Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2010 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Nguyễn Mộng Hùng nguyên Trưởng phòng Công nghệ tế bào Động vật – Trung tâm nghiên cứu khoa học sống – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy người thu nhận hướng dẫn tôi bắt đầu tiến hành luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lai Thành, Chủ nhiệm môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy người trực tiếp hướng dẫn suốt khóa học Thầy tận tình bảo giúp đỡ nhiều thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đào Đức Thà Ths Nguyễn Thị Thoa, Ths Lưu Ngọc Anh đồng nghiệp phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Việt Quỳnh em Phòng Công nghệ Tế bào Động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội đặc biệt thầy cô giáo môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh truyền đạt cho kiến thức suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Cuối muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình tôi, người ủng hộ nguồn động viên lớn lao giúp hoàn thành khóa học Hà Nội tháng 11/2010 Học viên Nguyễn Thị Hương Nguyễn Thị Hương i Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AMP: Adenosine monophosphate BSA: Bovine serum albumin ( Albumin huyết bò) DMSO: Demethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic) eCG: equine chorionic gonadotropin (Huyết thai ngựa) FCS: Fetal calf serum (Huyết bê) FSH: Follicle stimulating hormone (Hóc môn kích thích nang trứng) GV: Germinal vesicle (Túi mầm) hCG: Human chorionic gonadotropin (Chorionic gonadotropin người) ICM: Inner cells mass ( Nút phôi) ICSI: Intracytoplasmic sperm injection IVF: In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm) IVM: In vitro maturation (Nuôi thành thục ống nghiệm) IVC: In vitro culture (Nuôi cấy ống nghiệm) LH: Luteinizing hormone (hóc môn gây rụng trứng) NCSU: North Carolina State University PBS: Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm phot phat) PFF: Porcine follicular fluid (Dịch nang trứng lợn) SOD: Superoxide dismutase TTON: Thụ tinh ống nghiệm ZP: Zona pellucida (Màng sáng) TCN: Tiêu chuẩn nuôi Nguyễn Thị Hương ii Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học MỤC LỤC Trang DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT _ ii MỤC LỤC _ iii MỤC LỤC HÌNH v MỞ ĐẦU _ Chương TỔNG QUAN 1.1 Buồng trứng tạo trứng _ 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng 1.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng 1.2 Cấu tạo hoạt động ống dẫn trứng 11 1.3 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng _ 13 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng 13 1.3.2 Quá trình sinh tinh 14 1.4 Sự thành thục tế bào trứng ống nghiệm (IVM) vai trò môi trường 15 1.4.1 Sự thành thục tế bào trứng _ 16 1.4.2 Vai trò tế bào nang 17 1.4.3 Vai trò việc bổ sung dịch nang trứng FCS môi trường nuôi thành thục trứng 18 1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _ 20 1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng _ 20 1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 21 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng 22 1.6 Thụ tinh ống nghiệm _ 24 1.6.1 Sự thụ tinh 24 1.6.2 Quá trình thụ tinh ống nghiệm 24 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng thụ tinh ống nghiệm 25 1.7 Nuôi phôi ống nghiệm 26 1.7.1 Quá trình phát triển phôi _ 26 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh 28 1.8 Cất giữ lạnh phôi _ 29 1.9 Giải đông phôi _ 32 Nguyễn Thị Hương iii Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng _ 33 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất _ 33 