- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 3537o C trong 30 40 giây.
3. CHUẨN BỊ TRỨNG Hóa chất
- Hóa chất
NaCl 0,9%: nước muối sinh lý sử dụng để rửa và giữ mẫu buồng trứng trong thời gian vận chuyển từ lò mổđến PTN. Dung dịch nước muối sinh lý được hấp khử trùng, để nguội dưới 450C, trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma).
Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng. Trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml và ủấm ở 37oC.
Môi trường Flushing (FLUSH 050, Fertipro) (môi trường W1): sử dụng để
rửa trứng trước khi IVM.
TCM-199 (M3769, Sigma) + 10% FBS (Gibco) (môi trường C1): môi trường nuôi chín trứng chứa 10% huyết thanh bò là một trong những môi trường quan trọng giúp trứng phát triển và trưởng thành. Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế
bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
Môi trường VS1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dung để
cần bằng trứng
Môi trường VS2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dung để bảo quản trứng ở -196oC
Môi trường RĐ1: TCM–199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose
Môi trường RĐ2: TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm, 35mm (Corning, Mỹ), đĩa 4 giếng (Nunc,
Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ
lỏng, một số dụng cụ thủy tinh: bercher, erlen…
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủấm CO2 (Sanyo, Nhật)
Thu nhận trứng
Buồng trứng bò được thu nhận tại lò mổ được bảo quản trong nước muối sinh lí ấm, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (PTN). Tại PTN, lọ mẫu buồng trứng được lau sạch bằng cồn 70o, rửa sạch máu, mỡ và chuyển vào tủ cấy vô trùng. Dùng kẹp vô trùng chuyển mẫu ra khay, rửa buồng trứng từ 2 đến 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh đã làm ấm 37oC. Cho buồng trứng vào đĩa Petri d = 90mm có chứa NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh được làm
ấm 37oC để giữ mẫu. Dùng gạc vô trùng lau khô buồng trứng rồi chuyển vào becher chứa D – PBS có kháng sinh đã làm ấm để giữ mẫu.
Thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút: Sử dụng đầu kim 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml dung dịch D –PBS có kháng sinh đã làm ấm trong becher (không phải becher giữ mẫu). Đâm mũi kim vào các nang có đường kính từ 2 - 8mm, hút dịch nang cho đến khi được khoảng 3ml thì chuyển dịch vào đĩa petri nhựa Φ60 và các đĩa chứa dịch nang trứng được chuyển vào tủ ấm 38,5oC từ 5–10 phút để lắng. Sau đó soi tìm và phân loại trứng dưới kính hiển vi đảo ngược (hoặc kính hiển vi soi nổi) ởđộ phóng đại 40 lần.
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở
lên) từđĩa D – PBS cho vào các giếng có môi trường W1 rửa 3 – 5 lần, rồi chuyển sang đĩa chứa môi trường C1để rửa sạch. Sau đó cho khoảng 10 đến 20 phức hợp
COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trường C1 (loại đĩa 4 giếng chứa 100 µl/giếng và phủ dầu khoáng).
- Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Lưu ý: Môi trường W1, C1 cần ủấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, chuyển các trứng có cumulus giãn nở rộng sang các vi giọt sạch môi trường C1 chờđể thụ tinh.
Trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả trưởng thành sau khi IVM, tất cả các trứng sau khi IVM bị tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trưởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng. Ở thí nghiệm này, trứng sau khi IVM được dùng để đông lạnh nên sẽ không loại bỏ cumulus.
Đông lạnh trứng
Sau 22 – 24h nuôi, chọn những trứng chín (lớp cumulus giãn nở rộng)
đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bước: Trứng
được cân bằng trong môi trường VS1 (TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trường VS2 (TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây.
Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng môi trường VS2, sau
đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trường VS2 và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa.
Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh). Trên mỗi cọng rạ ghi số
lượng trứng, ngày đông lạnh.
Giải đông trứng
Trứng mua: Trứng mua về ở dạng đông lạnh trong cọng rạ hở (0,25ml) phải được giải đông trước khi sử dụng.
Lấy cọng rạ chứa trứng đang ở nhiệt độ -196oC để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 35 – 37oC trong 30 giây. Sau đó, trứng được chuyển sang đĩa petri trống, thu nhận trứng dưới kính hiển vi soi nổi và chuyển vào đĩa nuôi chứa
môi trường OCM đã được làm ấm, để 2 – 3 giờ trong tủ nuôi 38,5oC và 5% CO2
nhằm theo dõi và đánh giá sự sống, chết của trứng.
Trứng đông lạnh tại phòng thí nghiệm: Trứng được rã đông theo 03 bước.
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống.
Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trường giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trường RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ
phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trường nuôi trứng, để trong tủ
nuôi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trước khi đánh giá sự sống chết của trứng.
Lưu ý: mỗi lần chuyển trứng sang các giọt môi trường tương ứng, cần quan sát hình thái của trứng dưới kính hiển vi soi nổi (hoặc kính hiển vi đảo ngược) và thao tác nhanh, tránh làm tổn thương trứng.
