Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm

Với những mục đích như trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” của chúng tôi đặt ra ba nội dung để giải quyết là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Lai Thành

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠNĐầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Nguyễn Mộng Hùng nguyên Trưởng phòng Công nghệ tế bào Động vật – Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy là người đầu tiên đã thu nhận và hướng dẫn tôi khi tôi bắt đầu tiến hành luận văn cao học này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lai Thành, Chủ nhiệm

bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy là người trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt khóa học Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn cao học này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đào Đức Thà và Ths Nguyễn Thị Thoa, Ths Lưu Ngọc Anh cùng các đồng nghiệp phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Việt Quỳnh cùng các

em Phòng Công nghệ Tế bào Động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội và đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình tôi, những người đã luôn ủng hộ và là nguồn động viên lớn lao giúp tôi có thể hoàn thành khóa học này.

Hà Nội tháng 11/2010

Học viên Nguyễn Thị Hương

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AMP: Adenosine monophosphate

BSA: Bovine serum albumin ( Albumin huyết thanh bò)

DMSO: Demethyl sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic)

eCG: equine chorionic gonadotropin (Huyết thanh thai ngựa)

FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh bê)

FSH: Follicle stimulating hormone (Hóc môn kích thích nang trứng)GV: Germinal vesicle (Túi mầm)

hCG: Human chorionic gonadotropin (Chorionic gonadotropin người)ICM: Inner cells mass ( Nút phôi)

ICSI: Intracytoplasmic sperm injection

IVF: In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm)

IVM: In vitro maturation (Nuôi thành thục trong ống nghiệm)

IVC: In vitro culture (Nuôi cấy ống nghiệm)

LH: Luteinizing hormone (hóc môn gây rụng trứng)

NCSU: North Carolina State University

PBS: Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm phot phat)

PFF: Porcine follicular fluid (Dịch nang trứng lợn)

SOD: Superoxide dismutase

TTON: Thụ tinh trong ống nghiệm

ZP: Zona pellucida (Màng sáng)

TCN: Tiêu chuẩn nuôi

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC HÌNH iv

MỞ ĐẦU 1

2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng _3 1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng 3

1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng 6

1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng 11 1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng _13 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng 13

1.3.2 Quá trình sinh tinh 14

1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường 15 1.4.1 Sự thành thục của tế bào trứng 16

1.4.2 Vai trò của tế bào nang 17

1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành thục trứng 18

1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _20 1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng 20

1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro 21

1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng 22

1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm 24 1.6.1 Sự thụ tinh 24

1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm 24

1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm 25

1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm _26 1.7.1 Quá trình phát triển phôi 26

1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh 28

1.8 Cất giữ lạnh phôi 29 1.9 Giải đông phôi 32 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng 33 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 33 2.2.1 Thiết bị 33

2.2.2 Hóa chất 33

2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu _35 2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản buồng trứng từ lò mổ 35

2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng 36

2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu được 36

2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro 37

2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng 37

2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro 38

Tinh trùng chúng tôi sử dụng cho quá trình thụ tinh là tinh đông lạnh trong cọng rạ và bảo quản lạnh trong nitơ lỏng Sau khi lấy tinh ra khỏi bình bảo quản lạnh, để cân bằng ngoài không khí 10 giây sau đó đưa vào bể ổn nhiệt 37oC trong 20 giây. 38 Cho tinh trùng vào một ống vô trùng chứa M199 pH 7,8 sau đó ly tâm 2000 vòng/phút trong 2 phút. 38 Sau khi ly tâm xong, hút bỏ phần dịch nổi bên trên và hòa tan đều phần cặn trong 1ml M199 pH 7,8 trộn đều bằng cách dùng pipet vô trùng hút đẩy nhẹ nhàng. 38 Sau khi đã pha loãng chuyển tinh trùng vào đĩa vô trùng sau đó phủ dầu khoáng và ủ trong tủ nuôi cấy ở điều kiện 38,5oC, độ ẩm 95% và 5% CO2 để chuẩn bị cho thụ tinh. _38 2.3.8 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm 38

2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử trong ống nghiệm 39

2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi 40

2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi 40

2.3.12 Phương pháp giải đông phôi và nuôi cấy phôi sau giải đông 42

2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu 43

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả thu buồng trứng và tế bào trứng 44 3.2 Kết quả đánh giá, phân loại trứng trước khi nuôi cấy in vitro _46 3.3 Kết quả nuôi trứng thành thục 49 3.4 Kết quả thụ tinh và tạo phôi _52 3.4.1 Kết quả thụ tinh của trứng sau khi nuôi in vitro 52

3.4.2 Kết quả tạo phôi từ trứng sau khi nuôi và thụ tinh in vitro 53

3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 56 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh 56

3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 57

3.6 Kết quả thu dịch nang trứng 60 KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

MỤC LỤC HÌNH

Trang

MỞ ĐẦU

Trong suốt quá trình phát triển, loài người đã khai phá thiên nhiên, thuầnhóa và chọn lọc rất nhiều loại động vật, giữ lại những giống loài tốt, có lợi chomình và loại thải những giống không hiệu quả Trong các loài động vật đượcthuần hóa, lợn là loài động vật gắn bó với con người từ thuở hoang sơ cho tới tậnbây giờ Điều này đã nói lên sự cần thiết và vai trò to lớn của lợn trong đời sốngcon người Vai trò đầu tiên phải kể đến của lợn đó là nguồn thực phẩm cần thiết,

có giá trị dinh dưỡng cao cho con người Theo Harris và cs (1956) thì cứ 100gthịt lợn nạc có 367 Kcal và 22 g protein [18] Trong xã hội hiện đại, lợn cònđóng vai trò vô cùng quan trọng trong nghiên cứu khoa học Theo các nhànghiên cứu giải phẫu và mô học thì cấu tạo phôi thai của lợn và người có sựtương đồng rất lớn [3] Do đó các nhà nghiên cứu đã sử dụng phôi thai lợn đểtiến hành nghiên cứu về cấu tạo, sự phát triển và các cơ chế hoạt động của phôithai người Còn theo các nhà dinh dưỡng học thì nhu cầu dinh dưỡng và tỷ lệ cácchất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của lợn rất gần với con người Vì vậy

mà lợn đã được sử dụng làm đối tượng để tiến hành các thí nghiệm về dinhdưỡng cho con người Cùng với sự phát triển của khoa học thì lợn càng giữnhiều vai trò quan trọng trong việc phục vụ sức khỏe con người Các nhà nghiêncứu đã sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật,thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn như một bộ máy sinh học để tạo ranguồn dược liệu quí

Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tạo ra mô hình trên lợn nhiều loạibệnh khác nhau của người bằng cách đưa gen gây bệnh của người vào hệ gen củalợn Mặt khác, cũng bằng cách này, các nhà khoa học còn cố gắng tạo ra cho các bộphận để chuyển những con lợn chuyển gen của người với khả năng tương đồng cao

về mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép các cơ quan cho người bệnh Kỹ thuậttạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn là những kỹ thuật bắt buộc cần có để

điều đó trở thành hiện thực Vì các lý do này mà việc nghiên cứu phôi và tạo phôi

lợn in vitro đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới

Xét trên phương diện công nghệ sinh học và chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn

in vitro là kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi bằng cách tạo

ra số lượng phôi lớn có chất lượng tốt và khả năng sống cao Ngoài ra, trứng sau khinuôi thành thục còn có thể phục vụ cho nhiều nghiên cứu cơ bản khác như: ICSI,cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn các giống quí hiếm, những cáthể giống tốt trong ngân hàng gen [42], [43], [71] So với việc tạo phôi lợn bằng

phương pháp in vivo thì việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vitro có một số ưu