2.2.1 Thiết bị 33 2.2.2 Hóa chất _ 33 2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu _ 35 2.3.1 Phương pháp thu bảo quản buồng trứng từ lò mổ 35 2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng 35 2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng 36 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu 36 2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro 37 2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng 37 2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro _ 38 2.3.8 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm _ 38 2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử ống nghiệm 39 2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi _ 40 2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi 40 2.3.12 Phương pháp giải đông phôi nuôi cấy phôi sau giải đông _ 42 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu _ 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _ 44 3.1 Kết thu buồng trứng tế bào trứng 44 3.2 Kết đánh giá, phân loại trứng trước nuôi cấy in vitro _ 46 3.3 Kết nuôi trứng thành thục 49 3.4 Kết thụ tinh tạo phôi 52 3.4.1 Kết thụ tinh trứng sau nuôi in vitro 52 3.4.2 Kết tạo phôi từ trứng sau nuôi thụ tinh in vitro 53 3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 56 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh _ 56 3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 57 3.6 Kết thu dịch nang trứng 60 KẾT LUẬN 62 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO _ 64 Nguyễn Thị Hương iv Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 1: Sơ đồ phát triển nang trứng Hình 2: Cấu tạo bên nang Graaf Hình Tế bào trứng lợn thành thục Hình Quá trình hình thành giao tử Hình Cấu tạo ống dẫn trứng 11 Hình Sơ đồ trình hình thành giao tử đực 14 Hình Trứng trình thành thục nhân 16 Hình 8: Mối liên hệ tốc độ làm lạnh hình thành tinh thể đá nội bào ngoại bào 30 Hình Mô hình cọng rạ sử dụng để cất giữ phôi đông lạnh 41 Hình 10 Chương trình chạy máy đông lạnh phôi lợn 42 Hình 11: Các bước giải đông phôi 43 Hình 12: Tiến hành thu trứng dịch nang trứng 44 Hình 13: Hình ảnh phân loại trứng trước nuôi in vitro 47 Hình 14: Trứng sau nuôi in vitro 51 Hình 15: Hình ảnh phôi lợn thời điểm thu hoạch phôi sau nuôi 54 Hình 16: Hình ảnh phôi phân loại trước đông lạnh 57 Hình 17: Hình ảnh phôi sau giải đông 58 Nguyễn Thị Hương v Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học MỞ ĐẦU Trong suốt trình phát triển, loài người khai phá thiên nhiên, hóa chọn lọc nhiều loại động vật, giữ lại giống loài tốt, có lợi cho loại thải giống không hiệu Trong loài động vật hóa, lợn loài động vật gắn bó với người từ thuở hoang sơ tận Điều nói lên cần thiết vai trò to lớn lợn đời sống người Vai trò phải kể đến lợn nguồn thực phẩm cần thiết, có giá trị dinh dưỡng cao cho người Theo Harris cs (1956) 100g thịt lợn nạc có 367 Kcal 22 g protein [18] Trong xã hội đại, lợn đóng vai trò vô quan trọng nghiên cứu khoa học Theo nhà nghiên cứu giải phẫu mô học cấu tạo phôi thai lợn người có tương đồng lớn [3] Do nhà nghiên cứu sử dụng phôi thai lợn để tiến hành nghiên cứu cấu tạo, phát triển chế hoạt động phôi thai người Còn theo nhà dinh dưỡng học nhu cầu dinh dưỡng tỷ lệ chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển lợn gần với người Vì mà lợn sử dụng làm đối tượng để tiến hành thí nghiệm dinh dưỡng cho người Cùng với phát triển khoa học lợn giữ nhiều vai trò quan trọng việc phục vụ sức khỏe người Các nhà nghiên cứu sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật, thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn máy sinh học để tạo nguồn dược liệu quí Đặc biệt