- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 3537o C trong 30 40 giây.
7. ĐÔNG LẠNH PHÔI Chuẩn bị dung dị ch
TRÙNG ĐÔNG LẠNH 2.CHUẨN BỊ TRỨ NG
- Hóa chất
NaCl 0,9%: nước muối sinh lý sử dụng để rửa và giữ mẫu buồng trứng trong thời gian vận chuyển từ lò mổđến PTN. Dung dịch nước muối sinh lý được hấp khử trùng, để nguội dưới 450C, trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma).
Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng. Trước khi sử dụng cần bổ sung bồ sung 50IU/ml heparin, 5% CS và 1% kháng sinh..
Môi trường Flushing (FLUSH 050, Fertipro) (môi trường W1): sử dụng để
rửa trứng trước khi IVM.
TCM-199 (M3769, Sigma) + 10% FBS (Gibco) (môi trường C1): môi trường nuôi chín trứng chứa 10% huyết thanh bò là một trong những môi trường quan trọng giúp trứng phát triển và trưởng thành. Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế
bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm, 35mm(Corning, Mỹ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), falcon 50ml, kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ
lỏng, một số dụng cụ thủy tinh: bercher, erlen…
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật), hệ thống máy siêu âm, kim 16G và dài 55cm dùng để chọc hút trứng.
Chuẩn bị:
Hệ thống máy siêu âm, nối đầu dò âm đạo vào máy, gắn kim hút trứng và hút 1 ít môi trườnng D-PBS.
Chuyển bò cần lấy trứng vào nơi cố định, cột giữ đuôi, lấy hết phân ra, rửa sạch bằng nước, sát trùng âm hộ và vùng xung quanh bằng cồn 70o. Gây tê cho bò ở phần đuôi tại vị trí trên hậu môn.
Thu nhận trứng
Trứng được thu nhận từ bò cho trứng bằng phương pháp siêu âm qua âm
đạo. Bò cho trứng là bò sữa thế hệ F2 (Holstein Friesian) đã sinh 3 - 4 lần. Việc thu nhận được thực hiện 2 lần/tuần. Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm và môi trường D-PBS (bổ sung 50IU/ml heparin, 5% CS Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma)) chọc hút trứng.
Cho đầu dò siêu âm có gắn kim vào âm đạo thật nhẹ nhàng đồng thời cho tay qua trực tràng xác định vị trí buồng trứng, nang trứng và điều chỉnh sao cho quan sát thấy các nang trứng trên màn hình máy siêu âm. Tiến hành chọc hút các nang trứng, cứ khoảng 3 – 5 nang thì rút kim ra và hút môi trường thu tế bào trứng để dịch chứa trứng chảy vào ống falcon 50ml. Cứ tiên hành như vậy cho
đên khi hết nang trứng thì chuyển sang buồng trứng còn lại. Dịch hút chứa trứng
được giữ trong môi trường, nhiệt độ được duy trì ở 36oC, nhanh chóng vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tiến hành lọc lại dịch chứa trứng để giảm thể tích dịch, và rót dịch vào đĩa Petri có đường kính 60mm hoặc 90mm, tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi đảo ngược ởđô phóng đại 40 lần
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở
sang đĩa chứa môi trường C1để rửa sạch. Sau đó cho khoảng 10 đến 20 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trường C1 (loại đĩa 4 giếng chứa 100 µl/giếng và phủ dầu khoáng).
- Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Lưu ý: Môi trường W1, C1 cần ủấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, chuyển các trứng có cumulus giãn nở rộng sang các vi giọt sạch môi trường C1 chờđể thụ tinh.
Trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả trưởng thành sau khi IVM, tất cả các trứng sau khi IVM bị tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trưởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều.
2. CHUẨN BỊ TINH TRÙNG - Hóa chất - Hóa chất
Môi trường BO dùng để hoạt hóa tinh trùng đông lạnh và tạo vi giọt thụ
tinh. Dầu khoáng (Merck) - Dụng cụ Kép, kẹp, buồng đếm hồng cầu, lamelle, ống Falcon 15ml, đĩa 35mm, các loại pipetteman, đầu típ 1ml, 0,2ml. - Thiết bị Water bath, tủấm CO2 - Tiến hành
Nguồn tinh trùng: tinh trùng nhập ngoại giống tốt, được mua tại Trung tâm Chuyển giao Khoa học Kĩ thuật, Viện Chăn nuôi.
Giải đông tinh trùng
- Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để trong khí 5 giây rồi cho vào bểổn nhiệt ở nhiệt độ 35-37o C trong 30 - 40 giây. bểổn nhiệt ở nhiệt độ 35-37o C trong 30 - 40 giây.