điểm vượt trội Đó là phương pháp này giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ trong cácthí nghiệm vì có thể sử dụng các buồng trứng được thu từ các lò mổ với số lượng rấtlớn Cùng với đó, số lượng trứng thu được đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm cũngrất nhiều vì vậy chi phí để tạo phôi bằng phương pháp này sẽ giảm đi đáng kể

Ngoài ra, trước thực tế một số giống lợn quí hiếm của nước ta đang nằmtrước nguy cơ tuyệt chủng thì nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học các giống lợn là rất

cần thiết Viện Chăn nuôi đã thực hiện bảo tồn bằng phương pháp in situ nhưng

phương pháp này rất tốn kém không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợnbằng phôi đông lạnh

Với những mục đích như trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” của chúng tôi đặt ra ba nội dung để giải quyết là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất

lượng phôi lợn bằng cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi

thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro bằng đông lạnh

trong ni tơ lỏng

Chương 1. TỔNG QUAN1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng

1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng

Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vậtnói chung cũng như ở các gia súc nói riêng Không giống như tinh hoàn, buồngtrứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu.Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bênphải Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinhdục cái [33] Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định Ở lợn,mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi Tế bào trứng nằmtrong các nang trứng Các hormone được buồng trứng tiết ra là estrogen vàprogesterone Estrogen được tiết ra từ các nang trứng còn progesterone được tiết

ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid.Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tănghành vi liên quan đến động dục như chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyếnvú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái Progesterone có vai trò quan trọngtrong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tếbào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp vớiestrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến vú

Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài.Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền vỏ gồm các tế bào

và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone Lớp ngoài cùng củamiền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lậpphương bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng Ngay bên dưới biểu mô bề mặt

là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng Phía dưới

áo trắng buồng trứng là nhu mô, được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nangtrứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng

Người ta cho rằng tất cả nang nguyên thủy (primordial follice) được hìnhthành trước khi con con vật cái được sinh ra Số lượng lớn nhất được tìm thấy ởbào thai lợn từ ngày 50-90 sau khi thụ thai Nang nguyên thủy là một tế bào sinhdục được bao quanh bởi một lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô.Chúng nằm trong nhu mô và thường quan sát được theo nhóm gọi là ổ trứng(egg nest) [55]

Hình 1 : Sơ đồ sự phát triển của nang trứng

Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thường xuyên có các nang trứng ởtrạng thái phát triển và thành thục Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạtđộng sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1) Ngoài các nangtrứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1 Đây lànhững nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầubiến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật Sau giai đoạn nang sơ cấp là sựtăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển Khi sốlượng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này đượcgọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong quá trình phát triển, các

tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa

các nang bào Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kếthợp làm một Khi một xoang đã được hình thành thì nang đó được gọi là nang bậcIII (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc Nang bậc III thành thục khi quansát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và được gọi là nang Graaf.Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng Đây là một dịch nhớt giàuhormone sinh sản steroid Nhiều hormone sinh sản khác cũng như các yếu tố khôngphải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã được tìm thấy trongdịch nang trứng

Hình 2: Cấu tạo bên trong nang Graaf

Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng(Hình 2) Bao Graaf thường có kích thước rất lớn, ở lợn đường kính bao Graaftrước khi vỡ vào khoảng 8-12 mm, nó đội cả màng trắng và biểu mô phủ buồngtrứng lồi hẳn lên trên mặt buồng trứng Bao Graaf là một cái xoang chứa dịchvới rất nhiều enzym, hormon, AMP vòng và các phân tử khác, các nang bào bịđẩy ra ngoại vi, hình thành một lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt.Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh được gọi là vành phóng xạ sẽ baoquanh trứng khi trứng rụng và cả khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng Khốigồm noãn bào và vành phóng xạ lúc này bị đẩy về một phía của xoang và chỉ nốivới thành nang bởi một dải vài lớp tế bào gọi là cuống mang trứng, đặc điểm này

tạo thuận lợi cho sự tách noãn khỏi thành nang trứng Màng sáng lúc này đã rấtdày và rõ Noãn bào cực đại tuy có kích thước rất nhỏ so với nang trứng (khoảng

150 µm so với 15-20mm) Nhân noãn bào rất lớn còn gọi là bóng phôi, nó có thểnằm ở giữa noãn bào hay lệch về một phía hoặc sát với màng tế bào Vỏ nangtrứng gồm 2 lớp cũng rất rõ và dày Trước khi trứng rụng một vài giờ, nhân noãnbào di chuyển tới sát màng nhân và tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm và kếtthúc trước khi trứng rụng Kết quả của lần phân chia này là từ noãn bào 1 cho ra

2 tế bào con đơn bội (n kép) đồng đều về số nhiễm sắc thể nhưng lại không chiađều tế bào chất Một tế bào chiếm gần như toàn bộ tế bào chất trở thành noãnbào 2 có tác dụng sinh dục Một tế bào nhỏ chỉ có rất ít tế bào chất không có tácdụng sinh dục gọi là thể cực 1 Cả hai tế bào đều nằm bên trong màng sáng.Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng

500 lần, kích thước noãn bào cũng tăng lên nhưng không nhiều như nang trứng,

ở người nó tăng từ 10µm ở nang nguyên thuỷ lên 80µm ở bao Graaf

Dấu hiệu trước khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nangtrứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lưu thông máu cho các maomạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứng chín Ở vùng này, lớp biểu mô phủbuồng trứng, lớp màng trắng của buồng trứng và vỏ ngoài của nang trứng giánđoạn để lộ ra lớp vỏ trong Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào 2 cùng với vòng tiatách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ra ngoài, đồng thời dịch nang trứng trong hốcnang trứng trào ra ngoài Hiện tượng này gọi là sự rụng trứng Phần nang trứngcòn lại gọi là thể vàng (hoàng thể) Tuỳ thuộc trứng có làm tổ trong niêm mạc tửcung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang hoặc tiêugiảm và biến mất [29]

1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng

Cấu tạo tế bào trứng

Trứng lợn có hình cầu, đường kính của trứng chín không kể màng sáng daođộng trong khoảng 120-170 μm (Hình 3) Trứng là loại tế bào có kích thước lớn

nhất trong cơ thể, được biệt hóa cao độ và có khả năng kết hợp với tinh trùng đểhình thành hợp tử Hợp tử này sẽ phát triển thành một cơ thể mới.

Hình 3 Tế bào trứng lợn thành thục

Lớp vỏ tế bào trứng lợn được gọi là màng sáng, nó do chính tế bào trứng tạonên Màng sáng là dạng chuyên hoá cao của khuôn ngoại bào (glicocalix) của tế bàotrứng, là sự mở rộng các glycoprotein màng từ màng sinh chất Nó bao trực tiếpquanh màng bào tương Lớp này khá dày, nó bảo vệ trứng khỏi các tác động cơ học

có hại Nó còn có tính đặc hiệu loài và ngăn cản không cho các tinh trùng khác loàixâm nhập Ở nhiều loài động vật, màng trứng thứ nhất thường có những vi lỗ xuyênqua gọi là noãn khổng (micropile) Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác nhautuỳ loài, ở cực trên, cực dưới hoặc ở nơi trứng dính vào buồng trứng Xuyên quamàng sáng có các chồi tế bào chất xuất phát từ các nang bào để tăng cường mối liênkết và trao đổi chất với tế bào trứng Ở động vật có vú còn có các tế bào nang baoquanh trứng gọi là vành phóng xạ có chức năng nuôi dưỡng trứng trong thời giantrứng đã giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua được các lớp tế bàonày mới thụ tinh được cho trứng

Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5µm),ngay dưới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bêntrong gọi là lớp vỏ Trong lớp này cũng chứa nhiều phân tử actin dạng cầu, trongquá trình thụ tinh, các phân tử này sẽ trùng hợp lại hình thành những sợi actin dài

gọi là vi sợi (microfilament) rất cần thiết cho quá trình phân bào và tạo ra vi lôngnhung trên bề mặt trứng giúp cho tinh trùng xâm nhập vào trứng Lớp này còn córất nhiều hạt vỏ được bao bọc bởi màng sinh chất có cấu trúc tương đồng với thểđỉnh (cũng được tạo ra từ phức hệ Golgi) có chứa rất nhiều enzym Trong hạt vỏcòn chứa các phân tử mucopolisaccarit, là một loại glycoprotein dính và phân tửhyalin Các enzym và mucoprotein sẽ được hoạt hoá để ngăn không cho các tinhtrùng khác chui vào sau khi đã có một tinh trùng xâm nhập vào trứng [29].

