Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Lai Thành

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Error! Bookmark not defined MỤC LỤC _ 1 MỤC LỤC HÌNH _ Error! Bookmark not defined

MỞ ĐẦU 4 Chương 1 TỔNG QUAN _ 6 1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng _ 6

1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng 6 1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng 9

1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng 14 1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng _ 16

1.3.1 Cấu tạo tinh trùng _ 16 1.3.2 Quá trình sinh tinh 17

1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường _ 18

1.4.1 Sự thành thục của tế bào trứng _ 19 1.4.2 Vai trò của tế bào nang _ 20 1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành thục trứng 21

1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _ 23

1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng _ 23 1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 24 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng 25

1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm _ 27

1.6.1 Sự thụ tinh 27 1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm 27 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm 28

1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm _ 29

1.7.1 Quá trình phát triển phôi 29 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh 31

1.8 Cất giữ lạnh phôi 32

1.9 Giải đông phôi 35 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng 36 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 36

2.2.1 Thiết bị _ 36 2.2.2 Hóa chất 36 2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu _ 38

2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản buồng trứng từ lò mổ 38 2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng _ 38 2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng _ 39 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu được 39 2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro 40 2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng 40 2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 41 2.3.8 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm _ 41 2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử trong ống nghiệm 42 2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi _ 43 2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi 43 2.3.12 Phương pháp giải đông phôi và nuôi cấy phôi sau giải đông _ 45 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu _ 46

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _ 47 3.1 Kết quả thu buồng trứng và tế bào trứng 47 3.2 Kết quả đánh giá, phân loại trứng trước khi nuôi cấy in vitro _ 49 3.3 Kết quả nuôi trứng thành thục 52 3.4 Kết quả thụ tinh và tạo phôi 55

3.4.1 Kết quả thụ tinh của trứng sau khi nuôi in vitro 55 3.4.2 Kết quả tạo phôi từ trứng sau khi nuôi và thụ tinh in vitro 56

3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 59

3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh _ 59

KẾT LUẬN _ 65 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO _ 64

MỞ ĐẦU

Trong suốt quá trình phát triển, loài người đã khai phá thiên nhiên, thuần hóa và chọn lọc rất nhiều loại động vật, giữ lại những giống loài tốt, có lợi cho mình và loại thải những giống không hiệu quả Trong các loài động vật được thuần hóa, lợn là loài động vật gắn bó với con người từ thuở hoang sơ cho tới tận bây giờ Điều này đã nói lên sự cần thiết và vai trò to lớn của lợn trong đời sống con người Vai trò đầu tiên phải kể đến của lợn đó là nguồn thực phẩm cần thiết,

có giá trị dinh dưỡng cao cho con người Theo Harris và cs (1956) thì cứ 100g thịt lợn nạc có 367 Kcal và 22 g protein [18] Trong xã hội hiện đại, lợn còn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nghiên cứu khoa học Theo các nhà nghiên cứu giải phẫu và mô học thì cấu tạo phôi thai của lợn và người có sự tương đồng rất lớn [3] Do đó các nhà nghiên cứu đã sử dụng phôi thai lợn để tiến hành nghiên cứu về cấu tạo, sự phát triển và các cơ chế hoạt động của phôi thai người Còn theo các nhà dinh dưỡng học thì nhu cầu dinh dưỡng và tỷ lệ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của lợn rất gần với con người Vì vậy

mà lợn đã được sử dụng làm đối tượng để tiến hành các thí nghiệm về dinh dưỡng cho con người Cùng với sự phát triển của khoa học thì lợn càng giữ nhiều vai trò quan trọng trong việc phục vụ sức khỏe con người Các nhà nghiên cứu đã sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật, thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn như một bộ máy sinh học để tạo ra nguồn dược liệu quí

Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tạo ra mô hình trên lợn nhiều loại bệnh khác nhau của người bằng cách đưa gen gây bệnh của người vào hệ gen của lợn Mặt khác, cũng bằng cách này, các nhà khoa học còn cố gắng tạo ra cho các bộ phận để chuyển những con lợn chuyển gen của người với khả năng tương đồng cao

về mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép các cơ quan cho người bệnh Kỹ thuật

điều đó trở thành hiện thực Vì các lý do này mà việc nghiên cứu phôi và tạo phôi

lợn in vitro đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới

Xét trên phương diện công nghệ sinh học và chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn

in vitro là kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi bằng cách tạo

ra số lượng phôi lớn có chất lượng tốt và khả năng sống cao Ngoài ra, trứng sau khi nuôi thành thục còn có thể phục vụ cho nhiều nghiên cứu cơ bản khác như: ICSI, cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn các giống quí hiếm, những cá thể giống tốt trong ngân hàng gen [42], [43], [71] So với việc tạo phôi lợn bằng

phương pháp in vivo thì việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vitro có một số ưu

điểm vượt trội Đó là phương pháp này giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ trong các thí nghiệm vì có thể sử dụng các buồng trứng được thu từ các lò mổ với số lượng rất lớn Cùng với đó, số lượng trứng thu được đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm cũng rất nhiều vì vậy chi phí để tạo phôi bằng phương pháp này sẽ giảm đi đáng kể

Ngoài ra, trước thực tế một số giống lợn quí hiếm của nước ta đang nằm trước nguy cơ tuyệt chủng thì nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học các giống lợn là rất

cần thiết Viện Chăn nuôi đã thực hiện bảo tồn bằng phương pháp in situ nhưng

phương pháp này rất tốn kém không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn bằng phôi đông lạnh

Với những mục đích như trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” của chúng tôi đặt ra ba nội dung để giải quyết là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất

lượng phôi lợn bằng cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi

thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro bằng đông lạnh

trong ni tơ lỏng

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng

1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng

Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vật nói chung cũng như ở các gia súc nói riêng Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bên phải Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinh dục cái [33] Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định Ở lợn, mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi Tế bào trứng nằm trong các nang trứng Các hormone được buồng trứng tiết ra là estrogen và progesterone Estrogen được tiết ra từ các nang trứng còn progesterone được tiết

ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục như chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyến vú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái Progesterone có vai trò quan trọng trong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tế bào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp với estrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến vú

Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền vỏ gồm các tế bào

và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phương bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng Ngay bên dưới biểu mô bề mặt

là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng Phía dưới

Người ta cho rằng tất cả nang nguyên thủy (primordial follice) được hình thành trước khi con con vật cái được sinh ra Số lượng lớn nhất được tìm thấy ở bào thai lợn từ ngày 50-90 sau khi thụ thai Nang nguyên thủy là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô Chúng nằm trong nhu mô và thường quan sát được theo nhóm gọi là ổ trứng (egg nest) [55]