y học, nhà khoa học tạo mô hình lợn nhiều loại bệnh khác người cách đưa gen gây bệnh người vào hệ gen lợn Mặt khác, cách này, nhà khoa học cố gắng tạo cho phận để chuyển lợn chuyển gen người với khả tương đồng cao mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép quan cho người bệnh Kỹ thuật tạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn kỹ thuật bắt buộc cần có để Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học điều trở thành thực Vì lý mà việc nghiên cứu phôi tạo phôi lợn in vitro nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới Xét phương diện công nghệ sinh học chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu chăn nuôi cách tạo số lượng phôi lớn có chất lượng tốt khả sống cao Ngoài ra, trứng sau nuôi thành thục phục vụ cho nhiều nghiên cứu khác như: ICSI, cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn giống quí hiếm, cá thể giống tốt ngân hàng gen [42], [43], [71] So với việc tạo phôi lợn phương pháp in vivo việc tạo phôi lợn phương pháp in vitro có số ưu điểm vượt trội Đó phương pháp giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ thí nghiệm sử dụng buồng trứng thu từ lò mổ với số lượng lớn Cùng với đó, số lượng trứng thu đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm nhiều chi phí để tạo phôi phương pháp giảm đáng kể Ngoài ra, trước thực tế số giống lợn quí nước ta nằm trước nguy tuyệt chủng nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học giống lợn cần thiết Viện Chăn nuôi thực bảo tồn phương pháp in situ phương pháp tốn không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn phôi đông lạnh Với mục đích trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn phương pháp thụ tinh ống nghiệm” đặt ba nội dung để giải là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất lượng phôi lợn cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro đông lạnh ni tơ lỏng Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học TỔNG QUAN Chương 1.1 Buồng trứng tạo trứng 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng Buồng trứng quan tạo giao tử (noãn bào - tế bào trứng) động vật nói chung gia súc nói riêng Không giống tinh hoàn, buồng trứng nằm xoang bụng, sau thận, đỉnh trước khung xương chậu Buồng trứng gồm buồng trứng bên trái buồng trứng bên phải Chức buồng trứng là: tạo tế bào trứng sản xuất hormone sinh dục [33] Buồng trứng tạo trứng thành thục theo tần suất định Ở lợn, chu kỳ rụng trứng tạo khoảng 10-20 tế bào trứng Tế bào trứng nằm nang trứng Các hormone buồng trứng tiết estrogen progesterone Estrogen tiết từ nang trứng progesterone tiết từ thể vàng, hai hormone thuộc nhóm hormone steroid Estrogen có chức năng: kích thích phát triển quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục chịu đực; kích thích phát triển tuyến vú; kích thích đặc tính sinh dục lợn nái Progesterone có vai trò quan trọng việc chuẩn bị tử cung phôi làm tổ; ngăn cản thành thục tế bào trứng khác trình mang thai; trì có chửa kết hợp với estrogen chất khác để kích thích phát triển tuyến vú Buồng trứng gồm có miền, miền tủy bên miền vỏ bên Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh mô liên kết Miền vỏ gồm tế bào lớp mô có nhiệm vụ tạo tế bào trứng hormone Lớp miền vỏ buồng trứng biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt lớp tế bào lập phương bao phủ toàn bề mặt buồng trứng Ngay bên biểu mô bề mặt lớp mỏng, dày đặc mô liên kết, gọi áo trắng buồng trứng Phía áo trắng buồng trứng nhu mô, coi lớp chức chứa nang trứng tế bào phân tiết hormone buồng trứng Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Người ta cho tất nang nguyên thủy (primordial follice) hình