Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2010 MỤC LỤC Trang DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Error! Bookmark not defined MỤC LỤC _ MỤC LỤC HÌNH _ Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN _ 1.1 Buồng trứng tạo trứng _ 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng 1.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng 1.2 Cấu tạo hoạt động ống dẫn trứng 14 1.3 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng _ 16 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng _ 16 1.3.2 Quá trình sinh tinh 17 1.4 Sự thành thục tế bào trứng ống nghiệm (IVM) vai trò môi trƣờng _ 18 1.4.1 Sự thành thục tế bào trứng _ 19 1.4.2 Vai trò tế bào nang _ 20 1.4.3 Vai trò việc bổ sung dịch nang trứng FCS môi trường nuôi thành thục trứng 21 1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _ 23 1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng _ 23 1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 24 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng 25 1.6 Thụ tinh ống nghiệm _ 27 1.6.1 Sự thụ tinh 27 1.6.2 Quá trình thụ tinh ống nghiệm 27 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng thụ tinh ống nghiệm 28 1.7 Nuôi phôi ống nghiệm _ 29 1.7.1 Quá trình phát triển phôi 29 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh 31 1.8 Cất giữ lạnh phôi 32 1.9 Giải đông phôi Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 2.2.1 Thiết bị _ 2.2.2 Hóa chất 2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao 35 36 36 36 36 36 37 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu _ 2.3.1 Phương pháp thu bảo quản buồng trứng từ lò mổ 2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng _ 2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng _ 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu 2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro 2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng 2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 2.3.8 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm _ 2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử ống nghiệm 2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi _ 2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi 2.3.12 Phương pháp giải đông phôi nuôi cấy phôi sau giải đông _ 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu _ 38 38 38 39 39 40 40 41 41 42 43 43 45 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _ 3.1 Kết thu buồng trứng tế bào trứng 3.2 Kết đánh giá, phân loại trứng trƣớc nuôi cấy in vitro _ 3.3 Kết nuôi trứng thành thục 3.4 Kết thụ tinh tạo phôi 3.4.1 Kết thụ tinh trứng sau nuôi in vitro 3.4.2 Kết tạo phôi từ trứng sau nuôi thụ tinh in vitro 47 47 49 52 55 55 56 3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 59 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh _ 59 3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 60 3.6 Kết thu dịch nang trứng 63 KẾT LUẬN _ 65 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO _ 64 MỞ ĐẦU Trong suốt trình phát triển, loài người khai phá thiên nhiên, hóa chọn lọc nhiều loại động vật, giữ lại giống loài tốt, có lợi cho loại thải giống không hiệu Trong loài động vật hóa, lợn loài động vật gắn bó với người từ thuở hoang sơ tận Điều nói lên cần thiết vai trò to lớn lợn đời sống người Vai trò phải kể đến lợn nguồn thực phẩm cần thiết, có giá trị dinh dưỡng cao cho người Theo Harris cs (1956) 100g thịt lợn nạc có 367 Kcal 22 g protein [18] Trong xã hội đại, lợn đóng vai trò vô quan trọng nghiên cứu khoa học Theo nhà nghiên cứu giải phẫu mô học cấu tạo phôi thai lợn người có tương đồng lớn [3] Do nhà nghiên cứu sử dụng phôi thai lợn để tiến hành nghiên cứu cấu tạo, phát triển chế hoạt động phôi thai người Còn theo nhà dinh dưỡng học nhu cầu dinh dưỡng tỷ lệ chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển lợn gần với người Vì mà lợn sử dụng