Hình 1 : Sơ đồ sự phát triển của nang trứng

Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thường xuyên có các nang trứng ở trạng thái phát triển và thành thục Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạt động sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1) Ngoài các nang trứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1 Đây là những nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển Khi số lượng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong quá trình phát triển, các

tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa

các nang bào Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kết hợp làm một Khi một xoang đã được hình thành thì nang đó được gọi là nang bậc III (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và được gọi là nang Graaf Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng Đây là một dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid Nhiều hormone sinh sản khác cũng như các yếu tố không phải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã được tìm thấy trong dịch nang trứng

Hình 2: Cấu tạo bên trong nang Graaf

Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng (Hình 2) Bao Graaf thường có kích thước rất lớn, ở lợn đường kính bao Graaf trước khi vỡ vào khoảng 8-12 mm, nó đội cả màng trắng và biểu mô phủ buồng trứng lồi hẳn lên trên mặt buồng trứng Bao Graaf là một cái xoang chứa dịch với rất nhiều enzym, hormon, AMP vòng và các phân tử khác, các nang bào bị đẩy ra ngoại vi, hình thành một lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh được gọi là vành phóng xạ sẽ bao quanh trứng khi trứng rụng và cả khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng Khối

tạo thuận lợi cho sự tách noãn khỏi thành nang trứng Màng sáng lúc này đã rất dày và rõ Noãn bào cực đại tuy có kích thước rất nhỏ so với nang trứng (khoảng

150 m so với 15-20mm) Nhân noãn bào rất lớn còn gọi là bóng phôi, nó có thể nằm ở giữa noãn bào hay lệch về một phía hoặc sát với màng tế bào Vỏ nang trứng gồm 2 lớp cũng rất rõ và dày Trước khi trứng rụng một vài giờ, nhân noãn bào di chuyển tới sát màng nhân và tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm và kết thúc trước khi trứng rụng Kết quả của lần phân chia này là từ noãn bào 1 cho ra

2 tế bào con đơn bội (n kép) đồng đều về số nhiễm sắc thể nhưng lại không chia đều tế bào chất Một tế bào chiếm gần như toàn bộ tế bào chất trở thành noãn bào 2 có tác dụng sinh dục Một tế bào nhỏ chỉ có rất ít tế bào chất không có tác dụng sinh dục gọi là thể cực 1 Cả hai tế bào đều nằm bên trong màng sáng Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng

500 lần, kích thước noãn bào cũng tăng lên nhưng không nhiều như nang trứng,

ở người nó tăng từ 10m ở nang nguyên thuỷ lên 80m ở bao Graaf

Dấu hiệu trước khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lưu thông máu cho các mao mạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứng chín Ở vùng này, lớp biểu mô phủ buồng trứng, lớp màng trắng của buồng trứng và vỏ ngoài của nang trứng gián đoạn để lộ ra lớp vỏ trong Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào 2 cùng với vòng tia tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ra ngoài, đồng thời dịch nang trứng trong hốc nang trứng trào ra ngoài Hiện tượng này gọi là sự rụng trứng Phần nang trứng còn lại gọi là thể vàng (hoàng thể) Tuỳ thuộc trứng có làm tổ trong niêm mạc tử cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang hoặc tiêu giảm và biến mất [29]

1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng

Cấu tạo tế bào trứng

Trứng lợn có hình cầu, đường kính của trứng chín không kể màng sáng dao động trong khoảng 120-170 μm (Hình 3) Trứng là loại tế bào có kích thước lớn

nhất trong cơ thể, được biệt hóa cao độ và có khả năng kết hợp với tinh trùng để hình thành hợp tử Hợp tử này sẽ phát triển thành một cơ thể mới

Hình 3 Tế bào trứng lợn thành thục

Lớp vỏ tế bào trứng lợn được gọi là màng sáng, nó do chính tế bào trứng tạo nên Màng sáng là dạng chuyên hoá cao của khuôn ngoại bào (glicocalix) của tế bào trứng, là sự mở rộng các glycoprotein màng từ màng sinh chất Nó bao trực tiếp quanh màng bào tương Lớp này khá dày, nó bảo vệ trứng khỏi các tác động cơ học

có hại Nó còn có tính đặc hiệu loài và ngăn cản không cho các tinh trùng khác loài xâm nhập Ở nhiều loài động vật, màng trứng thứ nhất thường có những vi lỗ xuyên qua gọi là noãn khổng (micropile) Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác nhau tuỳ loài, ở cực trên, cực dưới hoặc ở nơi trứng dính vào buồng trứng Xuyên qua màng sáng có các chồi tế bào chất xuất phát từ các nang bào để tăng cường mối liên kết và trao đổi chất với tế bào trứng Ở động vật có vú còn có các tế bào nang bao quanh trứng gọi là vành phóng xạ có chức năng nuôi dưỡng trứng trong thời gian trứng đã giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua được các lớp tế bào này mới thụ tinh được cho trứng

Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5m), ngay dưới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bên

gọi là vi sợi (microfilament) rất cần thiết cho quá trình phân bào và tạo ra vi lông nhung trên bề mặt trứng giúp cho tinh trùng xâm nhập vào trứng Lớp này còn có rất nhiều hạt vỏ được bao bọc bởi màng sinh chất có cấu trúc tương đồng với thể đỉnh (cũng được tạo ra từ phức hệ Golgi) có chứa rất nhiều enzym Trong hạt vỏ còn chứa các phân tử mucopolisaccarit, là một loại glycoprotein dính và phân tử hyalin Các enzym và mucoprotein sẽ được hoạt hoá để ngăn không cho các tinh trùng khác chui vào sau khi đã có một tinh trùng xâm nhập vào trứng [29]

Sự hình thành tế bào trứng

Sự hình thành và thành thục (chín) của giao tử phải hoàn thành ở cả con đực và con cái trước khi quá trình sinh sản bắt đầu Sự hình thành và thành thục giao tử cái bắt đầu trước khi gia súc được sinh ra Quá trình này được biểu diễn qua Hình 4 Tế bào trứng đầu tiên được gọi là noãn nguyên bào (oogonium) Noãn nguyên bào xuất hiện từ phần kéo dài của túi noãn hoàng (yolk sac), hình thành từ hậu tràng của phôi (hindgut of embryo) Sau khi hình thành, noãn nguyên bào tăng sinh bằng sự phân chia nguyên nhiễm xảy ra trong nhu mô của buồng trứng đang trong quá trình hình thành ở phôi Sự tăng sinh này dừng lại trước khi gia súc được sinh ra, do đó buồng trứng gia súc ở thời điểm sinh ra có một số lượng noãn bào (oocyte) nhất định có khả năng phát triển Noãn bào bước vào tiền kỳ phân bào giảm nhiễm thứ nhất ở thời kỳ bào thai và với phân bào giảm nhiễm bị dừng lại ở cuối tiền kỳ ngay sau khi sinh Noãn bào ở trạng thái

dừng phân chia này được gọi dictyate oocyte

Hình 4 Quá trình hình thành giao tử cái

Ở giai đoạn sau khi sinh ra và lúc trưởng thành (sau khi gia súc thành thục giới tính), sự phát triển và thành thục tế bào trứng thường xảy ra theo chu kỳ Tuy nhiên, trước khi gia súc thành thục về tính không có tế bào trứng nào chín hoàn toàn Những tế bào trứng bắt đầu phát triển trước và sau khi thành thục về tính bị thoái hoá và mất khả năng phát triển Người ta ước tính rằng dưới 1% tế bào trứng đạt đến giai đoạn thành thục và giải phóng ra lúc rụng trứng