thành trước con vật sinh Số lượng lớn tìm thấy bào thai lợn từ ngày 50-90 sau thụ thai Nang nguyên thủy tế bào sinh dục bao quanh lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô Chúng nằm nhu mô thường quan sát theo nhóm gọi ổ trứng (egg nest) [55] Hình 1: Sơ đồ phát triển nang trứng Trong buồng trứng cá thể thành thục thường xuyên có nang trứng trạng thái phát triển thành thục Giải phẫu miền vỏ gia súc có hoạt động sinh sản cho thấy giai đoạn thành thục (Hình 1) Ngoài nang trứng nguyên thủy có nang trứng sơ cấp hay gọi nang bậc Đây nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật Sau giai đoạn nang sơ cấp tăng sinh tế bào hạt bao quanh tế bào trứng có khả phát triển Khi số lượng tế bào hạt tăng thành thành nhiều lớp nang trứng giai đoạn gọi nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong trình phát triển, tế bào hạt nang thứ cấp tiết dịch, đẩy chúng tách rời hình thành xoang Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học nang bào Các xoang nhỏ lớn dần phát triển trứng sau kết hợp làm Khi xoang hình thành nang gọi nang bậc III (tertiary follicle) hay gọi nang có hốc Nang bậc III thành thục quan sát thấy chứa đầy dịch lên bề mặt buồng trứng gọi nang Graaf Dịch nang bậc III gọi dịch nang trứng Đây dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid Nhiều hormone sinh sản khác yếu tố hormone giúp điều hoà chức buồng trứng tìm thấy dịch nang trứng Hình 2: Cấu tạo bên nang Graaf Có nhiều lớp tế bào nang Graaf coi có chức quan trọng (Hình 2) Bao Graaf thường có kích thước lớn, lợn đường kính bao Graaf trước vỡ vào khoảng 8-12 mm, đội màng trắng biểu mô phủ buồng trứng lồi hẳn lên mặt buồng trứng Bao Graaf xoang chứa dịch với nhiều enzym, hormon, AMP vòng phân tử khác, nang bào bị đẩy ngoại vi, hình thành lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh gọi vành phóng xạ bao quanh trứng trứng rụng trứng di chuyển ống dẫn trứng Khối gồm noãn bào vành phóng xạ lúc bị đẩy phía xoang nối với thành nang dải vài lớp tế bào gọi cuống mang trứng, đặc điểm Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học tạo thuận lợi cho tách noãn khỏi thành nang trứng Màng sáng lúc dày rõ Noãn bào cực đại có kích thước nhỏ so với nang trứng (khoảng 150 m so với 15-20mm) Nhân noãn bào lớn gọi bóng phôi, nằm noãn bào hay lệch phía sát với màng tế bào Vỏ nang trứng gồm lớp rõ dày Trước trứng rụng vài giờ, nhân noãn bào di chuyển tới sát màng nhân tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm kết thúc trước trứng rụng Kết lần phân chia từ noãn bào cho tế bào đơn bội (n kép) đồng số nhiễm sắc thể lại không chia tế bào chất Một tế bào chiếm gần toàn tế bào chất trở thành noãn bào có tác dụng sinh dục Một tế bào nhỏ có tế bào chất tác dụng sinh dục gọi thể cực Cả hai tế bào nằm bên màng sáng Quá trình biến đổi nang trứng làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng 500 lần, kích thước noãn bào tăng lên không nhiều nang trứng, người tăng từ 10m nang nguyên thuỷ lên 80m bao Graaf Dấu hiệu trước rụng trứng xuất vùng màu nhạt cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng ngừng lưu thông máu cho mao mạch nằm lớp vỏ nang trứng chín Ở vùng này, lớp biểu mô phủ buồng trứng, lớp màng trắng buồng trứng vỏ nang trứng gián đoạn để lộ lớp vỏ Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào với vòng tia tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ngoài, đồng thời dịch nang trứng hốc nang trứng trào Hiện tượng gọi rụng trứng Phần nang trứng lại gọi thể vàng (hoàng thể) Tuỳ thuộc trứng có làm tổ niêm mạc tử cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang tiêu giảm biến [29] 1.