 3537o C trong 30 40 giây.
6. XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KĨ THUẬT PCR VÀ LAMP
6.1. Tách DNA
DNA phôi được tách chiết bằng phương pháp nhiệt
- Bổ sung 5 µl Tris-HCl 10 mM pH 8,0 vào các eppendorf 0,2 ml chứa sẵn cụm 2-8 tế bào sau khi sinh thiết.
- Đun eppendorf này ở 95o C trong 5 phút để tách DNA (sử dụng máy PCR).
- DNA phôi có thể lưu trữ trong tủ lạnh -20oC.
6.2. Phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi S4
Tiến hành
Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
- 5 µl DNA phôi (từ việc tách trên) - 15 pmol mỗi mồi
- 1,25 U Taq polymerase - 0,2 mM dNTP
- 1X Taq buffer.
- Hỗn hợp phản ứng là 25µl.
Mồi cho xác định giới tính ở bò là cặp mồi S4B có trình tự như sau: (Theo Kageyama và cs., 2004)
S4BF: CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG
S4BR: GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT
Chu kì phản ứng PCR:
- Phản ứng PCR được thực hiện trong 45 chu kỳ
- Mỗi chu kì: 95oC, 30s; 52oC, 45s; 72oC, 45s
- Với 5 phút pre-heat và 5 phút ở 720C sau khi hoàn tất 45 chu kì, sau
Xác định kết quả: Nếu là con cái sẽ hiện một vạch ở vị trí 145 bp, con đực sẽ có hai vạch ở 178 bp và 145 bp.
6.3. Phản ứng LAMP
Hỗn hợp phản ứng:
- 5µl DNA phôi hay DNA từ thịt bò - 1,6µM mồi trong - 0,2µM mồi ngoài - 1,4mM dNTP - 0,6M betaine - 20mM Tris-HCl (pH 8,8) - 10mM KCl - 10mM (NH4)2SO4 - 8mM MgSO4 - 0,1%Tween 20 - 8U Bst DNA polymerase. - Hỗn hợp phản ứng là 25µl.
Thiết lập phản ứng LAMP với các mồi đặc hiệu cho giới tính đực có trình tự như sau: (Theo Hiroki Hirayama và cs., 2003)
FIP:5’AGCTATGTGGCATGTGGATCCTTCCCTGGAAATGTTTAAG TG-3’ BIP:5’TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGCTTCTCTTTCCTG CTTC-3’ F3: 5’-AGCCAAGAAGTGGATGAATC-3’ B3: 5’- GCAGTGCATTTCCTCCTC-3’ Trình tự cặp mồi LAMP đặc hiệu loài cho bò:
FIP:5’-GAGGAACATTGGCTTCTGGACAAGCRGGGGATTGCTCT-3’
BIP:5’-AGTGGAAGCAAAGAACCCCACCCAGTGAGCTCCAA-3’
F3: 5’-AGGCTGCCTCTTGTGTT-3’
Hỗn hợp được đun nóng ở nhiệt độ 95oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh bằng đá, 8U Bst DNA polymerase được thêm vào, sau đó ủở 65oC trong 1 giờ và
đun nóng ở 80oC trong 10 phút để kết thúc phản ứng.
Đọc kết quả: Đánh giá kết quả bằng phương pháp điện di.
Sau khi phản ứng PCR và LAMP đã hoàn tất, các mẫu được chạy điện di trong gel agarose 2% đối với phản ứng LAMP và gel agarose 3% đối với phản
ứng PCR. Gel được đổ bằng TAE 1X.
Dung dịch nạp mẫu được trộn lẫn với mẫu
Điện di đuợc thực hiện trong 30 phút với PCR và 20 phút với LAMP trong TAE 1X.
Sau đó gel được nhuộm trong dung dịch 0,5µg/ml ethidium bromide. Kết quả sẽđược quan sát trên bàn đèn điện di: con đực sẽ hiện một smear dài trên vạch điện di, con cái thì không có smear dài trên vạch điện di.
7. ĐÔNG LẠNH PHÔI Chuẩn bị dung dịch