Sự phát triển và thành thục của tế bào trứng sẽ tiếp tục theo chu kỳ sau khi thành thục về tính Trong các sóng noãn nang phát triển trong mỗi chu kỳ động

nhiên, ở giai đoạn thể vàng thoái hoá, tế bào trứng ở các nang trội đạt đến sự thành thục và được giải phóng ra thông qua sự rụng trứng vào đường sinh dục (ống dẫn trứng) để thụ tinh.Ở bò, cừu, dê và ngựa thường chỉ có 1 tế bào trứng chín rụng trong khi đó ở lợn có khoảng 10-25 tế bào trứng có thể thành thục và được giải phóng ra lúc rụng trứng

Tiếp sau giai đoạn nghỉ phân bào giảm nhiễm, sự thành thục được phục hồi cùng với sự phát triển của tế bào trứng và sự hình thành màng trong suốt bao quanh tế bào trứng Sự phát triển của tế bào trứng thường đi cùng với sự phát triển của nang trứng FSH kích thích sự tăng sinh của tế bào hạt bao quanh tế bào trứng, cùng với sự phát triển của nang sơ cấp thành nang thứ cấp Sự kích thích tiếp tục của FSH làm cho tế bào hạt tiếp tục tăng sinh và hình thành xoang Trong giai đoạn phát triển này, nang trứng hay tế bào trứng đã đạt tới khả năng rụng trứng trở thành nang trội Khi nang trội và các nang có xoang khác tiết đủ oestrogen, có một đợt LH tăng lên trước rụng trứng Nồng độ LH cao đã xâm nhập vào dịch nang trứng và giải phóng tế bào trứng thoát khỏi trạng thái dừng phát triển Sau đó, quá trình phân bào giảm nhiễm I tiếp tục cho đến khi hoàn thành việc hình thành thể cực thứ nhất Sản phẩm của phân bào giảm nhiễm thứ nhất là tế bào trứng thứ cấp và thể cực thứ nhất nằm giữa màng tế bào chất và màng trong suốt Với sự phân chia này, số nhiễm sắc thể trong tế bào trứng thay đổi từ trạng thái nhị bội (2n) xuống đơn bội (n) Tế bào trứng thứ cấp giữ lại toàn

bộ nguyên sinh chất và một nửa vật chất nhân (nhiễm sắc thể) của tế bào trứng nguyên thuỷ Một nửa vật chất nhân khác được đẩy ra ngoài thành thể cực thứ nhất Sự phân bào giảm nhiễm thứ nhất được hoàn thành ngay trước rụng trứng ở

bò, lợn, cừu và ngay sau khi rụng trứng ở ngựa

Sự phân bào giảm nhiễm lần thứ II (giảm nhiễm II) bắt đầu ngay sau khi hoàn thành sự phân chia lần thứ nhất Sự phân chia này dừng ở trung kỳ II Sự dừng phân bào giảm nhiễm lần II sẽ được giải phóng và phân bào giảm nhiễm II bắt đầu trở lại trong quá trình thụ tinh Với quá trình thụ tinh, sản phẩm của phân

bào giảm nhiễm II là hợp tử (trứng đã được thụ tinh) và thể cực thứ 2 Tế bào trứng thực sự không bao giờ tồn tại ở bò, lợn, cừu hay ngựa, mà chỉ ở dạng chuyển tiếp Tế bào trứng thực sự có thể là sản phẩm của sự phân chia thành thục thứ 2 nếu sự gphân chia được hoàn thành trước khi thụ tinh

1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng

Ống dẫn trứng (hay còn gọi là ống fallop) là một cặp ống xoắn kéo dài từ buồng trứng xuốn chóp sừng tử cung Chức năng của chúng là vận chuyển tinh trùng và tế bào trứng Ngoài ra, ống dẫn trứng còn là nơi xảy ra quá trình thụ tinh

và phân chia của hợp tử ở giai đoạn đầu Về mô học, ống dẫn trứng gồm 3 lớp tế bào khác biệt nhau Lớp ngoài cùng, chủ yếu là mô liên kết, là màng thanh mạc Lớp giữa, gồm cả các sợi cơ vòng và cơ dọc, gọi là áo cơ Lớp trong cùng, gồm

có các tế bào biểu mô phân tiết gọi là áo niêm mạc

Hình 5 Cấu tạo ống dẫn trứng

Ống dẫn trứng là một ống cơ (Hình 5) được chia thành 3 vùng chức năng: phần hình phễu ở gần buồng trứng còn gọi là vùng vân mao giúp thu trứng khi rụng trứng Có nhiều nếp gấp trong niêm mạc phần hình phễu, và hầu hết các tế bào niêm

Lớp cơ

Nếp niêm mạc Mạch máu

gấp dọc, điều đó giúp tăng diện tích bề mặt của phần phình ống Đa số các tế bào niêm mạc phần phình ống là lông chuyển, nhưng cũng có một số tế bào phân tiết có mặt ở đây Tác động của lông chuyển là hỗ trợ cho sự di chuyển của tế bào trứng xuống phía phình ống Phần phình ống nối với phần eo ống ở chỗ nối phình ống -

eo ống Vị trí này rất khó phân biệt bằng giải phẫu và được mô tả là một cấu trúc sinh lý mà ở đó tế bào trứng được giữ lại một thời gian trong lúc di chuyển Sự thụ tinh xảy ra ở chỗ tiếp giáp này Phần eo ống thường nhỏ hơn phần phình ống, nó có đường kính từ 0,5-1mm Nó còn được phân biệt bởi lớp cơ trơn dày hơn so với phần phình ống và có 4 - 8 nếp gấp niêm mạc Tỷ lệ tế bào phân tiết cao hơn tế bào lông chuyển ở phần eo ống Phần eo ống liên quan tới việc vận chuyển tinh trùng có hoạt lực tới vị trí thụ tinh và loại bỏ những tinh trùng đã chết Eo ống nối với đầu sừng tử cung Nhìn chung, ống dẫn trứng co bóp do kích thích của oestrogen và bị