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng Cấu tạo tế bào trứng Trứng lợn có hình cầu, đường kính trứng chín không kể màng sáng dao động khoảng 120-170 μm (Hình 3) Trứng loại tế bào có kích thước lớn Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học thể, biệt hóa cao độ có khả kết hợp với tinh trùng để hình thành hợp tử Hợp tử phát triển thành thể Hình Tế bào trứng lợn thành thục Lớp vỏ tế bào trứng lợn gọi màng sáng, tế bào trứng tạo nên Màng sáng dạng chuyên hoá cao khuôn ngoại bào (glicocalix) tế bào trứng, mở rộng glycoprotein màng từ màng sinh chất Nó bao trực tiếp quanh màng bào tương Lớp dày, bảo vệ trứng khỏi tác động học có hại Nó có tính đặc hiệu loài ngăn cản không cho tinh trùng khác loài xâm nhập Ở nhiều loài động vật, màng trứng thứ thường có vi lỗ xuyên qua gọi noãn khổng (micropile) Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác tuỳ loài, cực trên, cực nơi trứng dính vào buồng trứng Xuyên qua màng sáng có chồi tế bào chất xuất phát từ nang bào để tăng cường mối liên kết trao đổi chất với tế bào trứng Ở động vật có vú có tế bào nang bao quanh trứng gọi vành phóng xạ có chức nuôi dưỡng trứng thời gian trứng giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua lớp tế bào thụ tinh cho trứng Bên tế bào chất có lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5m), màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn lớp tế bào chất bên gọi lớp vỏ Trong lớp chứa nhiều phân tử actin dạng cầu, trình thụ tinh, phân tử trùng hợp lại hình thành sợi actin dài Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học gọi vi sợi (microfilament) cần thiết cho trình phân bào tạo vi lông nhung bề mặt trứng giúp cho tinh trùng xâm nhập vào trứng Lớp có nhiều hạt vỏ bao bọc màng sinh chất có cấu trúc tương đồng với thể đỉnh (cũng tạo từ phức hệ Golgi) có chứa nhiều enzym Trong hạt vỏ chứa phân tử mucopolisaccarit, loại glycoprotein dính phân tử hyalin Các enzym mucoprotein hoạt hoá để ngăn không cho tinh trùng khác chui vào sau có tinh trùng xâm nhập vào trứng [29] Sự hình thành tế bào trứng Sự hình thành thành thục (chín) giao tử phải hoàn thành đực trước trình sinh sản bắt đầu Sự hình thành thành thục giao tử bắt đầu trước gia súc sinh Quá trình biểu diễn qua Hình Tế bào trứng gọi noãn nguyên bào (oogonium) Noãn nguyên bào xuất từ phần kéo dài túi noãn hoàng (yolk sac), hình thành từ hậu tràng phôi (hindgut of embryo) Sau hình thành, noãn nguyên bào tăng sinh phân chia nguyên nhiễm xảy nhu mô buồng trứng trình hình thành phôi Sự tăng sinh dừng lại trước gia súc sinh ra, buồng trứng gia súc thời điểm sinh có số lượng noãn bào (oocyte) định có khả phát triển Noãn bào bước vào tiền kỳ phân bào giảm nhiễm thứ thời kỳ bào thai với phân bào giảm nhiễm bị dừng lại cuối tiền kỳ sau sinh Noãn bào trạng thái dừng phân chia gọi dictyate oocyte Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Hình Quá trình hình thành giao tử Ở giai đoạn sau sinh lúc trưởng thành (sau gia súc thành thục giới tính), phát triển thành thục tế bào trứng thường xảy theo chu kỳ Tuy nhiên, trước gia súc thành thục tính tế bào trứng chín hoàn toàn Những tế bào trứng bắt đầu phát triển trước sau thành thục tính bị thoái hoá khả phát triển Người ta ước tính 1% tế bào trứng đạt đến giai đoạn thành thục giải phóng lúc rụng trứng Sự phát triển thành thục tế bào trứng tiếp tục theo chu kỳ sau thành thục tính Trong sóng noãn nang phát triển chu kỳ động dục, số tế bào trứng với nang trứng nguyên thủy bắt đầu phát triển thành thục, tế bào trứng khác trạng thái dừng phát triển Tuy Nguyễn Thị Hương Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học nhiên, giai đoạn thể vàng thoái hoá, tế bào trứng nang trội đạt đến thành thục giải phóng thông qua rụng trứng vào đường sinh dục (ống dẫn trứng) để thụ tinh.