làm đối tượng để tiến hành thí nghiệm dinh dưỡng cho người Cùng với phát triển khoa học lợn giữ nhiều vai trò quan trọng việc phục vụ sức khỏe người Các nhà nghiên cứu sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật, thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn máy sinh học để tạo nguồn dược liệu quí Đặc biệt y học, nhà khoa học tạo mô hình lợn nhiều loại bệnh khác người cách đưa gen gây bệnh người vào hệ gen lợn Mặt khác, cách này, nhà khoa học cố gắng tạo cho phận để chuyển lợn chuyển gen người với khả tương đồng cao mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép quan cho người bệnh Kỹ thuật tạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn kỹ thuật bắt buộc cần có để điều trở thành thực Vì lý mà việc nghiên cứu phôi tạo phôi lợn in vitro nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới Xét phương diện công nghệ sinh học chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu chăn nuôi cách tạo số lượng phôi lớn có chất lượng tốt khả sống cao Ngoài ra, trứng sau nuôi thành thục phục vụ cho nhiều nghiên cứu khác như: ICSI, cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn giống quí hiếm, cá thể giống tốt ngân hàng gen [42], [43], [71] So với việc tạo phôi lợn phương pháp in vivo việc tạo phôi lợn phương pháp in vitro có số ưu điểm vượt trội Đó phương pháp giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ thí nghiệm sử dụng buồng trứng thu từ lò mổ với số lượng lớn Cùng với đó, số lượng trứng thu đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm nhiều chi phí để tạo phôi phương pháp giảm đáng kể Ngoài ra, trước thực tế số giống lợn quí nước ta nằm trước nguy tuyệt chủng nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học giống lợn cần thiết Viện Chăn nuôi thực bảo tồn phương pháp in situ phương pháp tốn không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn phôi đông lạnh Với mục đích trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn phương pháp thụ tinh ống nghiệm” đặt ba nội dung để giải là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất lượng phôi lợn cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro đông lạnh ni tơ lỏng TỔNG QUAN Chƣơng 1.1 Buồng trứng tạo trứng 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng Buồng trứng quan tạo giao tử (noãn bào - tế bào trứng) động vật nói chung gia súc nói riêng Không giống tinh hoàn, buồng trứng nằm xoang bụng, sau thận, đỉnh trước khung xương chậu Buồng trứng gồm buồng trứng bên trái buồng trứng bên phải Chức buồng trứng là: tạo tế bào trứng sản xuất hormone sinh dục [33] Buồng trứng tạo trứng thành thục theo tần suất định Ở lợn, chu kỳ rụng trứng tạo khoảng 10-20 tế bào trứng Tế bào trứng nằm nang trứng Các hormone buồng trứng tiết estrogen progesterone Estrogen tiết từ nang trứng progesterone tiết từ thể vàng, hai hormone thuộc nhóm hormone steroid Estrogen có chức năng: kích thích phát triển quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục chịu đực; kích thích phát triển tuyến vú; kích thích đặc tính sinh dục lợn nái Progesterone có vai trò quan trọng việc chuẩn bị tử cung phôi làm tổ; ngăn cản thành thục tế bào trứng khác trình mang thai; trì có chửa kết hợp với estrogen chất khác để kích thích phát triển tuyến vú Buồng trứng gồm có miền, miền tủy bên miền vỏ bên Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh mô liên kết Miền vỏ gồm tế bào lớp mô có nhiệm vụ tạo tế bào trứng hormone Lớp miền vỏ buồng trứng biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt lớp tế bào lập phương bao phủ toàn bề mặt buồng trứng Ngay bên biểu mô bề mặt lớp mỏng, dày đặc mô liên kết, gọi áo trắng buồng trứng Phía áo trắng buồng trứng nhu mô, coi lớp chức chứa nang trứng tế bào phân tiết hormone buồng trứng Người ta cho tất nang nguyên thủy (primordial follice) hình thành trước con vật sinh Số lượng lớn tìm thấy bào thai lợn từ ngày 50-90 sau thụ thai