ức chế bởi progesterone

Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp một môi trường phù hợp cho sự di chuyển và chín muồi của các giao tử, thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết những sản phẩm do ống dẫn trứng tiết ra, từ đó có thể giúp cho việc phát triển các môi trường phù hợp để nuôi phôi Môi trường do ống dẫn trứng tạo ra đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu Phân tích sinh hoá dịch ống dẫn trứng có thể giúp nhận biết được những thành phần phù hợp cho môi

trường nuôi phôi ở giai đoạn đầu in-vitro Rõ ràng là mối quan hệ giữa phôi - ống dẫn trứng đặc biệt quan trọng và những hệ thống nuôi trong ống nghiệm nào nhận

biết được mối quan hệ này đều thành công trong việc nuôi phôi trong ống nghiệm Dựa trên sự hiểu biết về tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta đã tổng hợp nên

các môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm [55]

1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng

1.3.1 Cấu tạo tinh trùng

Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn Tinh trùng có kích thước nhỏ hơn trứng rất nhiều lần (50-60 μm), nó có cấu tạo phù hợp với chức năng vận chuyển Tinh trùng mang bộ gen đơn bội và được gọi là giao tử đực Cấu tạo chung của tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần giữa (phần cổ)

và phần đuôi

Phần đầu: Đầu tinh trùng lợn có hình quả lê dẹp, dài 8 μm, rộng 4 μm và dẹp 1 μm Đầu chứa hai bộ phận chính là nhân và thể đỉnh Nhân tinh trùng chứa nhiễm sắc thể ở trạng thái đậm đặc trong một thể tích rất nhỏ, chiếm 65% thể tích phần đầu Thể đỉnh là một cái bao kín dẹp lại thành cái mũ đội lên nhần đầu của nhân Thể đỉnh được hình thành từ thể golgi Thể đỉnh chứa các emzyme thủy phân và nhiều proteaza nhằm giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng trong quá trình thụ tinh

Phần cổ: Sau đầu có một phần rất ngắn, hơi eo lại được gọi là cổ Trong tế bào chất phần cổ chứa hai trung thể, một nằm sát nhân và một nằm xa nhân

Phần đuôi: Chia làm ba đoạn: đoạn giữa, đoạn chính và đoạn cuối Đoạn giữa nằm ngay sau cổ, có thiết diện lớn nhất phần đuôi, gồm có sợi trục và tế bào chất bao quanh Trong tế bào chất chứa rất nhiều ty thể, các ty thể xếp theo hình xoắn ốc xung quanh sợi trục của đuôi Đây được gọi là trạm năng lượng của tinh trùng phục vụ mục đích sản sinh nhiều năng lượng cho tinh trùng hoạt động trong quá trình thụ tinh

Đoạn chính: có cấu trúc tương tự đoạn giữa, và là phần dài nhất của đuôi

và có vai trò ổn định các yếu tố co rút của đuôi

Đoạn cuối: đây là đoạn ngắn nhất, chỉ gồm sợi trục và màng bao quanh, phần này chịu trách nhiệm cho sự chuyển động

1.3.2 Quá trình sinh tinh

Tinh trùng được phát sinh trong tuyến sinh dục đực hay còn gọi là tinh hoàn Quá trình sinh tinh được biểu diễn trong Hình 6

Hình 6 Sơ đồ quá trình hình thành giao tử đực

Các tinh nguyên bào thường nằm sát màng đáy, có kích thước 10 μm và thường có nhân tròn hoặc elip Tinh nguyên bào thế hệ cuối cùng chuyển sang giai đoạn tăng trưởng, lớn lên gọi là tinh bào 1 Các tinh bào 1 đang ở giai đoạn tiền kỳ của giảm phân 1 Kết thúc giảm phân 1, tinh bào 1 phân chia tạo ra hai tế bào nhỏ hơn gọi là tinh bào 2 Ngay lập tức, các tinh bào 2 phân chia thành hai tinh tử

Để trở thành tinh trùng, tinh tử phải trải qua một loạt quá trình biến đổi phức tạp gồm: biến đổi trung thể, biến đổi nhân và hình thành thể đỉnh [1]

Biến đổi trung thể: ở kỳ cuối giảm phân 2, trung thể tách ra làm hai hạt nhỏ

và di chuyển về phía sau, trung thể gần nằm trong hố lõm của màng nhân, trung thể

xa phát ra sợi trục Sợi trục mọc dài kéo theo các biến đổi khác của tinh tử

Sự biến đổi nhân: Nhân mất nước, nhỏ lại, trở nên đồng nhất và bắt màu đậm

Sự hình thành thể đỉnh: Trong tinh tử, hệ thống golgi gồm một hệ thống các bể chứa dẹp và nhiều không bào Các không bào lớn dần, trong chúng xuất hiện các thể đặc biệt gọi là hạt tiền thể đỉnh Các không bào này hợp thành một không bào duy nhất với một hạt thể đỉnh duy nhất Không bào ép sát vào phần đầu của nhân, dẹp lại hình thành thể đỉnh

Cùng với sự bé đi của nhân và hình thành thể đỉnh, sợi trục mọc dài dần

và bào tương di chuyển theo trục về phía đuôi, ty thể tập trung vào phía đầu gần nhân của sợi trục Khi tinh trùng hình thành có một giọt bào tương lớn gồm có bào tương, một phần ty thể và phần còn lại của bộ máy golgi bám vào đuôi tinh trùng Đây là cầu nối các tinh trùng non với nhau [1]

1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường

Sau khi đạt tới kích thước cực đại, noãn bào chuyển sang một giai đoạn mới là giai đoạn thành thục Giai đoạn thành thục diễn ra dưới sự điều khiển của

cơ chế thần kinh – hormone trong tương tác noãn bào với các tế bào xung quanh

Sự chuyển sang thời kỳ thành thục được thực hiện dưới ảnh hưởng của các hormone kích dục tố của thùy trước tuyến yên Dưới tác động của kích dục tố, biểu mô nang sản sinh ra progesteron, chất này đi vào noãn bào và kích thích quá trình thành thục

từ khi tan biến túi mầm đến giai đoạn metaphase II là 19 giờ còn ở lợn là 38 giờ

Do đó để nuôi thành thục trứng lợn đòi hỏi khoảng thời gian là 38-44 giờ

nhân

Màng sáng Túi mầm

Sự thành thục tế bào chất

Đồng thời với các diễn biến của nhân, tế bào chất cũng có nhiều biến đổi Trứng trở nên mọng nước, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất

bề mặt trở nên có tính co giãn và xuất hiện khả năng phân chia Một trong những

sự kiện quan trọng đánh dấu sự thành thục của trứng là sự vỡ màng nhân Màng nhân bị vỡ dưới ảnh hưởng của tác nhân phá hủy màng nhân Tác nhân này xuất hiện trong noãn bào dưới ảnh hưởng của progesteron và không có sự tham gia của nhân Sau khi vỡ màng nhân các tác nhân hội tụ nhiễm sắc thể, tác nhân trương nhân tinh trùng, tác nhân phân bào xuất hiện để chuẩn bị cho các yếu tố cần thiết cho quá trình thụ tinh, hình thành và phát triển phôi [1]