Ở bò, cừu, dê ngựa thường có tế bào trứng chín rụng lợn có khoảng 10-25 tế bào trứng thành thục giải phóng lúc rụng trứng Tiếp sau giai đoạn nghỉ phân bào giảm nhiễm, thành thục phục hồi với phát triển tế bào trứng hình thành màng suốt bao quanh tế bào trứng Sự phát triển tế bào trứng thường với phát triển nang trứng FSH kích thích tăng sinh tế bào hạt bao quanh tế bào trứng, với phát triển nang sơ cấp thành nang thứ cấp Sự kích thích tiếp tục FSH làm cho tế bào hạt tiếp tục tăng sinh hình thành xoang Trong giai đoạn phát triển này, nang trứng hay tế bào trứng đạt tới khả rụng trứng trở thành nang trội Khi nang trội nang có xoang khác tiết đủ oestrogen, có đợt LH tăng lên trước rụng trứng Nồng độ LH cao xâm nhập vào dịch nang trứng giải phóng tế bào trứng thoát khỏi trạng thái dừng phát triển Sau đó, trình phân bào giảm nhiễm I tiếp tục hoàn thành việc hình thành thể cực thứ Sản phẩm phân bào giảm nhiễm thứ tế bào trứng thứ cấp thể cực thứ nằm màng tế bào chất màng suốt Với phân chia này, số nhiễm sắc thể tế bào trứng thay đổi từ trạng thái nhị bội (2n) xuống đơn bội (n) Tế bào trứng thứ cấp giữ lại toàn nguyên sinh chất nửa vật chất nhân (nhiễm sắc thể) tế bào trứng nguyên thuỷ Một nửa vật chất nhân khác đẩy thành thể cực thứ Sự phân bào giảm nhiễm thứ hoàn thành trước rụng trứng bò, lợn, cừu sau rụng trứng ngựa Sự phân bào giảm nhiễm lần thứ II (giảm nhiễm II) bắt đầu sau hoàn thành phân chia lần thứ Sự phân chia dừng trung kỳ II Sự dừng phân bào giảm nhiễm lần II giải phóng phân bào giảm nhiễm II bắt đầu trở lại trình thụ tinh Với trình thụ tinh, sản phẩm phân Nguyễn Thị Hương 10 Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học bào giảm nhiễm II hợp tử (trứng thụ tinh) thể cực thứ Tế bào trứng thực không tồn bò, lợn, cừu hay ngựa, mà dạng chuyển tiếp Tế bào trứng thực sản phẩm phân chia thành thục thứ gphân chia hoàn thành trước thụ tinh 1.2 Cấu tạo hoạt động ống dẫn trứng Ống dẫn trứng (hay gọi ống fallop) cặp ống xoắn kéo dài từ buồng trứng xuốn chóp sừng tử cung Chức chúng vận chuyển tinh trùng tế bào trứng Ngoài ra, ống dẫn trứng nơi xảy trình thụ tinh phân chia hợp tử giai đoạn đầu Về mô học, ống dẫn trứng gồm lớp tế bào khác biệt Lớp cùng, chủ yếu mô liên kết, màng mạc Lớp giữa, gồm sợi vòng dọc, gọi áo Lớp cùng, gồm có tế bào biểu mô phân tiết gọi áo niêm mạc Lớp Nếp niêm mạc Mạch máu Hình Cấu tạo ống dẫn trứng Ống dẫn trứng ống (Hình 5) chia thành vùng chức năng: phần hình phễu gần buồng trứng gọi vùng vân mao giúp thu trứng rụng trứng Có nhiều nếp gấp niêm mạc phần hình phễu, hầu hết tế bào niêm mạc có lông chuyển (cilia) Phần phình ống đoạn giữa, có chiều dài nửa ống dẫn trứng có đường kính 3-5mm Niêm mạc phần phình ống có 20-40 nếp Nguyễn Thị Hương 11 Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học gấp dọc, điều giúp tăng diện tích bề mặt phần phình ống Đa số tế bào niêm mạc phần phình ống lông chuyển, có số tế bào phân tiết có mặt Tác động lông chuyển hỗ trợ cho di chuyển tế bào trứng xuống phía phình ống Phần phình ống nối với phần eo ống chỗ nối phình ống eo ống Vị trí khó phân biệt giải phẫu mô tả cấu trúc sinh lý mà tế bào trứng giữ lại thời gian lúc di chuyển Sự thụ tinh xảy chỗ tiếp giáp Phần eo ống thường nhỏ phần phình ống, có đường kính từ 0,5-1mm Nó phân biệt lớp trơn dày so với phần phình ống có - nếp gấp niêm mạc Tỷ lệ tế bào phân tiết cao tế bào lông chuyển phần eo ống Phần eo ống liên quan tới việc vận chuyển tinh trùng có hoạt lực tới vị trí thụ tinh loại bỏ tinh trùng chết