Sự hình thành tế bào trứng

Sự hình thành và thành thục (chín) của giao tử phải hoàn thành ở cả conđực và con cái trước khi quá trình sinh sản bắt đầu Sự hình thành và thành thụcgiao tử cái bắt đầu trước khi gia súc được sinh ra Quá trình này được biểu diễnqua Hình 4 Tế bào trứng đầu tiên được gọi là noãn nguyên bào (oogonium).Noãn nguyên bào xuất hiện từ phần kéo dài của túi noãn hoàng (yolk sac), hìnhthành từ hậu tràng của phôi (hindgut of embryo) Sau khi hình thành, noãnnguyên bào tăng sinh bằng sự phân chia nguyên nhiễm xảy ra trong nhu mô củabuồng trứng đang trong quá trình hình thành ở phôi Sự tăng sinh này dừng lạitrước khi gia súc được sinh ra, do đó buồng trứng gia súc ở thời điểm sinh ra cómột số lượng noãn bào (oocyte) nhất định có khả năng phát triển Noãn bào bướcvào tiền kỳ phân bào giảm nhiễm thứ nhất ở thời kỳ bào thai và với phân bàogiảm nhiễm bị dừng lại ở cuối tiền kỳ ngay sau khi sinh Noãn bào ở trạng thái

dừng phân chia này được gọi dictyate oocyte.

Hình 4 Quá trình hình thành giao tử cái

Ở giai đoạn sau khi sinh ra và lúc trưởng thành (sau khi gia súc thành thụcgiới tính), sự phát triển và thành thục tế bào trứng thường xảy ra theo chu kỳ.Tuy nhiên, trước khi gia súc thành thục về tính không có tế bào trứng nào chínhoàn toàn Những tế bào trứng bắt đầu phát triển trước và sau khi thành thục vềtính bị thoái hoá và mất khả năng phát triển Người ta ước tính rằng dưới 1% tếbào trứng đạt đến giai đoạn thành thục và giải phóng ra lúc rụng trứng

Sự phát triển và thành thục của tế bào trứng sẽ tiếp tục theo chu kỳ sau khithành thục về tính Trong các sóng noãn nang phát triển trong mỗi chu kỳ độngdục, một số tế bào trứng cùng với nang trứng nguyên thủy bắt đầu phát triển vàthành thục, trong khi các tế bào trứng khác vẫn ở trạng thái dừng phát triển Tuy

nhiên, ở giai đoạn thể vàng thoái hoá, tế bào trứng ở các nang trội đạt đến sựthành thục và được giải phóng ra thông qua sự rụng trứng vào đường sinh dục(ống dẫn trứng) để thụ tinh.Ở bò, cừu, dê và ngựa thường chỉ có 1 tế bào trứngchín rụng trong khi đó ở lợn có khoảng 10-25 tế bào trứng có thể thành thục vàđược giải phóng ra lúc rụng trứng.

Tiếp sau giai đoạn nghỉ phân bào giảm nhiễm, sự thành thục được phụchồi cùng với sự phát triển của tế bào trứng và sự hình thành màng trong suốt baoquanh tế bào trứng Sự phát triển của tế bào trứng thường đi cùng với sự pháttriển của nang trứng FSH kích thích sự tăng sinh của tế bào hạt bao quanh tế bàotrứng, cùng với sự phát triển của nang sơ cấp thành nang thứ cấp Sự kích thíchtiếp tục của FSH làm cho tế bào hạt tiếp tục tăng sinh và hình thành xoang.Trong giai đoạn phát triển này, nang trứng hay tế bào trứng đã đạt tới khả năngrụng trứng trở thành nang trội Khi nang trội và các nang có xoang khác tiết đủoestrogen, có một đợt LH tăng lên trước rụng trứng Nồng độ LH cao đã xâmnhập vào dịch nang trứng và giải phóng tế bào trứng thoát khỏi trạng thái dừngphát triển Sau đó, quá trình phân bào giảm nhiễm I tiếp tục cho đến khi hoànthành việc hình thành thể cực thứ nhất Sản phẩm của phân bào giảm nhiễm thứnhất là tế bào trứng thứ cấp và thể cực thứ nhất nằm giữa màng tế bào chất vàmàng trong suốt Với sự phân chia này, số nhiễm sắc thể trong tế bào trứng thayđổi từ trạng thái nhị bội (2n) xuống đơn bội (n) Tế bào trứng thứ cấp giữ lại toàn

bộ nguyên sinh chất và một nửa vật chất nhân (nhiễm sắc thể) của tế bào trứngnguyên thuỷ Một nửa vật chất nhân khác được đẩy ra ngoài thành thể cực thứnhất Sự phân bào giảm nhiễm thứ nhất được hoàn thành ngay trước rụng trứng ở

bò, lợn, cừu và ngay sau khi rụng trứng ở ngựa

Sự phân bào giảm nhiễm lần thứ II (giảm nhiễm II) bắt đầu ngay sau khihoàn thành sự phân chia lần thứ nhất Sự phân chia này dừng ở trung kỳ II Sựdừng phân bào giảm nhiễm lần II sẽ được giải phóng và phân bào giảm nhiễm IIbắt đầu trở lại trong quá trình thụ tinh Với quá trình thụ tinh, sản phẩm của phân

bào giảm nhiễm II là hợp tử (trứng đã được thụ tinh) và thể cực thứ 2 Tế bàotrứng thực sự không bao giờ tồn tại ở bò, lợn, cừu hay ngựa, mà chỉ ở dạngchuyển tiếp Tế bào trứng thực sự có thể là sản phẩm của sự phân chia thành thụcthứ 2 nếu sự gphân chia được hoàn thành trước khi thụ tinh

1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng

Ống dẫn trứng (hay còn gọi là ống fallop) là một cặp ống xoắn kéo dài từbuồng trứng xuốn chóp sừng tử cung Chức năng của chúng là vận chuyển tinhtrùng và tế bào trứng Ngoài ra, ống dẫn trứng còn là nơi xảy ra quá trình thụ tinh

và phân chia của hợp tử ở giai đoạn đầu Về mô học, ống dẫn trứng gồm 3 lớp tếbào khác biệt nhau Lớp ngoài cùng, chủ yếu là mô liên kết, là màng thanh mạc.Lớp giữa, gồm cả các sợi cơ vòng và cơ dọc, gọi là áo cơ Lớp trong cùng, gồm

có các tế bào biểu mô phân tiết gọi là áo niêm mạc

Hình 5 Cấu tạo ống dẫn trứng

Ống dẫn trứng là một ống cơ (Hình 5) được chia thành 3 vùng chức năng:phần hình phễu ở gần buồng trứng còn gọi là vùng vân mao giúp thu trứng khi rụngtrứng Có nhiều nếp gấp trong niêm mạc phần hình phễu, và hầu hết các tế bào niêm

mạc có lông chuyển (cilia) Phần phình ống là đoạn giữa, có chiều dài bằng một nửa