Tất cả các trứng (mua và tựđông lạnh) được đánh giá là còn sống sau khi rã đông, không bị tổn thương về mặt hình thái sẽ đem làm thụ tinh trong ống nghiệm.
2. CHUẨN BỊ TINH TRÙNG - Hóa chất - Hóa chất
Môi trường BO dùng để hoạt hóa tinh trùng đông lạnh và tạo vi giọt thụ
tinh. Dầu khoáng (Merck) - Dụng cụ Kép, kẹp, buồng đếm hồng cầu, lamelle, ống Falcon 15ml, đĩa 35mm, các loại pipetteman, đầu típ 1ml, 0,2ml. - Thiết bị Water bath, tủấm CO2 - Tiến hành
Nguồn tinh trùng: tinh trùng nhập ngoại giống tốt, được mua tại Trung tâm Chuyển giao Khoa học Kĩ thuật, Viện Chăn nuôi.
Giải đông tinh trùng
- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 35-37o C trong 30 - 40 giây. bểổn nhiệt ở nhiệt độ 35-37o C trong 30 - 40 giây.
Thu nhận và hoạt hóa tinh trùng
Tinh trùng sau khi giải đông được pha loãng và hoạt hóa trong môi trường BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml và heparin 4µl/ml, sau đó li lần thứ nhất1800 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ phần trên, để lại phần dưới đáy khoảng 0,5ml và huyền phù dịch này. Tiếp theo tiến hành ly tâm lần 2 với tốc độ
và thời gian như lần 1, phần lắng dưới đáy ống falcon được pha loãng bằng môi trường BO sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml. Dịch huyền phù này dùng
để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100µl/giọt), phủ dầu khoáng, giữ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2. Như vậy, mỗi vi giọt chứa khoảng 5-6.105 tinh trùng. Lượng tinh trùng này được sử dụng cho thụ tinh 15-20 trứng trong một vi giọt. Nghĩa là cần khoảng 25 đến 30 ngàn tinh trùng để thụ tinh cho 1 trứng.
3. THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuẩn bị Chuẩn bị
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) tinh trùng được chuẩn bị sẵn (đĩa 35mm)
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) môi trường CR1aa (chuẩn bị trước 2 giờ trước khi sử dụng)
- Trứng đã được IVM - Tủấm CO2
Tiến hành
- Chuyển 15 – 20 trứng đã IVM vào mỗi vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng) trong đĩa 35mm có phủ dầu khoáng. Lưu ý, khi chuyển trứng, hút càng ít lượng môi trường nuôi trứng kèm theo thì càng tốt. Đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở
38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ, sau đó quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
4. NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHÔI Chuẩn bị Chuẩn bị
Môi trường nuôi cấy phôi (môi trường CR1aa) ít nhất là 2 giờ trước khi lấy phôi/trứng đã thụ tinh. Môi trường này cũng ủ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước.
Mouth pipette: đường kính pipette 100µm
Tiến hành
Sau khi thụ tinh 5-6 giờ thụ tinh, các tế bào trứng được loại bỏ cumulus bằng mouth pipette có gắn pipette pasteur. Các hợp tử giả định được chuyển vào các vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi được phủ dầu khoáng và nuôi ở 38,5oC; 5% CO2. Sự phân chia của hợp tửđược đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 46 – 48 giờ sau thụ tinh. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc độ phân chia được xác định dựa trên số phôi phân chia trong số phôi/trứng trong một giọt nuôi cấy ban đầu. Sau 5 ngày nuôi cấy bổ sung huyết thanh vào giọt nuôi cấy: Thêm 5µl FBS đã được lọc vô trùng và làm ấm vào mỗi giọt nuôi cấy. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy đánh giá sự phát triển của phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi đến giai đoạn blastocyst.
5. ĐÔNG LẠNH PHÔI Chuẩn bị dung dịch Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch 1: Môi trường PBS + 15% FCS Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol
Tiến hành
Hút phôi vào cọng rạ
Phôi sau khi được đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn được rửa bằng dung dịch 1 ít nhất 3 lần, tiếp theo chuyển phôi sang dung dịch 2 trong 5 phút và cuối cùng nạp phôi vào cọng rạ (1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ bằng máy ép, để cân bằng trong cọng rạ 15 phút.
Để tránh nhầm lẫn trong việc chọn phôi, trên cọng rạ phải ghi một số
thông tin như: giống, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển của phôi.
Quy trình đông lạnh phôi
Đặt sẵn chương trình trên máy đông lạnh như sau:
- Đưa phôi vào máy, hạ nhiệt độ xuống – 7oC, giữ phôi 5 -10 phút. Tốc độ
- Tạo đá: lấy pank và bông nhúng vào nitơ lỏng, sau đó, kẹp vào phía đầu của cọng rạ (đầu có nút bấc), sau đó để vào máy 5 phút, nếu môi trường đã thành đá là quá trình tạo đá đã hoàn thành.
- Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -33oC hoặc 35oC với tốc độ 0,2 - 0,4oC/phút. Giữ phôi ở nhiệt độ này 5 -10 phút. Sau đó, đưa cọng rạ có chứa phôi thẳng vào nitơ lỏng -196oC bảo quản với thời gian mong muốn.
Phụ lục 4