1.4.2 Vai trò của tế bào nang

Tế bào nang là những tế bào soma, xếp thành nhiều lớp bao quanh trứng Các tế bào nang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự thành thục trứng, trong quá trình nuôi cùng trứng, các tế bào nang phát triển, và tăng sinh mạnh, chúng cung cấp một số yếu tố cần thiết cho quá trình ức chế giảm phân và thành thục tế bào chất của trứng qua đó nâng cao khả năng phát triển của trứng [61], [71] Một

số sản phẩm tiết của tế bào nang ảnh hưởng tới sự phát triển của trứng sau khi thụ tinh, đó giống như một loại glutathione - một nhân tố quan trọng để hình thành tiền nhân đực ở trứng sau thụ tinh [61], [69] Các sản phẩm tiết này có thể tăng tỷ lệ với độ giãn nở của các tế bào nang Các tế bào nang còn tham gia chuyển hóa gluco thành pyruvat đưa vào trứng làm nâng cao chất lượng trứng [55] Trong quá trình nuôi thành thục trứng, các tế bào nang có vai trò giữ nhân của trứng ở giai đoạn GV thông qua điều khiển nồng độ cAMP nội bào [10], [61] Do đó khi loại bỏ tế bào nang trong giai đoạn nuôi trứng chín, trứng không chịu tác động của các tế bào nang có thể thành thục nhân sớm hơn [22], [61] Theo Shimada và cộng sự (2003) các tế bào nang còn là nguồn tiết progesterone

xướng sự thành thục nhân của tế bào trứng lợn [53], [54] Do đó độ giãn nở của lớp tế bào nang cũng là một chỉ tiêu để đánh giá sự thành thục của trứng [8]

1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành thục trứng

Vai trò của dịch nang trứng

Dịch nang trứng (porcine follicular fluid - pFF) là dịch thu được từ các nang của buồng trứng Dịch nang trứng có thành phần chính là chất rỉ ra từ xoang nang trứng và một phần khi các nang trứng vỡ ra Dịch nang trứng chứa các thành phần giống như trong huyết thanh, ngoài ra nó còn chứa các protein được tổng hợp trong nang trứng, các enzyme đặc hiệu phục vụ hoạt động của buồng trứng như: ATPase, lactate dehydrogenase, transaminase, alkaline phosphatases và chứa nhiều loại hormone quan trọng tới sự hình thành và phát triển của nang trứng như Gonadotrophin, đặc biệt là các steroid như: oestrogen, androgens và progestogens [41], [70] Dịch nang trứng chứa các yếu tố sinh trưởng, các hoocmon steroid và các thành phần cần thiết cho quá trình phát triển

của trứng mà trong điều kiện nghiên cứu in vitro các môi trường chưa thể bổ

sung đầy đủ [30], [56] Mặc dù việc thu và bảo quản dịch nang đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, khi sử dụng dịch nang trứng khả năng nhiễm khuẩn cao nhưng

nó vẫn được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và sử dụng Dịch nang trứng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành thục nhân, tế bào chất của trứng, quyết định chất lượng trứng sau khi nuôi qua đó nâng cao hiệu quả của quá trình thụ tinh [6], [41] Ngoài ra theo một số tài liệu nó còn tác động tới sự hình thành tiền nhân và khả năng phát triển của phôi [20], [62] Yoshida và cộng

sự (16) cũng báo cáo rằng việc bổ sung dịch nang trứng làm tăng tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ thụ tinh và phát triển của trứng [70] Theo báo cáo của Naito

và Rath việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng có, vai trò trong việc phục hồi quá trình giảm phân của trứng sau thụ tinh [41], [47] Cũng theo Yoshida và cộng sự, trong dịch nang trứng chứa các phân tử trọng lượng

khoảng 10-200 kDa mang tính axit và không bền với nhiệt, các phân tử này chịu trách nhiệm trong sự thành thục và năng lực phát triển của trứng Theo một số tác giả, chất lượng dịch nang trong các nang có kích thước khác nhau là khác nhau Khi nuôi trứng với dịch nang thu từ các nang trứng lớn thì khả năng hình thành tiền nhân đực là lớn hơn khi nuôi trong môi trường bổ sung dịch thu từ các nang nhỏ [12], [23] Ngoài ra dịch nang trứng còn có ảnh hưởng tới khả năng

xâm nhập của tinh trùng ngăn cản sự đa tinh trùng trong quá trình thụ tinh in vitro bằng cách tác động tới sự tương tác của tinh trùng với màng zona pellucida

của trứng Việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng giúp trứng lợn phát triển hoàn toàn sau khi IVF [41], [70], [47] Nhưng theo Tatemoto và cộng sự thì dịch nang trứng giữ vai trò quan trọng nhất đó là bảo vệ trứng khỏi các stress oxi hóa nhờ nó chứa enzyme superoxide dismutase (SOD) Enzyme này có hoạt tính quét dọn các gốc tự do, bảo vệ trứng khỏi các tác nhân oxy hóa gây nguy hiểm cho tế bào [62] Các tác nhân oxy hóa này có thể gây phá hỏng DNA trong trứng, ảnh hưởng tới lớp tế bào nang bao quanh gây ảnh hưởng không tốt tới quá trình trao đổi chất của trứng qua đó làm ức chế sự phát triển trứng, thậm chí là phá hủy tế bào trứng Cũng theo nghiên cứu của ông cho thấy hoạt tính SOD của dịch nang thu được từ các nang trứng có kích thước 2-6 mm

có mức hoạt tính SOD cao gấp 7, 2 lần so với trong huyết thanh bê, tuy nhiên huyết thanh bê đã được sản xuất hàng loạt từ nhiều năm nay và có giá trị thương mại rất lớn còn dịch nang trứng thì mới được tách chiết mang tính chất phục vụ tại chỗ vì việc tách chiết mất nhiều thời gian và nhân lực, khả năng nhiễm khuẩn lại cao hơn so với huyết thanh bê Tuy nhiên sử dụng dịch nang trứng có vẫn có

khả năng mang lại hiệu quả tạo phôi cao mà còn giảm chi phí tạo phôi

Vai trò của huyết thanh bê (FCS)