ống dẫn trứng và có đường kính 3-5mm Niêm mạc phần phình ống có 20-40 nếp

Lớp cơ

Nếp niêm mạc

Mạch máu

gấp dọc, điều đó giúp tăng diện tích bề mặt của phần phình ống Đa số các tế bàoniêm mạc phần phình ống là lông chuyển, nhưng cũng có một số tế bào phân tiết cómặt ở đây Tác động của lông chuyển là hỗ trợ cho sự di chuyển của tế bào trứngxuống phía phình ống Phần phình ống nối với phần eo ống ở chỗ nối phình ống -

eo ống Vị trí này rất khó phân biệt bằng giải phẫu và được mô tả là một cấu trúcsinh lý mà ở đó tế bào trứng được giữ lại một thời gian trong lúc di chuyển Sự thụtinh xảy ra ở chỗ tiếp giáp này Phần eo ống thường nhỏ hơn phần phình ống, nó cóđường kính từ 0,5-1mm Nó còn được phân biệt bởi lớp cơ trơn dày hơn so vớiphần phình ống và có 4 - 8 nếp gấp niêm mạc Tỷ lệ tế bào phân tiết cao hơn tế bàolông chuyển ở phần eo ống Phần eo ống liên quan tới việc vận chuyển tinh trùng cóhoạt lực tới vị trí thụ tinh và loại bỏ những tinh trùng đã chết Eo ống nối với đầusừng tử cung Nhìn chung, ống dẫn trứng co bóp do kích thích của oestrogen và bị

ức chế bởi progesterone

Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp một môi trường phù hợp cho sự dichuyển và chín muồi của các giao tử, thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạnđầu Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết những sản phẩm do ống dẫntrứng tiết ra, từ đó có thể giúp cho việc phát triển các môi trường phù hợp để nuôiphôi Môi trường do ống dẫn trứng tạo ra đóng một vai trò quan trọng trong việcthúc đẩy thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu Phân tích sinh hoá dịchống dẫn trứng có thể giúp nhận biết được những thành phần phù hợp cho môi

trường nuôi phôi ở giai đoạn đầu in-vitro Rõ ràng là mối quan hệ giữa phôi - ống dẫn trứng đặc biệt quan trọng và những hệ thống nuôi trong ống nghiệm nào nhận

biết được mối quan hệ này đều thành công trong việc nuôi phôi trong ống nghiệm.Dựa trên sự hiểu biết về tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta đã tổng hợp nên

các môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm [55].

1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng

1.3.1 Cấu tạo tinh trùng

Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn Tinh trùng cókích thước nhỏ hơn trứng rất nhiều lần (50-60 μm), nó có cấu tạo phù hợp vớichức năng vận chuyển Tinh trùng mang bộ gen đơn bội và được gọi là giao tửđực Cấu tạo chung của tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần giữa (phần cổ)

và phần đuôi

Phần đầu: Đầu tinh trùng lợn có hình quả lê dẹp, dài 8 μm, rộng 4 μm vàdẹp 1 μm Đầu chứa hai bộ phận chính là nhân và thể đỉnh Nhân tinh trùng chứanhiễm sắc thể ở trạng thái đậm đặc trong một thể tích rất nhỏ, chiếm 65% thểtích phần đầu Thể đỉnh là một cái bao kín dẹp lại thành cái mũ đội lên nhần đầucủa nhân Thể đỉnh được hình thành từ thể golgi Thể đỉnh chứa các emzymethủy phân và nhiều proteaza nhằm giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng trong quátrình thụ tinh

Phần cổ: Sau đầu có một phần rất ngắn, hơi eo lại được gọi là cổ Trong tếbào chất phần cổ chứa hai trung thể, một nằm sát nhân và một nằm xa nhân

Phần đuôi: Chia làm ba đoạn: đoạn giữa, đoạn chính và đoạn cuối Đoạngiữa nằm ngay sau cổ, có thiết diện lớn nhất phần đuôi, gồm có sợi trục và tế bàochất bao quanh Trong tế bào chất chứa rất nhiều ty thể, các ty thể xếp theo hìnhxoắn ốc xung quanh sợi trục của đuôi Đây được gọi là trạm năng lượng của tinhtrùng phục vụ mục đích sản sinh nhiều năng lượng cho tinh trùng hoạt độngtrong quá trình thụ tinh

Đoạn chính: có cấu trúc tương tự đoạn giữa, và là phần dài nhất của đuôi

và có vai trò ổn định các yếu tố co rút của đuôi

Đoạn cuối: đây là đoạn ngắn nhất, chỉ gồm sợi trục và màng bao quanh,phần này chịu trách nhiệm cho sự chuyển động

1.3.2 Quá trình sinh tinh

Tinh trùng được phát sinh trong tuyến sinh dục đực hay còn gọi là tinhhoàn Quá trình sinh tinh được biểu diễn trong Hình 6

Hình 6 Sơ đồ quá trình hình thành giao tử đực

Các tinh nguyên bào thường nằm sát màng đáy, có kích thước 10 μm vàthường có nhân tròn hoặc elip Tinh nguyên bào thế hệ cuối cùng chuyển sang giaiđoạn tăng trưởng, lớn lên gọi là tinh bào 1 Các tinh bào 1 đang ở giai đoạn tiền kỳcủa giảm phân 1 Kết thúc giảm phân 1, tinh bào 1 phân chia tạo ra hai tế bào nhỏhơn gọi là tinh bào 2 Ngay lập tức, các tinh bào 2 phân chia thành hai tinh tử

Để trở thành tinh trùng, tinh tử phải trải qua một loạt quá trình biến đổiphức tạp gồm: biến đổi trung thể, biến đổi nhân và hình thành thể đỉnh [1]

Biến đổi trung thể: ở kỳ cuối giảm phân 2, trung thể tách ra làm hai hạt nhỏ

và di chuyển về phía sau, trung thể gần nằm trong hố lõm của màng nhân, trung thể

xa phát ra sợi trục Sợi trục mọc dài kéo theo các biến đổi khác của tinh tử

Sự biến đổi nhân: Nhân mất nước, nhỏ lại, trở nên đồng nhất và bắt màu đậm

Sự hình thành thể đỉnh: Trong tinh tử, hệ thống golgi gồm một hệ thốngcác bể chứa dẹp và nhiều không bào Các không bào lớn dần, trong chúng xuấthiện các thể đặc biệt gọi là hạt tiền thể đỉnh Các không bào này hợp thành mộtkhông bào duy nhất với một hạt thể đỉnh duy nhất Không bào ép sát vào phầnđầu của nhân, dẹp lại hình thành thể đỉnh

Cùng với sự bé đi của nhân và hình thành thể đỉnh, sợi trục mọc dài dần

và bào tương di chuyển theo trục về phía đuôi, ty thể tập trung vào phía đầu gầnnhân của sợi trục Khi tinh trùng hình thành có một giọt bào tương lớn gồm cóbào tương, một phần ty thể và phần còn lại của bộ máy golgi bám vào đuôi tinhtrùng Đây là cầu nối các tinh trùng non với nhau [1]

1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường

Sau khi đạt tới kích thước cực đại, noãn bào chuyển sang một giai đoạnmới là giai đoạn thành thục Giai đoạn thành thục diễn ra dưới sự điều khiển của

cơ chế thần kinh – hormone trong tương tác noãn bào với các tế bào xung quanh

Sự chuyển sang thời kỳ thành thục được thực hiện dưới ảnh hưởng của cáchormone kích dục tố của thùy trước tuyến yên Dưới tác động của kích dục tố,biểu mô nang sản sinh ra progesteron, chất này đi vào noãn bào và kích thích quátrình thành thục

từ khi tan biến túi mầm đến giai đoạn metaphase II là 19 giờ còn ở lợn là 38 giờ.