Thu nhận và hoạt hóa tinh trùng
Tinh trùng sau khi giải đông được pha loãng và hoạt hóa trong môi trường BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml và heparin 4µl/ml, sau đó li
lần thứ nhất1800 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ phần trên, để lại phần dưới đáy khoảng 0,5ml và huyền phù dịch này. Tiếp theo tiến hành ly tâm lần 2 với tốc độ
và thời gian như lần 1, phần lắng dưới đáy ống falcon được pha loãng bằng môi trường BO sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml. Dịch huyền phù này dùng
để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100µl/giọt), phủ dầu khoáng, giữ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2. Như vậy, mỗi vi giọt chứa khoảng 5-6x105 tinh trùng. Lượng tinh trùng này được sử dụng cho thụ tinh 15-20 trứng trong một vi giọt. Nghĩa là cần khoảng 25 đến 30 ngàn tinh trùng để thụ tinh cho 1 trứng.
3. THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuẩn bị Chuẩn bị
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) tinh trùng được chuẩn bị sẵn (đĩa 35mm)
- Đĩa chứa các vi giọt (100 µl/giọt) môi trường CR1aa (chuẩn bị trước 2 giờ trước khi sử dụng)
- Trứng đã được IVM - Tủấm CO2
Tiến hành
- Chuyển 15 – 20 trứng đã IVM vào mỗi vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng) trong đĩa 35mm có phủ dầu khoáng. Lưu ý, khi chuyển trứng, hút càng ít lượng môi trường nuôi trứng kèm theo thì càng tốt. Đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở
38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ, sau đó quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
4. NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHÔI Chuẩn bị Chuẩn bị
Môi trường nuôi cấy phôi (môi trường CR1aa) ít nhất là 2 giờ trước khi lấy phôi/trứng đã thụ tinh. Môi trường này cũng ủ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước.
Mouth pipette: đường kính pipette 100µm
Tiến hành
Sau khi thụ tinh 5-6 giờ thụ tinh, các tế bào trứng được loại bỏ cumulus bằng mouth pipette có gắn pipette pasteur. Các hợp tử giả định được chuyển vào các vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi được phủ dầu khoáng và nuôi ở 38,5oC;
5% CO2. Sự phân chia của hợp tửđược đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 46 – 48 giờ sau thụ tinh. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc độ phân chia được xác định dựa trên số phôi phân chia trong số phôi/trứng trong một giọt nuôi cấy ban đầu. Sau 5 ngày nuôi cấy bổ sung huyết thanh vào giọt nuôi cấy: Thêm 5µl FBS đã được lọc vô trùng và làm ấm vào mỗi giọt nuôi cấy. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy đánh giá sự phát triển của phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi đến giai đoạn blastocyst.
5. SINH THIẾT PHÔI Chuẩn bị Chuẩn bị
- Holding pipette sử dụng trong quy trình thử nghiệm này có đường kính ngoài: 80 – 150µm và đường kính trong: 18 – 25µm. Góc nghiêng của đoạn cuối là 30o.
- Zona Drilling được mài đầu bằng, có đường kính trong bằng 10µm, góc nghiêng đoạn cuối là 30o.
- Biopsy pipette sử dụng trong quy trình thử nghiệm này có đường kính trong khoảng 30 – 35µm, đường kính ngoài vào khoảng 35 – 40µm, góc nghiêng
đoạn cuối là 30o.
- Tạo đĩa vi giọt chứa môi trường sinh thiết phôi:
+ Dùng nắp đĩa X tạo các vi giọt 50µl môi trường CR1aa. + Tạo 1 vi giọt 100µl Tyrode (T1788, Sigma) ở giữa đĩa. + Sau đó phủ dầu khoáng đầy vi giọt.
+ Cho vào tủấm, ủấm ít nhất 3 giờ trước khi tiến hành sinh thiết.
Tiến hành
- Khoan màng pellucida: Khoan màng pellucida bằng Tyrode.
+ Chỉnh vi giọt chứa Tyrode vào vùng trung tâm, hạ zona drilling pipette hút khoảng 10µl Tyrode.
+ Nâng zona drilling pipette lên, chỉnh vi giọt chứa phôi vào vùng trung tâm.
+ Hạ holding pipette xuống, điều chỉnh phôi và giữ phôi bằng holding pipette.
+ Hạ zona drilling pipette xuống, tiếp cận phôi, vừa tiến lại gần vừa đẩy từ
từ và nhẹ nhàng dung dịch Tyrode ra, không được đâm vào phôi, đến khi tạo một lỗ thủng vừa phải trên màng zona, lấy zona drilling pipette.
- Hút 2-8 tế bào lớp lá nuôi phôi (TE) bằng biopsy pipette. Chuyển các cụm tế
bào này vào eppendorf 0,2 ml (eppendorf PCR nắp phẳng).
- Sau đó, chuyển phôi sau khi sinh thiết vào đĩa nuôi, đặt vào tủ ấm 5% CO2, 37°C.
Tế bào TE thu được dùng làm nguyên liệu cho các kĩ thuật phân tích chẩn
đoán tiếp theo.