Huyết thanh bê là thành phần của huyết tương, thu được sau khi đông khô

Huyết thanh bê được thu từ máu tĩnh mạch của các bê tại các lò mổ hoặc bằng chích máu động mạch tim từ các thai sống, nó có màu sáng và hơi vàng Huyết thanh bê rất có ý nghĩa thương mại, được sử dụng từ nhiều năm nay và có chất lượng ổn định hơn dịch nang trứng Về cơ bản, huyết thanh bê có thành phần và vai trò tương tự với dịch nang trứng Nó không chỉ được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi trứng, nuôi phôi của động vật có vú mà còn được sử dụng trong

hệ thống nuôi cấy mô Huyết thanh bê là nguồn cung cấp protein cho trứng trong giai đoạn nuôi trứng thành thục Theo Schroeder và cộng sự (1990) trong huyết thanh bê chứa fetuin, nhóm glycoprotein này có khả năng ngăn cản sự xơ cứng của màng ZP trong quá trình nuôi trứng thành thục [52] Fetuin hoạt động thông qua việc ngăn cản sự hoạt động của emzyme proteolytic được hình thành từ việc giải phóng sớm các hạt vỏ Ngoài ra, tác dụng ngăn cản sự cứng màng zona của trứng cũng có ảnh hưởng tới sự thành thục tế bào chất của trứng trong quá trình thành thục [21]

1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng

1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng

Hoạt hoá tinh trùng là một quá trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạt các phản ứng sinh hoá và sinh lý phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tế bào trứng thành thục Người ta cho rằng các giai đoạn đầu tiên của hoạt hoá liên quan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh (Seminiferous Tubule), mào tinh (Epididymis), ống dẫn tinh (Vas Deference) và tinh thanh (Seminal Plasma) Trong khi di chuyển từ tinh hoàn qua mào tinh (Epididymis), tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục có khả năng thụ tinh và dự trữ ở đuôi dịch hoàn phụ đến khi được giải phóng ra trong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu [55]

1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro

Sự hoạt hóa tinh trùng là rất quan trọng, nó quyết định sự thành công của quá

trình thụ tinh in vitro Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này Để tạo điều

kiện cho quá trình thụ tinh thì tinh trùng phải đạt các yêu cầu về sự vận động, hoạt lực để có thể tới trứng tham gia phản ứng thể đỉnh, xâm nhập vào trứng, gắn kết và dung hợp với trứng Dựa trên các nghiên cứu về hoạt động của tinh trùng trong tự nhiên, các nhà khoa học đã đáp ứng các điều kiện cần thiết để tạo môi trường phù hợp cho tinh trùng hoạt động

Điều kiện pH: Giá trị pH sử dụng trong các kỹ thuật TTON đóng vai trò quan

trọng trong quá trình thụ tinh Ở lợn, Cheng (1985) đã nhận thấy tỷ lệ tinh trùng xâm nhập tế bào trứng cao (>89%) khi tinh trùng được hoạt hoá ở 370

C trong môi trường pH 7,8 trước khi được bổ sung vào môi trường thụ tinh có pH 7,4 ở nhiệt độ

390C [7] Trong nghiên cứu đó, người ta thấy rằng, pH tối ưu cho thụ tinh khác với

pH cho hoạt hoá tinh trùng Ở cừu, tác giả đã nhận thấy rằng pH tối ưu cho hoạt hoá tinh trùng cừu là 7,8 và cho thụ tinh là 7,4 ở bò, ngược lại, Lu và Gordon (1987) nhận thấy rằng pH tối ưu cho môi trường hoạt hoá là 7,4 và cho môi trường thụ tinh

là 7,8 [36]

Bổ sung Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng: Tinh trùng khi tiếp xúc

với Albumin huyết thanh bò (BSA) trong một dung dịch muối sinh lý phù hợp có thể hoạt hoá tinh trùng trong ống nghiệm do đó BSA đã được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi dùng trong thụ tinh ống nghiệm Ngoài ra albumin huyết thanh còn đóng một vai trò quan trọng trong việc loại bỏ cholesterol và kẽm khỏi tinh trùng bởi vì loại protein này được coi là có khả năng kết dính cả hai loại phân tử này Người ta tin rằng cholesterol, chất ổn định màng tế bào, được loại bỏ khỏi màng tinh thanh tinh trùng trong khi hoạt hoá; ion kẽm, cũng là chất ổn định màng tế bào cũng có thể loại bỏ trong các giai đoạn đầu của quá trình hoạt hoá

Fukui và cs (1983) đã kiểm tra nhiều kỹ thuật khác nhau dùng cho hoạt hoá tinh đông lạnh -giải đông và sau đó dùng những tinh trùng đó cho TTON [15] Họ nhận thấy rằng dịch nang trứng lợn (pFF) có tác dụng trong hoạt hoá tinh trùng

thụ tinh Khi màng tinh trùng thay đổi tính thấm, các ion Ca ++ ngoại bào đi qua màng vào trong nội bào, tới khi nồng độ Ca2+ nội bào đã tích lũy đủ tức là tinh trùng đã sẵn sàng để thụ tinh Canxi Ionophore, chủ yếu được các nhà nghiên cứu Nhật Bản sử dụng thành công, để vượt qua giai đoạn đầu của hoạt hoá tinh trùng bằng cách tăng trực tiếp lượng Ca ++ của tế bào và gây phản ứng thể đỉnh

1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng

Các phương pháp sàng lọc tinh trùng được tiến hành để chuẩn bị cho quá trình thụ tinh trong ống nghiệm Những kỹ thuật này có thể nâng cao chất lượng tinh trùng, loại bỏ tinh thanh và các mảnh vụn còn lại, đặc biệt nó loại bỏ hoàn toàn các chất bảo quản đông lạnh ra khỏi tinh trùng

Kỹ thuật bơi ngược dòng (Swim-up)

Kỹ thuật Swim-up thường liên quan đến việc giải đông tinh trùng và đưa chúng vào một thể tích môi trường thích hợp Môi trường này thường là môi trường không có canxi -tyrode/albumin/Na lactate/Na pyruvate (TALP) và được dùng cho

cả kỹ thuật Swim-up và tiếp theo là rửa tinh trùng Mẫu tinh trùng được để trong tủ nuôi ở nhiệt độ 390C từ 30 - 60 phút, trong thời gian đó những tinh trùng có hoạt lực tốt trong tinh dịch sẽ bơi lên phía trên môi trường TALP Mặc dầu kỹ thuật Swim-

up có thể cho kết quả mẫu tinh trùng có hoạt lực cao nhưng chúng cũng có những bất lợi vì số lượng tinh trùng bơi lên tương đối thấp, đó là điều quan tâm trong thực

tế khi sử dụng tinh cọng rạ rất đắt Tỷ lệ thụ tinh thường tăng từ 46% lên 59% và các mẫu tinh trùng từ kỹ thuật Swim-up cho thấy tinh trùng có hoạt lực cao Nhu cầu sử dụng kỹ thuật Swim-up có thể lớn hơn khi chất lượng tinh trùng và hoạt lực tinh trùng kém