Do đó để nuôi thành thục trứng lợn đòi hỏi khoảng thời gian là 38-44 giờ

nhân

Màng sáng Túi mầm

Sự thành thục tế bào chất

Đồng thời với các diễn biến của nhân, tế bào chất cũng có nhiều biến đổi.Trứng trở nên mọng nước, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất

bề mặt trở nên có tính co giãn và xuất hiện khả năng phân chia Một trong những

sự kiện quan trọng đánh dấu sự thành thục của trứng là sự vỡ màng nhân Màngnhân bị vỡ dưới ảnh hưởng của tác nhân phá hủy màng nhân Tác nhân này xuấthiện trong noãn bào dưới ảnh hưởng của progesteron và không có sự tham giacủa nhân Sau khi vỡ màng nhân các tác nhân hội tụ nhiễm sắc thể, tác nhântrương nhân tinh trùng, tác nhân phân bào xuất hiện để chuẩn bị cho các yếu tốcần thiết cho quá trình thụ tinh, hình thành và phát triển phôi [1]

1.4.2 Vai trò của tế bào nang

Tế bào nang là những tế bào soma, xếp thành nhiều lớp bao quanh trứng.Các tế bào nang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự thành thục trứng, trongquá trình nuôi cùng trứng, các tế bào nang phát triển, và tăng sinh mạnh, chúngcung cấp một số yếu tố cần thiết cho quá trình ức chế giảm phân và thành thục tếbào chất của trứng qua đó nâng cao khả năng phát triển của trứng [61], [71] Một

số sản phẩm tiết của tế bào nang ảnh hưởng tới sự phát triển của trứng sau khithụ tinh, đó giống như một loại glutathione - một nhân tố quan trọng để hìnhthành tiền nhân đực ở trứng sau thụ tinh [61], [69] Các sản phẩm tiết này có thểtăng tỷ lệ với độ giãn nở của các tế bào nang Các tế bào nang còn tham giachuyển hóa gluco thành pyruvat đưa vào trứng làm nâng cao chất lượng trứng[55] Trong quá trình nuôi thành thục trứng, các tế bào nang có vai trò giữ nhâncủa trứng ở giai đoạn GV thông qua điều khiển nồng độ cAMP nội bào [10],[61] Do đó khi loại bỏ tế bào nang trong giai đoạn nuôi trứng chín, trứng khôngchịu tác động của các tế bào nang có thể thành thục nhân sớm hơn [22], [61].Theo Shimada và cộng sự (2003) các tế bào nang còn là nguồn tiết progesteronecung cấp cho tế bào trứng trong môi trường nuôi [68] Progesterone là nguyênnhân làm tăng nồng độ connexin -43 trong tế bào trứng lợn và kết quả là khởi

xướng sự thành thục nhân của tế bào trứng lợn [53], [54] Do đó độ giãn nở củalớp tế bào nang cũng là một chỉ tiêu để đánh giá sự thành thục của trứng [8]

1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành thục trứng

Vai trò của dịch nang trứng

Dịch nang trứng (porcine follicular fluid - pFF) là dịch thu được từ cácnang của buồng trứng Dịch nang trứng có thành phần chính là chất rỉ ra từxoang nang trứng và một phần khi các nang trứng vỡ ra Dịch nang trứng chứacác thành phần giống như trong huyết thanh, ngoài ra nó còn chứa các proteinđược tổng hợp trong nang trứng, các enzyme đặc hiệu phục vụ hoạt động củabuồng trứng như: ATPase, lactate dehydrogenase, transaminase, alkalinephosphatases và chứa nhiều loại hormone quan trọng tới sự hình thành và pháttriển của nang trứng như Gonadotrophin, đặc biệt là các steroid như: oestrogen,androgens và progestogens [41], [70] Dịch nang trứng chứa các yếu tố sinhtrưởng, các hoocmon steroid và các thành phần cần thiết cho quá trình phát triển

của trứng mà trong điều kiện nghiên cứu in vitro các môi trường chưa thể bổ

sung đầy đủ [30], [56] Mặc dù việc thu và bảo quản dịch nang đòi hỏi nhiều thờigian và công sức, khi sử dụng dịch nang trứng khả năng nhiễm khuẩn cao nhưng

nó vẫn được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và sử dụng Dịch nangtrứng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành thục nhân, tế bào chất củatrứng, quyết định chất lượng trứng sau khi nuôi qua đó nâng cao hiệu quả củaquá trình thụ tinh [6], [41] Ngoài ra theo một số tài liệu nó còn tác động tới sựhình thành tiền nhân và khả năng phát triển của phôi [20], [62] Yoshida và cộng

sự (16) cũng báo cáo rằng việc bổ sung dịch nang trứng làm tăng tỷ lệ hình thànhtiền nhân đực, tỷ lệ thụ tinh và phát triển của trứng [70] Theo báo cáo của Naito

và Rath việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng có, vai tròtrong việc phục hồi quá trình giảm phân của trứng sau thụ tinh [41], [47] Cũngtheo Yoshida và cộng sự, trong dịch nang trứng chứa các phân tử trọng lượng

khoảng 10-200 kDa mang tính axit và không bền với nhiệt, các phân tử này chịutrách nhiệm trong sự thành thục và năng lực phát triển của trứng Theo một sốtác giả, chất lượng dịch nang trong các nang có kích thước khác nhau là khácnhau Khi nuôi trứng với dịch nang thu từ các nang trứng lớn thì khả năng hìnhthành tiền nhân đực là lớn hơn khi nuôi trong môi trường bổ sung dịch thu từ cácnang nhỏ [12], [23] Ngoài ra dịch nang trứng còn có ảnh hưởng tới khả năng

xâm nhập của tinh trùng ngăn cản sự đa tinh trùng trong quá trình thụ tinh in vitro bằng cách tác động tới sự tương tác của tinh trùng với màng zona pellucida

của trứng Việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng giúp trứnglợn phát triển hoàn toàn sau khi IVF [41], [70], [47] Nhưng theo Tatemoto vàcộng sự thì dịch nang trứng giữ vai trò quan trọng nhất đó là bảo vệ trứng khỏicác stress oxi hóa nhờ nó chứa enzyme superoxide dismutase (SOD) Enzymenày có hoạt tính quét dọn các gốc tự do, bảo vệ trứng khỏi các tác nhân oxy hóagây nguy hiểm cho tế bào [62] Các tác nhân oxy hóa này có thể gây phá hỏngDNA trong trứng, ảnh hưởng tới lớp tế bào nang bao quanh gây ảnh hưởngkhông tốt tới quá trình trao đổi chất của trứng qua đó làm ức chế sự phát triểntrứng, thậm chí là phá hủy tế bào trứng Cũng theo nghiên cứu của ông cho thấyhoạt tính SOD của dịch nang thu được từ các nang trứng có kích thước 2-6 mm

có mức hoạt tính SOD cao gấp 7, 2 lần so với trong huyết thanh bê, tuy nhiênhuyết thanh bê đã được sản xuất hàng loạt từ nhiều năm nay và có giá trị thươngmại rất lớn còn dịch nang trứng thì mới được tách chiết mang tính chất phục vụtại chỗ vì việc tách chiết mất nhiều thời gian và nhân lực, khả năng nhiễm khuẩnlại cao hơn so với huyết thanh bê Tuy nhiên sử dụng dịch nang trứng có vẫn cókhả năng mang lại hiệu quả tạo phôi cao mà còn giảm chi phí tạo phôi

Vai trò của huyết thanh bê (FCS)

Huyết thanh bê là thành phần của huyết tương, thu được sau khi đông khômáu, trong thành phần của nó chứa một lượng nhỏ kháng thể và rất nhiều yếu tố