Eo ống nối với đầu sừng tử cung Nhìn chung, ống dẫn trứng co bóp kích thích oestrogen bị ức chế progesterone Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp môi trường phù hợp cho di chuyển chín muồi giao tử, thụ tinh phát triển phôi giai đoạn đầu Nhiều nghiên cứu tiến hành để nhận biết sản phẩm ống dẫn trứng tiết ra, từ giúp cho việc phát triển môi trường phù hợp để nuôi phôi Môi trường ống dẫn trứng tạo đóng vai trò quan trọng việc thúc đẩy thụ tinh phát triển phôi giai đoạn đầu Phân tích sinh hoá dịch ống dẫn trứng giúp nhận biết thành phần phù hợp cho môi trường nuôi phôi giai đoạn đầu in-vitro Rõ ràng mối quan hệ phôi - ống dẫn trứng đặc biệt quan trọng hệ thống nuôi ống nghiệm nhận biết mối quan hệ thành công việc nuôi phôi ống nghiệm Dựa hiểu biết tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta tổng hợp nên môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh ống nghiệm [55] Nguyễn Thị Hương 12 Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 1.3 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng Tinh trùng hình thành từ ống sinh tinh tinh hoàn Tinh trùng có kích thước nhỏ trứng nhiều lần (50-60 μm), có cấu tạo phù hợp với chức vận chuyển Tinh trùng mang gen đơn bội gọi giao tử đực Cấu tạo chung tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần (phần cổ) phần đuôi Phần đầu: Đầu tinh trùng lợn có hình lê dẹp, dài μm, rộng μm dẹp μm Đầu chứa hai phận nhân thể đỉnh Nhân tinh trùng chứa nhiễm sắc thể trạng thái đậm đặc thể tích nhỏ, chiếm 65% thể tích phần đầu Thể đỉnh bao kín dẹp lại thành mũ đội lên nhần đầu nhân Thể đỉnh hình thành từ thể golgi Thể đỉnh chứa emzyme thủy phân nhiều proteaza nhằm giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng trình thụ tinh Phần cổ: Sau đầu có phần ngắn, eo lại gọi cổ Trong tế bào chất phần cổ chứa hai trung thể, nằm sát nhân nằm xa nhân Phần đuôi: Chia làm ba đoạn: đoạn giữa, đoạn đoạn cuối Đoạn nằm sau cổ, có thiết diện lớn phần đuôi, gồm có sợi trục tế bào chất bao quanh Trong tế bào chất chứa nhiều ty thể, ty thể xếp theo hình xoắn ốc xung quanh sợi trục đuôi Đây gọi trạm lượng tinh trùng phục vụ mục đích sản sinh nhiều lượng cho tinh trùng hoạt động trình thụ tinh Đoạn chính: có cấu trúc tương tự đoạn giữa, phần dài đuôi có vai trò ổn định yếu tố co rút đuôi Đoạn cuối: đoạn ngắn nhất, gồm sợi trục màng bao quanh, phần chịu trách nhiệm cho chuyển động Nguyễn Thị Hương 13 Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 1.3.2 Quá trình sinh tinh Tinh trùng phát sinh tuyến sinh dục đực hay gọi tinh hoàn Quá trình sinh tinh biểu diễn Hình Hình Sơ đồ trình hình thành giao tử đực Các tinh nguyên bào thường nằm sát màng đáy, có kích thước 10 μm thường có nhân tròn elip Tinh nguyên bào hệ cuối chuyển sang giai đoạn tăng trưởng, lớn lên gọi tinh bào Các tinh bào giai đoạn tiền kỳ giảm phân Kết thúc giảm phân 1, tinh bào phân chia tạo hai tế bào nhỏ gọi tinh bào Ngay lập tức, tinh bào phân chia thành hai tinh tử Để trở thành tinh trùng, tinh tử phải trải qua loạt trình biến đổi phức tạp gồm: biến đổi trung thể, biến đổi nhân hình thành thể đỉnh [1] Biến đổi trung thể: kỳ cuối giảm phân 2, trung thể tách làm hai hạt nhỏ di chuyển phía sau, trung thể gần nằm hố lõm màng nhân, trung thể xa phát sợi trục Sợi trục mọc dài kéo theo biến đổi khác tinh tử Nguyễn Thị Hương 14 Cao học K16 Sinh học [...]... cho môi trường nuôi phôi ở giai đoạn đầu in-vitro Rõ ràng là mối quan hệ giữa phôi - ống dẫn trứng đặc biệt quan trọng và những hệ thống nuôi trong ống nghiệm nào nhận biết được mối quan hệ này đều thành công trong việc nuôi phôi trong ống nghiệm Dựa trên sự hiểu biết về tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta đã tổng hợp nên các môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm [55] Nguyễn... Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn Tinh trùng có kích thước nhỏ hơn trứng rất nhiều lần (50-60 μm), nó có cấu tạo phù hợp với chức năng vận chuyển Tinh trùng mang bộ gen đơn bội và được gọi là giao tử đực Cấu tạo chung của tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần... của các giao tử, thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết những sản phẩm do ống dẫn trứng tiết ra, từ đó có thể giúp cho việc phát triển các môi trường phù hợp để nuôi phôi Môi trường do ống dẫn trứng tạo ra đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu Phân tích sinh hoá dịch ống dẫn trứng có... là hỗ trợ cho sự di chuyển của tế bào trứng xuống phía phình ống Phần phình ống nối với phần eo ống ở chỗ nối phình ống eo ống Vị trí này rất khó phân biệt bằng giải phẫu và được mô tả là một cấu trúc sinh lý mà ở đó tế bào trứng được giữ lại một thời gian trong lúc di chuyển Sự thụ tinh xảy ra ở chỗ tiếp giáp này Phần eo ống thường nhỏ hơn phần phình ống, nó có đường kính từ 0,5-1mm Nó còn được phân... gphân chia được hoàn thành trước khi thụ tinh 1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng Ống dẫn trứng (hay còn gọi là ống fallop) là một cặp ống xoắn kéo dài từ buồng trứng xuốn chóp sừng tử cung Chức năng của chúng là vận chuyển tinh trùng và tế bào trứng Ngoài ra, ống dẫn trứng còn là nơi xảy ra quá trình thụ tinh và phân chia của hợp tử ở giai đoạn đầu Về mô học, ống dẫn trứng gồm 3 lớp tế bào khác... dưỡng trứng trong thời gian trứng đã giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua được các lớp tế bào này mới thụ tinh được cho trứng Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5m), ngay dưới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bên trong gọi là lớp vỏ Trong lớp này cũng chứa nhiều phân tử actin dạng cầu, trong quá trình thụ tinh, các phân... trơn dày hơn so với phần phình ống và có 4 - 8 nếp gấp niêm mạc Tỷ lệ tế bào phân tiết cao hơn tế bào lông chuyển ở phần eo ống Phần eo ống liên quan tới việc vận chuyển tinh trùng có hoạt lực tới vị trí thụ tinh và loại bỏ những tinh trùng đã chết Eo ống nối với đầu sừng tử cung Nhìn chung, ống dẫn trứng co bóp do kích thích của oestrogen và bị ức chế bởi progesterone Ống dẫn trứng động vật có vú cung... Quá trình sinh tinh Tinh trùng được phát sinh trong tuyến sinh dục đực hay còn gọi là tinh hoàn Quá trình sinh tinh được biểu diễn trong Hình 6 Hình 6 Sơ đồ quá trình hình thành giao tử đực Các tinh nguyên bào thường nằm sát màng đáy, có kích thước 10 μm và thường có nhân tròn hoặc elip Tinh nguyên bào thế hệ cuối cùng chuyển sang giai đoạn tăng trưởng, lớn lên gọi là tinh bào 1 Các tinh bào 1 đang... II bắt đầu trở lại trong quá trình thụ tinh Với quá trình thụ tinh, sản phẩm của phân Nguyễn Thị Hương 10 Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học bào giảm nhiễm II là hợp tử (trứng đã được thụ tinh) và thể cực thứ 2 Tế bào trứng thực sự không bao giờ tồn tại ở bò, lợn, cừu hay ngựa, mà chỉ ở dạng chuyển tiếp Tế bào trứng thực sự có thể là sản phẩm của sự phân chia thành thục thứ 2 nếu sự... thành thục và được giải phóng ra thông qua sự rụng trứng vào đường sinh dục (ống dẫn trứng) để thụ tinh. Ở bò, cừu, dê và ngựa thường chỉ có 1 tế bào trứng chín rụng trong khi đó ở lợn có khoảng 10-25 tế bào trứng có thể thành thục và được giải phóng ra lúc rụng trứng Tiếp sau giai đoạn nghỉ phân bào giảm nhiễm, sự thành thục được phục hồi cùng với sự phát triển của tế bào trứng và sự hình thành màng trong