Kỹ thuật lọc qua màng lọc thủy tinh

Trong những năm 1950, người ta đã chỉ ra rằng tinh dịch pha loãng, khi lọc qua một lớp hạt thủy tinh nhỏ, thì những tinh trùng chết bị màng lọc giữ lại, còn những con tinh trùng sống đi qua được Gần đây hơn, Daya và cs (1987) đã sử dụng cột hạt thủy tinh để tách tinh trùng ở người; họ nhận thấy kỹ thuật này có thể tin tưởng được và là một kỹ thuật có kết quả ổn định để tách các tinh trùng có hoạt lực

từ những tinh dịch có chất lượng kém [9] Kỹ thuật này có hiệu quả hơn nhiều so

với kỹ thuật Swim-up để thu được những tinh trùng có hoạt lực tốt

Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng BSA /Percoll

Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng Percoll, tinh trùng được tách bằng cách cân bằng, khi tỷ trọng tinh trùng tương đương với tỷ trọng của sự chênh lệch Người ta cho rằng những tinh trùng có hình thái nhân tốt dày đặc hơn so với những tinh trùng kém hơn và được lựa chọn ở phần tỷ trọng cao hơn của sự chênh lệch Percoll Utsumi và cs (1988) đã sử dụng 30% và 40% Percoll trong môi trường Tyrode cải tiến (m-Tyrode) làm phương pháp tách tinh trùng của họ [64] Sau đó utsumi và cs (1991) đã sử dụng môi trường 30% và 45% [65] Rosenkrans và cs (1993) đã sử dụng 90% và 45% sự chênh lệch tỷ trọng Percoll

để tách những tinh trùng có hoạt lực trong nghiên cứu của họ [50]

Sử dụng phương pháp ly tâm

Đây là phương pháp cơ bản nhất trong các phương pháp trên Phương pháp này sử dụng phù hợp khi số lượng tinh trùng lớn và chất lượng tinh trùng là khá tốt Cọng rạ chứa tinh trùng đông lạnh sau khi lấy ra khỏi bình bảo quản lạnh được hóa lỏng trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 37o

C Tinh trùng được pha loãng trong trong môi trường rửa tinh trùng và ly tâm Sau khi ly tâm, những tinh trùng khỏe sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm tạo khối kết tủa, phần không cần thiết sẽ hòa tan trong dịch nổi bên tên Việc ly tâm giúp loại bỏ hoàn toàn các chất bảo vệ

1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm

1.6.1 Sự thụ tinh

Thụ tinh là quá trình kết hợp hai giao tử đực và cái Quá trình này đi kèm với sự khôi phục cơ cấu di truyền lưỡng bội và hoạt hóa trứng cho sự phát triển tiếp sau Kết quả của quá trình thụ tinh là tạo nên một tế bào lưỡng bội gọi là hợp

tử [3] Thụ tinh là quá trình rất phức tạp và phải trải qua ít nhất 5 bước: Tinh trùng gắn với lớp màng trong suốt của trứng; Tinh trùng diễn ra phản ứng thể cực; Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt; Tinh trùng gắn với lớp bào tương của trứng; Cuối cùng là sự hợp màng giữa trứng và tinh trùng và hình thành tiền nhân Sự xâm nhập của tinh trùng hoạt hóa tế bào trứng, dẫn tới các biến đổi lí hóa phức tạp trong tế bào trứng để chuẩn bị cho các bước phát triển tiếp theo [61]

1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm

Chuẩn bị tinh trùng: Một số nghiên cứu cho thấy tinh thanh ngăn cản sự kiện toàn năng lực thụ tinh và chứa một số chất ức chế hoạt động tinh trùng nên phải loại bỏ tinh thanh trước khi thụ tinh Trong trường hợp sử dụng tinh đông lạnh thì tinh trùng đã được làm sạch và bảo quản trong môi trường bảo quản lạnh Trước khi tiến hành cần giải đông cọng tinh và đưa tinh trùng vào môi trường hoạt hóa

Trong môi trường hoạt hóa cần bổ sung huyết thanh thai bê hoặc albumin huyết thanh bê để lấy bớt cholesterol từ màng tinh trùng làm tăng tính linh hoạt của tinh trùng Sử dụng huyết thanh mang lại hiệu quả tốt hơn vì nó còn chứa các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin

Nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thụ tinh là 38,5o

C Trứng chỉ được thụ tinh khi đã thành thục cả về nhân và tế bào chất Thời gian thành thục của trứng trong

môi trường nuôi in vitro vào khoảng 38-44 giờ Do đó, thời điểm thụ tinh thích hợp

nhất là 44h sau khi trứng được nuôi thành thục và đã hình thành thể cực đầu tiên

Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng: Các tinh trùng sau khi hoạt hóa sẽ có khả năng thụ tinh in vitro cho các trứng trong vòng 2,5 giờ sau khi xâm nhập vào tế bào trứng [42] Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duy trì khả năng thụ tinh như tỷ lệ về khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn 50% sau 2 giờ được bổ sung vào môi trường chứa tế bào trứng [39]

Mật độ tinh trùng: Trong số các tinh trùng đem đi thụ tinh, ta không thể xác định được tỷ lệ các tinh trùng thực sự được hoạt hóa là bao nhiêu, do đó trong quá trình thụ tinh cần phải sử dụng lượng tinh trùng rất lớn Điều này dẫn tới xác suất xảy ra hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng tăng, ngoài ra còn có thể ảnh hưởng không tốt tới sự hình thành và phát triển phôi

Xác tinh trùng còn lại sau thụ tinh: Sự hiện diện xác tinh trùng trong môi trường sau khi thụ tinh ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của phôi [66] Sau khi thụ tinh cần chuyển tế bào trứng sang môi trường khác để tránh tác động oxy hóa của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng lên phôi

1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm

Trong suốt quá trình tạo phôi lợn in vitro, trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Khi nhiều tinh trùng cùng vào trứng, sẽ cùng tham gia vào quá trình dung hợp nhân và kết quả là hình thành lên các thể lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm làm cho hợp tử tạo

ra không thể phát triển bình thường [67] Phôi với những tế bào chứa nhân đa bội có thể phát triển bình thường tới một giai đoạn nhất định sẽ thoái hóa và chết dần [5] Do đó hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng sẽ làm giảm tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi tạo ra Phản ứng vỏ và màng noãn hoàng có tác dụng ngăn cản hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng xảy ra ở lợn với tần số cao hơn các loài khác rất nhiều Các nhà khoa học đã nghiên cứu rất nhiều phương pháp khác nhau để giải quyết vấn đề này như bổ xung vào môi

tinh thì sẽ làm giảm khả năng xâm nhập của tinh trùng kéo theo nó là làm giảm

tỷ lệ thụ tinh chung Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung vào việc nghiên cứu điều khiển sự liên kết của tinh trùng với màng sáng của trứng trong quá trình thụ tinh nhằm hạn chế sự xâm nhập của nhiều tinh trùng vào một trứng làm giảm hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng [67] Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tinh tại thời điểm thụ tinh, chất lượng trứng mang thụ tinh và môi trường thụ tinh [32], [59], [26]