Huyết thanh bê được thu từ máu tĩnh mạch của các bê tại các lò mổ hoặc bằngchích máu động mạch tim từ các thai sống, nó có màu sáng và hơi vàng Huyếtthanh bê rất có ý nghĩa thương mại, được sử dụng từ nhiều năm nay và có chấtlượng ổn định hơn dịch nang trứng Về cơ bản, huyết thanh bê có thành phần vàvai trò tương tự với dịch nang trứng Nó không chỉ được sử dụng để bổ sung vàomôi trường nuôi trứng, nuôi phôi của động vật có vú mà còn được sử dụng trong

hệ thống nuôi cấy mô Huyết thanh bê là nguồn cung cấp protein cho trứng tronggiai đoạn nuôi trứng thành thục Theo Schroeder và cộng sự (1990) trong huyếtthanh bê chứa fetuin, nhóm glycoprotein này có khả năng ngăn cản sự xơ cứngcủa màng ZP trong quá trình nuôi trứng thành thục [52] Fetuin hoạt động thôngqua việc ngăn cản sự hoạt động của emzyme proteolytic được hình thành từ việcgiải phóng sớm các hạt vỏ Ngoài ra, tác dụng ngăn cản sự cứng màng zona củatrứng cũng có ảnh hưởng tới sự thành thục tế bào chất của trứng trong quá trìnhthành thục [21]

1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng

1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng

Hoạt hoá tinh trùng là một quá trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạtcác phản ứng sinh hoá và sinh lý phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tếbào trứng thành thục Người ta cho rằng các giai đoạn đầu tiên của hoạt hoá liênquan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh(Seminiferous Tubule), mào tinh (Epididymis), ống dẫn tinh (Vas Deference) vàtinh thanh (Seminal Plasma) Trong khi di chuyển từ tinh hoàn qua mào tinh(Epididymis), tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục cókhả năng thụ tinh và dự trữ ở đuôi dịch hoàn phụ đến khi được giải phóng ratrong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu [55]

1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro

Sự hoạt hóa tinh trùng là rất quan trọng, nó quyết định sự thành công của quá

trình thụ tinh in vitro Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này Để tạo điều

kiện cho quá trình thụ tinh thì tinh trùng phải đạt các yêu cầu về sự vận động, hoạtlực để có thể tới trứng tham gia phản ứng thể đỉnh, xâm nhập vào trứng, gắn kết vàdung hợp với trứng Dựa trên các nghiên cứu về hoạt động của tinh trùng trong tựnhiên, các nhà khoa học đã đáp ứng các điều kiện cần thiết để tạo môi trường phùhợp cho tinh trùng hoạt động

Điều kiện pH: Giá trị pH sử dụng trong các kỹ thuật TTON đóng vai trò

quan trọng trong quá trình thụ tinh Ở lợn, Cheng (1985) đã nhận thấy tỷ lệ tinhtrùng xâm nhập tế bào trứng cao (>89%) khi tinh trùng được hoạt hoá ở 370C trongmôi trường pH 7,8 trước khi được bổ sung vào môi trường thụ tinh có pH 7,4 ởnhiệt độ 390C [7] Trong nghiên cứu đó, người ta thấy rằng, pH tối ưu cho thụ tinhkhác với pH cho hoạt hoá tinh trùng Ở cừu, tác giả đã nhận thấy rằng pH tối ưu chohoạt hoá tinh trùng cừu là 7,8 và cho thụ tinh là 7,4 ở bò, ngược lại, Lu và Gordon(1987) nhận thấy rằng pH tối ưu cho môi trường hoạt hoá là 7,4 và cho môi trườngthụ tinh là 7,8 [36]

Bổ sung Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng: Tinh trùng khi tiếp xúc

với Albumin huyết thanh bò (BSA) trong một dung dịch muối sinh lý phù hợp cóthể hoạt hoá tinh trùng trong ống nghiệm do đó BSA đã được sử dụng thườngxuyên trong môi trường nuôi dùng trong thụ tinh ống nghiệm Ngoài ra albuminhuyết thanh còn đóng một vai trò quan trọng trong việc loại bỏ cholesterol và kẽmkhỏi tinh trùng bởi vì loại protein này được coi là có khả năng kết dính cả hai loạiphân tử này Người ta tin rằng cholesterol, chất ổn định màng tế bào, được loại bỏkhỏi màng tinh thanh tinh trùng trong khi hoạt hoá; ion kẽm, cũng là chất ổn địnhmàng tế bào cũng có thể loại bỏ trong các giai đoạn đầu của quá trình hoạt hoá.Trong thụ tinh ống nghiệm lợn, BSA fraction V được sử dụng để bổ sung vào môi

Fukui và cs (1983) đã kiểm tra nhiều kỹ thuật khác nhau dùng cho hoạthoá tinh đông lạnh -giải đông và sau đó dùng những tinh trùng đó cho TTON[15] Họ nhận thấy rằng dịch nang trứng lợn (pFF) có tác dụng trong hoạt hoátinh trùng

Dùng canxi ionophore: Ion Canxi đóng vai trò then chốt trong quá trìnhthụ tinh Khi màng tinh trùng thay đổi tính thấm, các ion Ca ++ ngoại bào đi quamàng vào trong nội bào, tới khi nồng độ Ca2+ nội bào đã tích lũy đủ tức là tinhtrùng đã sẵn sàng để thụ tinh Canxi Ionophore, chủ yếu được các nhà nghiêncứu Nhật Bản sử dụng thành công, để vượt qua giai đoạn đầu của hoạt hoá tinhtrùng bằng cách tăng trực tiếp lượng Ca ++ của tế bào và gây phản ứng thể đỉnh

1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng

Các phương pháp sàng lọc tinh trùng được tiến hành để chuẩn bị cho quátrình thụ tinh trong ống nghiệm Những kỹ thuật này có thể nâng cao chất lượngtinh trùng, loại bỏ tinh thanh và các mảnh vụn còn lại, đặc biệt nó loại bỏ hoàntoàn các chất bảo quản đông lạnh ra khỏi tinh trùng

Kỹ thuật bơi ngược dòng (Swim-up)

Kỹ thuật Swim-up thường liên quan đến việc giải đông tinh trùng và đưachúng vào một thể tích môi trường thích hợp Môi trường này thường là môi trườngkhông có canxi -tyrode/albumin/Na lactate/Na pyruvate (TALP) và được dùng cho

cả kỹ thuật Swim-up và tiếp theo là rửa tinh trùng Mẫu tinh trùng được để trong tủnuôi ở nhiệt độ 390C từ 30 - 60 phút, trong thời gian đó những tinh trùng có hoạt lựctốt trong tinh dịch sẽ bơi lên phía trên môi trường TALP Mặc dầu kỹ thuật Swim-

up có thể cho kết quả mẫu tinh trùng có hoạt lực cao nhưng chúng cũng có nhữngbất lợi vì số lượng tinh trùng bơi lên tương đối thấp, đó là điều quan tâm trong thực

tế khi sử dụng tinh cọng rạ rất đắt Tỷ lệ thụ tinh thường tăng từ 46% lên 59% vàcác mẫu tinh trùng từ kỹ thuật Swim-up cho thấy tinh trùng có hoạt lực cao Nhucầu sử dụng kỹ thuật Swim-up có thể lớn hơn khi chất lượng tinh trùng và hoạt lựctinh trùng kém

Kỹ thuật lọc qua màng lọc thủy tinh

Trong những năm 1950, người ta đã chỉ ra rằng tinh dịch pha loãng, khi lọcqua một lớp hạt thủy tinh nhỏ, thì những tinh trùng chết bị màng lọc giữ lại, cònnhững con tinh trùng sống đi qua được Gần đây hơn, Daya và cs (1987) đã sử dụngcột hạt thủy tinh để tách tinh trùng ở người; họ nhận thấy kỹ thuật này có thể tintưởng được và là một kỹ thuật có kết quả ổn định để tách các tinh trùng có hoạt lực

từ những tinh dịch có chất lượng kém [9] Kỹ thuật này có hiệu quả hơn nhiều sovới kỹ thuật Swim-up để thu được những tinh trùng có hoạt lực tốt

Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng BSA /Percoll

Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng Percoll, tinh trùng được tách bằng cáchcân bằng, khi tỷ trọng tinh trùng tương đương với tỷ trọng của sự chênh lệch.Người ta cho rằng những tinh trùng có hình thái nhân tốt dày đặc hơn so vớinhững tinh trùng kém hơn và được lựa chọn ở phần tỷ trọng cao hơn của sựchênh lệch Percoll Utsumi và cs (1988) đã sử dụng 30% và 40% Percoll trongmôi trường Tyrode cải tiến (m-Tyrode) làm phương pháp tách tinh trùng của họ[64] Sau đó utsumi và cs (1991) đã sử dụng môi trường 30% và 45% [65].Rosenkrans và cs (1993) đã sử dụng 90% và 45% sự chênh lệch tỷ trọng Percoll

để tách những tinh trùng có hoạt lực trong nghiên cứu của họ [50]

Sử dụng phương pháp ly tâm

Đây là phương pháp cơ bản nhất trong các phương pháp trên Phương phápnày sử dụng phù hợp khi số lượng tinh trùng lớn và chất lượng tinh trùng là khátốt Cọng rạ chứa tinh trùng đông lạnh sau khi lấy ra khỏi bình bảo quản lạnhđược hóa lỏng trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 37oC Tinh trùng được pha loãngtrong trong môi trường rửa tinh trùng và ly tâm Sau khi ly tâm, những tinh trùngkhỏe sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm tạo khối kết tủa, phần không cần thiết sẽ hòatan trong dịch nổi bên tên Việc ly tâm giúp loại bỏ hoàn toàn các chất bảo vệlạnh sử dụng để bảo quản tinh trùng, loại bỏ tinh thanh, những mảnh vụn tế bào,

1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm

1.6.1 Sự thụ tinh

Thụ tinh là quá trình kết hợp hai giao tử đực và cái Quá trình này đi kèmvới sự khôi phục cơ cấu di truyền lưỡng bội và hoạt hóa trứng cho sự phát triểntiếp sau Kết quả của quá trình thụ tinh là tạo nên một tế bào lưỡng bội gọi là hợp

tử [3] Thụ tinh là quá trình rất phức tạp và phải trải qua ít nhất 5 bước: Tinhtrùng gắn với lớp màng trong suốt của trứng; Tinh trùng diễn ra phản ứng thểcực; Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt; Tinh trùng gắn với lớpbào tương của trứng; Cuối cùng là sự hợp màng giữa trứng và tinh trùng và hìnhthành tiền nhân Sự xâm nhập của tinh trùng hoạt hóa tế bào trứng, dẫn tới cácbiến đổi lí hóa phức tạp trong tế bào trứng để chuẩn bị cho các bước phát triểntiếp theo [61]

1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm

Chuẩn bị tinh trùng: Một số nghiên cứu cho thấy tinh thanh ngăn cản sựkiện toàn năng lực thụ tinh và chứa một số chất ức chế hoạt động tinh trùng nênphải loại bỏ tinh thanh trước khi thụ tinh Trong trường hợp sử dụng tinh đônglạnh thì tinh trùng đã được làm sạch và bảo quản trong môi trường bảo quảnlạnh Trước khi tiến hành cần giải đông cọng tinh và đưa tinh trùng vào môitrường hoạt hóa

Trong môi trường hoạt hóa cần bổ sung huyết thanh thai bê hoặc albuminhuyết thanh bê để lấy bớt cholesterol từ màng tinh trùng làm tăng tính linh hoạtcủa tinh trùng Sử dụng huyết thanh mang lại hiệu quả tốt hơn vì nó còn chứa cáclipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin

Nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thụ tinh là 38,5oC Trứng chỉ được thụ tinhkhi đã thành thục cả về nhân và tế bào chất Thời gian thành thục của trứng trong

môi trường nuôi in vitro vào khoảng 38-44 giờ Do đó, thời điểm thụ tinh thích hợp

nhất là 44h sau khi trứng được nuôi thành thục và đã hình thành thể cực đầu tiên

Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng: Các tinh trùng sau khi hoạthóa sẽ có khả năng thụ tinh in vitro cho các trứng trong vòng 2,5 giờ sau khixâm nhập vào tế bào trứng [42] Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duytrì khả năng thụ tinh như tỷ lệ về khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn50% sau 2 giờ được bổ sung vào môi trường chứa tế bào trứng [39]

Mật độ tinh trùng: Trong số các tinh trùng đem đi thụ tinh, ta không thểxác định được tỷ lệ các tinh trùng thực sự được hoạt hóa là bao nhiêu, do đótrong quá trình thụ tinh cần phải sử dụng lượng tinh trùng rất lớn Điều này dẫntới xác suất xảy ra hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng tăng, ngoài ra còn có thể ảnhhưởng không tốt tới sự hình thành và phát triển phôi

Xác tinh trùng còn lại sau thụ tinh: Sự hiện diện xác tinh trùng trong môitrường sau khi thụ tinh ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của phôi [66] Saukhi thụ tinh cần chuyển tế bào trứng sang môi trường khác để tránh tác động oxyhóa của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng lên phôi

1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm

Trong suốt quá trình tạo phôi lợn in vitro, trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tớihiệu quả tạo phôi là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Khi nhiều tinh trùng cùngvào trứng, sẽ cùng tham gia vào quá trình dung hợp nhân và kết quả là hìnhthành lên các thể lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm làm cho hợp tử tạo

ra không thể phát triển bình thường [67] Phôi với những tế bào chứa nhân đabội có thể phát triển bình thường tới một giai đoạn nhất định sẽ thoái hóa và chếtdần [5] Do đó hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng sẽ làm giảm tỷ lệ tạo phôi vàchất lượng phôi tạo ra Phản ứng vỏ và màng noãn hoàng có tác dụng ngăn cảnhiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng xảy ra ở lợnvới tần số cao hơn các loài khác rất nhiều Các nhà khoa học đã nghiên cứu rấtnhiều phương pháp khác nhau để giải quyết vấn đề này như bổ xung vào môitrường thụ tinh tế bào ống dẫn trứng, tế bào nang hay giảm số lượng tinh trùng

tinh thì sẽ làm giảm khả năng xâm nhập của tinh trùng kéo theo nó là làm giảm

tỷ lệ thụ tinh chung Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung vào việc nghiêncứu điều khiển sự liên kết của tinh trùng với màng sáng của trứng trong quá trìnhthụ tinh nhằm hạn chế sự xâm nhập của nhiều tinh trùng vào một trứng làm giảmhiện tượng thụ tinh đa tinh trùng [67] Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng phụthuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tinh tại thời điểm thụ tinh, chất lượngtrứng mang thụ tinh và môi trường thụ tinh [32], [59], [26]

1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm

1.7.1 Quá trình phát triển phôi

Sau khi hoàn thành quá trình thụ tinh, trứng trở thành một tế bào lưỡng bộiđược gọi là hợp tử, đây là giai đoạn sớm nhất phôi Chỉ vài phút sau khi nhânnguyên đực và nhân nguyên cái kết hợp với nhau là phôi bắt đầu phân chia, sự phânchia liên tiếp của phôi gọi là sự phân cắt Phôi phân chia tạo 2, 4, 6, 8, 16 tế bào, các

tế bào này được gọi là các phôi bào (blastomere) Giai đoạn này sự phân chia diễn

ra không ngừng, kích thước tế bào liên tục nhỏ đi và kết hợp lại thành một khối tếbào gọi là phôi dâu (morula) Sự phân chia kết thúc khi hình thành nên phôi nang(blastocyst) Trong phôi nang đã có sự biệt hóa tạo ra hai loại tế bào là tế bào thuộc

lá nuôi phôi (trophectoderm) và các tế bào thuộc nút phôi (inner cells mass) Đặcđiểm hình thái ứng với giai đoạn phát triển của phôi được biểu diễn trong Bảng 1

Số tế bào tăng rất nhanh trong quá trình biệt hóa ở giai đoạn phôi nang sớm.Thường thì số tế bào trong ICM vào khoảng 12-16 tế bào, sau đó sẽ giảm dần ở giaiđoạn phôi nang giãn nở và thoát màng [44] Còn các tế bào thuộc lá nuôi phôi vẫntiếp tục phân chia và khi đạt tới giai đoạn phôi nang giãn nở sẽ hình thành cấu trúcdạng ống [45], [16] Đặc biệt, trong điều kiện tự nhiên ở lợn tỷ lệ chết ở giai đoạnphôi là rất cao (22-41%) [45], [44]

Bảng 1 Các giai đoạn phát triển sớm của phôi lợn Số

Phôi nang sớm Trong giai đoạn từ khi hình thành xoang phôi bào

đến khi xoang chiếm một nửa thể tích phôi, phôi nang được gọi là phôi nang sớm Từ thời điểm này đến khi tế bào lấp đầy toàn bộ khoảng trống giữa màng sáng và màng noãn hoàng gọi là phôi nang

6 Phôi nang dãn nở ở giai đoạn này, xoang giãn nở và màng sáng

giảm độ dày Phôi đôi khi thoát khỏi màng trong

1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh

Trong lịch sử nghiên cứu, phôi tạo ra trong phòng thí nghiệm đượcchuyển vào bộ phận sinh sản của con nhận nuôi phôi khác Prather và cộng sự(1991) đã đưa phôi lợn giai đoạn sớm vào đoạn thắt ống dẫn cừu kết quả thuđược 83% phôi phát triển tới giai đoạn phôi nang [14] Tuy nhiên, khi nuôi phôitrong ống dẫn trứng thỏ thì tỷ lệ lại không cao [19] Phôi lợn có thể phát triển tốttrong ống dẫn trứng chuột, tuy nhiên phải là chuột trưởng thành vì ống dẫn trứngchuột chưa trưởng thành không đủ điều kiện để phôi vượt qua giai đoạn 4 tế bào[13]

Sau nhiều nghiên cứu các nhà khoa học đã tạo ra một số môi trường nuôiphôi xác định chứa các thành phần cần thiết đảm bảo cho sự phát triển của phôigiống như điều kiện trong tử cung con cái Có rất nhiều môi trường khác nhaunhư môi trường Whitten cải tiến (mWM), môi trường NCSU -23 (North CarolinaState University), môi trường ISU (Iowa) và môi trường Beltsville 3 (BECM-3) ,môi trường NCSU -37 (North Carolina State University) [60]

Về cơ bản môi trường nuôi phôi cũng giống với môi trường nuôi trứngnhưng không bổ sung hormone và hàm lượng huyết thanh cao hơn để đảm bảo

sự phân chia của phôi Môi trường nuôi phôi được bổ sung các yếu tố bảo vệ ápsuất thẩm thấu như taurineV, hypotaurine hoặc sobitol Trong môi trường nuôi

phôi, glucose là nguồn cơ chất năng lượng ngoại bào cung cấp cho sự phát triểncủa phôi Nhu cầu dinh dưỡng của phôi lợn phụ thuộc vào giai đoạn phát triểncủa chúng Từ giai đoạn một tế bào đến giai đoạn phôi dâu chặt, chúng có thểphát triển trong một dung dịch muối đơn giản Tuy nhiên, từ giai đoạn phôi nangđến giai đoạn phôi nang dãn nở, huyết thanh, axit amin, và các chất khác đóngmột vai trò quan trọng đến sự phát triển của phôi, do đó nhu cầu dinh dưỡng caohơn một khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang.

1.8 Cất giữ lạnh phôi

Bảo quản lạnh phôi là quá trình chuyển phôi từ trạng thái sinh lý bình thường(trong cơ thể mẹ hoặc ngoài cơ thể mẹ ở nhiệt độ 370C) sang trạng thái tiềm sinhđông lạnh để cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu –1960C Phôi đông lạnh vẫn cóthể sống, phát triển bình thường sau giải đông và đem cấy cho con cái nhận phôiđộng dục đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác Các chất bảo vệlạnh và cơ chế cất giữ lạnh phôi

Các chất bảo vệ lạnh

Những chất bảo vệ lạnh được dùng phổ biến bao gồm glycerol,dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol (ethylene glycol, propyleneglycol….) nhưng được dùng phổ biến nhất là glycerol Glycerol có tính độc nhẹ,

có tác dụng như một chất chống đông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tếbào, hoà tan trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol vào bên trong

tế bào thay thế các phân tử nước làm cho tế bào không bị giảm dung tích Ở bêntrong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên nướcđóng băng ở dạng nhỏ nên ngăn cản được sự phá vỡ màng tế bào Vì vậy màglycerol giữ được sự ổn định về nồng độ của các chất hoà tan, không làm thayđổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trìnhđông lạnh Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dungdịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định đểthực hiện quá trình rút nước nội bào và thay thế bằng glycerol

Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước được tạo thành trước tiên

ở môi trường bên ngoài tế bào, làm nồng độ chất hòa tan tăng nên nước sẽ đi rangoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức độ mất nước tế bào phụ thuộc vàotốc độ đông lạnh, tốc độ này phải ở trên tốc độ giới hạn Trong môi trường huyềnphù, nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước đểduy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào Như vậy, sự hiệndiện của tinh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tốchủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của

tế bào Theo Mazur (1977), khi nhiệt độ hạ xuống -50C, tế bào và môi trườngxung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và vì sựgiảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh [37] Tinh thể nước sẽ hìnhthành bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -50C đến -150C nhưng các chất bên trong tếbào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ lạnh chưa tạo đá

Hình 8: Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội

bào và ngoại bào

Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội bào vàngoại bào thể hiện qua Hình 8 Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất

nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏnhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằngvới tiềm năng các chất hoá học ngoại bào Kết quả là tế bào mất nước và khôngđông lạnh bên trong tế bào Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó không

có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng, và vì vậy nhiệt độ lạnh chưa tạo

đá tăng lên và cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh nội bào

Phương pháp đông lạnh

Nhìn chung, đông lạnh phôi có thể chia làm 2 phương pháp: đông lạnh chậm vàđông lạnh nhanh Đông lạnh chậm là phương pháp mà ở đó quá trình làm mấtnước nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xảy ra chậm trước khi phôi đượcchuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng Đối với phương pháp đông lạnh chậm,phôi được chuyển vào môi trường có chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng

độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường có nồng độ chấtbảo vệ lạnh thích hợp Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30phút Sau khi cân bằng, phôi được đông lạnh với tốc độ hạ nhiệt 0,30C/phútxuống nhiệt độ –300C và từ nhiệt độ này phôi được chuyển vào nitơ lỏng (-

1960C) để bảo quản Sau đó cọng rạ chứa phôi được chuyển ngay vào máy đônglạnh và việc tạo đá được thực hiện ở nhiệt độ –30C đến –70C Tạo mầm tinh thểnước (seeding) là thuật ngữ dùng để mô tả việc hình thành đá có kiểm soát ởnhiệt độ lạnh, bằng cách chạm panh đã được nhúng trước vào nitơ lỏng vàothành của cọng rạ Ngay sau khi tạo mầm tinh thể đá, đá sẽ được hình thànhnhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ chứa phôi, và việc hạ nhiệt độ vẫn được thựchiện với tốc độ 0,30C/phút xuống –300C, từ nhiệt độ này, phôi được chuyển vàonitơ lỏng để bảo quản [51], [63]

Phương pháp đông lạnh nhanh là những phương pháp đông lạnh mà thời gian từlúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xảy ra rất nhanh Phôisau khi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào niơ lỏng mà khôngcần phải sử dụng máy đông lạnh có kiểm soát nhiệt đã được lập trình sẵn