Nang nguyên thủy tế bào sinh dục bao quanh lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô Chúng nằm nhu mô thường quan sát theo nhóm gọi ổ trứng (egg nest) [55] Hình 1: Sơ đồ phát triển nang trứng Trong buồng trứng cá thể thành thục thường xuyên có nang trứng trạng thái phát triển thành thục Giải phẫu miền vỏ gia súc có hoạt động sinh sản cho thấy giai đoạn thành thục (Hình 1) Ngoài nang trứng nguyên thủy có nang trứng sơ cấp hay gọi nang bậc Đây nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật Sau giai đoạn nang sơ cấp tăng sinh tế bào hạt bao quanh tế bào trứng có khả phát triển Khi số lượng tế bào hạt tăng thành thành nhiều lớp nang trứng giai đoạn gọi nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong trình phát triển, tế bào hạt nang thứ cấp tiết dịch, đẩy chúng tách rời hình thành xoang nang bào Các xoang nhỏ lớn dần phát triển trứng sau kết hợp làm Khi xoang hình thành nang gọi nang bậc III (tertiary follicle) hay gọi nang có hốc Nang bậc III thành thục quan sát thấy chứa đầy dịch lên bề mặt buồng trứng gọi nang Graaf Dịch nang bậc III gọi dịch nang trứng Đây dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid Nhiều hormone sinh sản khác yếu tố hormone giúp điều hoà chức buồng trứng tìm thấy dịch nang trứng Hình 2: Cấu tạo bên nang Graaf Có nhiều lớp tế bào nang Graaf coi có chức quan trọng (Hình 2) Bao Graaf thường có kích thước lớn, lợn đường kính bao Graaf trước vỡ vào khoảng 8-12 mm, đội màng trắng biểu mô phủ buồng trứng lồi hẳn lên mặt buồng trứng Bao Graaf xoang chứa dịch với nhiều enzym, hormon, AMP vòng phân tử khác, nang bào bị đẩy ngoại vi, hình thành lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh gọi vành phóng xạ bao quanh trứng trứng rụng trứng di chuyển ống dẫn trứng Khối gồm noãn bào vành phóng xạ lúc bị đẩy phía xoang nối với thành nang dải vài lớp tế bào gọi cuống mang trứng, đặc điểm tạo thuận lợi cho tách noãn khỏi thành nang trứng Màng sáng lúc dày rõ Noãn bào cực đại có kích thước nhỏ so với nang trứng (khoảng 150 m so với 15-20mm) Nhân noãn bào lớn gọi bóng phôi, nằm noãn bào hay lệch phía sát với màng tế bào Vỏ nang trứng gồm lớp rõ dày Trước trứng rụng vài giờ, nhân noãn bào di chuyển tới sát màng nhân tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm kết thúc trước trứng rụng Kết lần phân chia từ noãn bào cho tế bào đơn bội (n kép) đồng số nhiễm sắc thể lại không chia tế bào chất Một tế bào chiếm gần toàn tế bào chất trở thành noãn bào có tác dụng sinh dục Một tế bào nhỏ có tế bào chất tác dụng sinh dục gọi thể cực Cả hai tế bào nằm bên màng sáng Quá trình biến đổi nang trứng làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng 500 lần, kích thước noãn bào tăng lên không nhiều nang trứng, người tăng từ 10m nang nguyên thuỷ lên 80m bao Graaf Dấu hiệu trước rụng trứng xuất vùng màu nhạt cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng ngừng lưu thông máu cho mao mạch nằm lớp vỏ nang trứng chín Ở vùng này, lớp biểu mô phủ buồng trứng, lớp màng trắng buồng trứng vỏ nang trứng gián đoạn để lộ lớp vỏ Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào với vòng tia tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ngoài, đồng thời dịch nang trứng hốc nang trứng trào Hiện tượng gọi rụng trứng Phần nang trứng lại gọi thể vàng (hoàng thể) Tuỳ thuộc trứng có làm tổ niêm mạc tử cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang tiêu giảm biến [29] 1.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng Cấu tạo tế bào trứng Trứng lợn có hình cầu, đường kính trứng chín không kể màng sáng dao động khoảng 120-170 μm (Hình 3) Trứng loại tế bào có kích thước lớn môi trường bổ sung dịch nang trứng Mức độ giãn nở không giãn nở (mức 0) trứng nuôi môi trường bổ sung dịch nang trứng lại chiếm 35,7% mức độ trứng nuôi môi trường bổ sung 10% dịch nang trứng 20,6% Kết chung cho thấy sai khác có ý nghĩa thống kê (64,3% 79,4%, p