1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm

1.7.1 Quá trình phát triển phôi

Sau khi hoàn thành quá trình thụ tinh, trứng trở thành một tế bào lưỡng bội được gọi là hợp tử, đây là giai đoạn sớm nhất phôi Chỉ vài phút sau khi nhân nguyên đực và nhân nguyên cái kết hợp với nhau là phôi bắt đầu phân chia, sự phân chia liên tiếp của phôi gọi là sự phân cắt Phôi phân chia tạo 2, 4, 6, 8, 16 tế bào, các

tế bào này được gọi là các phôi bào (blastomere) Giai đoạn này sự phân chia diễn

ra không ngừng, kích thước tế bào liên tục nhỏ đi và kết hợp lại thành một khối tế bào gọi là phôi dâu (morula) Sự phân chia kết thúc khi hình thành nên phôi nang (blastocyst) Trong phôi nang đã có sự biệt hóa tạo ra hai loại tế bào là tế bào thuộc

lá nuôi phôi (trophectoderm) và các tế bào thuộc nút phôi (inner cells mass) Đặc điểm hình thái ứng với giai đoạn phát triển của phôi được biểu diễn trong Bảng 1

Số tế bào tăng rất nhanh trong quá trình biệt hóa ở giai đoạn phôi nang sớm Thường thì số tế bào trong ICM vào khoảng 12-16 tế bào, sau đó sẽ giảm dần ở giai đoạn phôi nang giãn nở và thoát màng [44] Còn các tế bào thuộc lá nuôi phôi vẫn tiếp tục phân chia và khi đạt tới giai đoạn phôi nang giãn nở sẽ hình thành cấu trúc dạng ống [45], [16] Đặc biệt, trong điều kiện tự nhiên ở lợn tỷ lệ chết ở giai đoạn phôi là rất cao (22-41%) [45], [44]

Bảng 1 Các giai đoạn phát triển sớm của phôi lợn

Phôi nang sớm Trong giai đoạn từ khi hình thành xoang phôi bào

đến khi xoang chiếm một nửa thể tích phôi, phôi nang được gọi là phôi nang sớm Từ thời điểm này đến khi tế bào lấp đầy toàn bộ khoảng trống

6

Phôi nang dãn nở

ở giai đoạn này, xoang giãn nở và màng sáng giảm độ dày Phôi đôi khi thoát khỏi màng trong suốt ở đầu giai đoạn này

1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh

Trong lịch sử nghiên cứu, phôi tạo ra trong phòng thí nghiệm được chuyển vào bộ phận sinh sản của con nhận nuôi phôi khác Prather và cộng sự (1991) đã đưa phôi lợn giai đoạn sớm vào đoạn thắt ống dẫn cừu kết quả thu được 83% phôi phát triển tới giai đoạn phôi nang [14] Tuy nhiên, khi nuôi phôi trong ống dẫn trứng thỏ thì tỷ lệ lại không cao [19] Phôi lợn có thể phát triển tốt trong ống dẫn trứng chuột, tuy nhiên phải là chuột trưởng thành vì ống dẫn trứng chuột chưa trưởng thành không đủ điều kiện để phôi vượt qua giai đoạn 4 tế bào [13]

Sau nhiều nghiên cứu các nhà khoa học đã tạo ra một số môi trường nuôi phôi xác định chứa các thành phần cần thiết đảm bảo cho sự phát triển của phôi giống như điều kiện trong tử cung con cái Có rất nhiều môi trường khác nhau như môi trường Whitten cải tiến (mWM), môi trường NCSU -23 (North Carolina State University), môi trường ISU (Iowa) và môi trường Beltsville 3 (BECM-3) , môi trường NCSU -37 (North Carolina State University) [60]

Về cơ bản môi trường nuôi phôi cũng giống với môi trường nuôi trứng nhưng không bổ sung hormone và hàm lượng huyết thanh cao hơn để đảm bảo

sự phân chia của phôi Môi trường nuôi phôi được bổ sung các yếu tố bảo vệ áp

suất thẩm thấu như taurineV, hypotaurine hoặc sobitol Trong môi trường nuôi phôi, glucose là nguồn cơ chất năng lượng ngoại bào cung cấp cho sự phát triển của phôi Nhu cầu dinh dưỡng của phôi lợn phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng Từ giai đoạn một tế bào đến giai đoạn phôi dâu chặt, chúng có thể phát triển trong một dung dịch muối đơn giản Tuy nhiên, từ giai đoạn phôi nang đến giai đoạn phôi nang dãn nở, huyết thanh, axit amin, và các chất khác đóng một vai trò quan trọng đến sự phát triển của phôi, do đó nhu cầu dinh dưỡng cao hơn một khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang

1.8 Cất giữ lạnh phôi

Bảo quản lạnh phôi là quá trình chuyển phôi từ trạng thái sinh lý bình thường (trong cơ thể mẹ hoặc ngoài cơ thể mẹ ở nhiệt độ 370C) sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh để cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu –1960

C Phôi đông lạnh vẫn có thể sống, phát triển bình thường sau giải đông và đem cấy cho con cái nhận phôi động dục đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác Các chất bảo vệ lạnh và cơ chế cất giữ lạnh phôi

Các chất bảo vệ lạnh

Những chất bảo vệ lạnh được dùng phổ biến bao gồm glycerol, dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol (ethylene glycol, propylene glycol….) nhưng được dùng phổ biến nhất là glycerol Glycerol có tính độc nhẹ,

có tác dụng như một chất chống đông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol vào bên trong

tế bào thay thế các phân tử nước làm cho tế bào không bị giảm dung tích Ở bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên nước đóng băng ở dạng nhỏ nên ngăn cản được sự phá vỡ màng tế bào Vì vậy mà glycerol giữ được sự ổn định về nồng độ của các chất hoà tan, không làm thay đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình

Cơ chế tác động

Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước được tạo thành trước tiên

ở môi trường bên ngoài tế bào, làm nồng độ chất hòa tan tăng nên nước sẽ đi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức độ mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh, tốc độ này phải ở trên tốc độ giới hạn Trong môi trường huyền phù, nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào Như vậy, sự hiện diện của tinh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của

tế bào Theo Mazur (1977), khi nhiệt độ hạ xuống -50

C, tế bào và môi trường xung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và vì sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh [37] Tinh thể nước sẽ hình thành bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -50

C đến -150C nhưng các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ lạnh chưa tạo đá

Hình 8: Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội

bào và ngoại bào

Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào thể hiện qua Hình 8 Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất