xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm lâm sàng màng sinh học từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương mất da

✦ Chuẩn bị nguyên liệu và xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu: • Nguyên liệu nuôi cấy tạo màng cellulose bán thành phẩm: nguồn nguyên liệu để nuôi cấy Acetobacter xylinum là nước dừa già,

PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài: Xây dựng qui trình sản xuất và thử nghiệm lâm sàng màng sinh học

từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương mất da

Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Nguyễn Văn Thanh

Đồng chủ nhiệm đề tài: TS Huỳnh Thị Ngọc Lan

Cơ quan chủ trì: ĐH Y Dược TP HCM

Thời gian thực hiện: 24 tháng

Kinh phí được duyệt: 870 triệu

Kinh phí đã cấp: 600 triệu đồng theo TB số: TB 284 / TBKHCN ngày 11 tháng 12

năm 2007

Mục tiêu

- Xây dựng qui trình sản xuất màng sinh học từ cellulose vi khuẩn phối hợp với họat chất tái sinh mô của dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc trị tổn thương mất da với qui mô 1500 màng/ lô

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm màng

- Thử nghiệm lâm sàng màng sinh học đến hết giai đoạn 2 để làm cơ sở cho

việc điều trị tổn thương mất da bằng màng sinh học

✦ Chuẩn bị nguyên liệu và xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu:

• Nguyên liệu nuôi cấy tạo màng cellulose bán thành phẩm: nguồn nguyên liệu

để nuôi cấy Acetobacter xylinum là nước dừa già, nguồn protein, đường glucose và các loại muối khoáng, trong đó nguồn nước dừa già cần phải được xử lý và kiểm soát chất lượng trước khi sử dụng và cần xây dựng tiêu chuẩn nước dừa khô về mặt vi sinh Nước dừa đạt tiêu chuẩn sẽ được xử lý cho trong và đưa đi tiệt trùng

• Nguyên liệu tạo màng thành thành phẩm

- Hoạt chất tái sinh mô: chiết xuất từ dầu mù u, xây dựng tiêu chuẩn họat chất

này bao gồm các tiêu chuẩn lý hóa, thành phần acid béo và thử không gây kích ứng da

- Tinh dầu tràm trà Úc: xây dựng tiêu chuẩn về tinh dầu tràm trà Úc bao gồm

tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn hay gây nhiễm vết thương và tính kích ứng da

- Bao nhôm sử dụng để đóng gói

- Các loại hóa chất sử dụng tinh chế màng: hóa chất tinh khiết

✦✦ Xây dựng các qui trình với qui mô sản xuất 1500 màng /lô

• Xây dựng qui trình tạo màng cellulose thô từ vi khuẩn Acetobacter

xylinum qui mô 1500 màng / lô

- Xây dựng qui trình nhân giống vi khuẩn: sử dụng phương pháp nuôi cấy động

với thể tích từ 8 lít đến 30 lít giống Khảo sát các thông số động học của quá trình nhân giống để đạt khả năng tăng trưởng khoảng 100 lần, từ đó có thể sử dụng để nhân giống cho 200 lít đến 400 lít môi trường tạo màng cellulose

- Xây dựng qui trình nuôi cấy tạo màng cellulose thô: khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Qui trình này thực hiện trong các hộp nhựa kích thước 22m x 12cm x 10cm Mỗi mẻ nuôi cấy sử dụng khoảng 200 hộp nhựa/ mẻ với số màng thu được khoảng 1500 màng kích thước 10 cm

x 10 cm

• Xây dựng qui trình tinh chế màng cellulose thô qui mô 1500 màng / mẻ:

màng cellulose thô có màu vàng nhạt bên trong còn chứa vi khuẩn Acetobacter

xylinum và các tạp chất của môi trường nuôi cấy Vì vậy cần phải phá vỡ các tế bào vi

khuẩn và lọai độc tố Màng cellulose sau khi tinh chế có màu trắng trong, đạt độ tinh khiết cao, đạt các tiêu chuẩn đã được nghiên cứu để chế tạo màng trị tổn thương mất

da như không kích ứng da, có khả năng cản khuẩn, có độ bền cơ học cao và có khả năng hút dịch

• Xây dựng qui trình kiểm tra chất lượng sản phẩm cỡ mẫu 250 mẫu: kiểm

tra chất lượng màng bán thành phẩm, màng thành phẩm theo đúng các tiêu chuẩn chất

lượng cơ sở đã đặt ra với các phương pháp kiểm nghiệm đã qui định của Dược điển Việt nam và các Dược điển có uy tín khác

• Xây dựng qui trình tạo màng trị bỏng thành phẩm ACETUL: màng

cellulose tinh khiết được phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc và các tá dược Màng thành phẩm được đóng gói trong bao PE và bao nhôm và sau đó tiệt trùng bằng tia gamma

Theo dõi độ ổn định của sản phẩm: màng ACETUL sẽ được theo dõi các đặc

tính của màng như khả năng kháng khuẩn, khả năng thấm hút dịch, khả năng cản khuẩn và thành phần hoạt chất tái sinh mô ở điều kiện tự nhiên (nhiệt độ phòng) trong thời gian 2 năm

2 Thử nghiệm lâm sàng: thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và 2

- Lập hồ sơ thử nghiệm lâm sàng và đăng ký với Bộ Y tế

- Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 1: thử nghiệm trên 30 người khỏe mạnh nhằm thiết lập đánh giá sơ bộ về tính an tòan của chế phẩm trên người

- Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 2: thử nghiệm lâm sàng ở qui mô vừa trên 50 bệnh nhân bị bỏng độ 2 nhằm đánh giá hoạt động trị liệu, tính an toàn của thuốc trên các bệnh nhân, chế độ điều trị thích hợp

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Sử dụng các loại màng che phủ vết thương mất da

Việc điều trị những vết thương mất da nhất là những tổn thương do bỏng thật sự là một thách đố lớn Ngay tại Mỹ cũng có đến 12 000 nạn nhân đã chết mỗi năm vì bỏng hoặc do những nguyên nhân mất da khác Vào những tháng cao điểm, hàng ngày Viện bỏng Quốc gia phải điều trị cho khoảng 200 bệnh nhân bị các vết thương do bỏng, tai nạn giao thông, tai nạn nghề nghịêp [8] Các tai nạn nêu trên đã tạo ra các thương tích rất nặng nề Chấn thương bỏng làm gia tăng sự thẩm thấu nước, protein và các chất điện giải, dẫn đến tăng tiết dịch, tạo điều kiện gia tăng sự nhiễm trùng vết thương Tiến trình lành vết thương mất da tùy thuộc rất nhiều vào quá trình điều trị chăm sóc vết thương Một trong những yếu tố quan trọng không thể thiếu trong quá trình điều trị này là sử dụng các loại vật liệu che phủ vết thương.[72] Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh được rằng một vết thương hay một vết bỏng sẽ chóng lành khi nó được giữ trong một điều kiện thích hợp, nghĩa là cần có một lớp màng bảo vệ vết thương (wound dressing) Một lớp màng bảo vệ sẽ có ý nghĩa rất lớn trong việc giữ cho vết thương tránh khỏi sự nhiễm trùng, có một độ ẩm thích hợp, kích thích lành sẹo, bảo vệ những tế bào mới hình thành và quan trọng nhất là hạn chế tình trạng mất nước và chất điện giải liên tục do sự bay hơi từ bề mặt vết thương.[24],[39] Điều này sẽ giúp cải thiện toàn trạng vết thương Đáp ứng nhu cầu này, đã có rất nhiều loại màng được nghiên cứu chế tạo và đã được chứng minh hiệu quả thực tế điều trị

1.2 Các loại băng sử dụng che phủ vết thương

Băng vết thương phải có một trong những chức năng sau: [25],[52],[74]

(1) Có khả năng hút dịch rỉ và các độc tố trên bề mặt vết thương (2) Duy trì môi trường ẩm cho vết thương; (3) Hấp phụ mùi; (4) Cho phép thông khí; (5) Tạo ra sự cách nhiệt; (6) Có khả năng cản vi khuẩn, bảo vệ vết thương khỏi sự nhiễm khuẩn; (7) Có tác động làm sạch vết thương (loại bỏ mô chết và những tiểu phân lạ); (8) Không độc, không kích ứng; (9) Lấy ra dễ dàng khỏi vết thương, không gây tổn

thương Dựa trên nguồn gốc vật liệu, người ta chia màng ra làm các loại: băng gạc thiên nhiên, băng tổng hợp, băng sinh học

Theo cơ chế tác động có thể phân loại băng như sau: [17],[19]

Bảng 1.1 Phân loại băng vết thương theo cơ chế tác động

Băng truyền thống Các loại băng truyền thống có khả năng che phủ vết thương, khả

năng thấm hút và cản khuẩn kém (băng gạc) Chế phẩm tương tác Màng tổng hợp và những dạng phần lớn trong suốt, hơi nước và

khí oxy có khả năng thấm qua, ngăn cản vi khuẩn (hyaluronic acid, hydrogel, màng dạng bọt…) Các chế phẩm có hoạt

Băng gạc được làm từ sợi cotton thiên nhiên dưới dạng gạc hoặc vải Thường dùng

làm lớp che phủ đầu tiên cho vết thương tiết dịch nhiều, vết thương nhầy nhớt, xước

da, vết bỏng nhẹ Ưu điểm của băng gạc là không gây bít vết thương, thông thoáng, nhưng gạc cũng có nhiều khuyết điểm như không cản khuẩn, gạc hút dịch rỉ vết thương nhanh và trở nên khô, gây đau đớn cho bệnh nhân khi thay băng, không có tác dụng kích thích sự mau lành của vết thương Băng gạc có thể được phối hợp với các chất khác như vaselin, chất sát khuẩn …

Băng tổng hợp

Băng tổng hợp còn được xem là những chế phẩm tương tác Băng tổng hợp gồm các lọai: băng gạc dạng sợi polymer giống như những loại băng gạc truyền thống, băng dán vết thương (như băng dán kẽm), các dạng màng polymer

Các polymer tổng hợp có nguồn gốc từ sản phẩm dầu hỏa Polymer tổng hợp có nhiều

ưu điểm như có khả năng bám dính, che phủ toàn bộ viền vết thương, dễ dàng sử

dụng, nhưng nhược điểm chính là thiếu các đặc tính sinh học như thúc đẩy tiến trình liền vết thương thông qua kích thích các tế bào liên quan Những màng này dùng che phủ vết bỏng sâu và vết loét trên da Chúng tạo một môi trường trơ kiểm soát nhiệt độ

và độ ẩm của vết thương đồng thời có khả năng cản khuẩn

Các loại băng có chứa chất kháng khuẩn

Các băng loại này gồm có các dạng như gạc, vải, lưới từ sợi polymer tổng hợp được

tẩm thêm những chất kháng khuẩn như iodin, hợp chất bạc, sulfamid [12],[47],[49] Những chất này có khả năng sát khuẩn mạnh và phổ rộng Các loại băng có chứa chất sát khuẩn thích hợp cho những vết thương ở pha viêm và pha tăng sinh ở những vết thương nhiễm khuẩn nặng

Các polymer dưới dạng màng film

Màng film là một loại màng đồng nhất, bao gồm một lớp polymer, mặt bên được phủ

1 chất dính Các polymer thường sử dụng là: polyurethan, polyethylen, polycaprolacton Màng film thích hợp cho vết thương nông Tuy nhiên do thiếu khoang hấp thu, không cho hơi nước và khí thoát ra, gây tích tụ dịch tiết vết thương dưới lớp màng, đồng thời cho phép vi khuẩn xâm nhập vào bề mặt vết thương Chính

vì thế, chúng không phù hợp với vết thương rộng Một số loại màng film từ polyurethan như: Tegaderm® (3M Health Care Ltd.), Opsite Wound® (Smith & Nephew plc.)

Màng kép

Màng này gồm hai hay nhiều lớp Lớp ngoài cùng được thiết kế để tạo được độ bền,

độ đàn hồi và kiểm soát sự thoát hơi nước Trong khi lớp trong được thiết kế để tạo độ

bám dính cao và độ đàn hồi như màng Granuflex, Biobrane Màng này dễ dàng dính

chặt vào bề mặt vết thương để phát huy tác dụng tăng sinh mô liên kết, mạch máu nhưng đồng thời lại gây ra nguy cơ nhiễm trùng và kéo dài giai đoạn co hẹp khép kín miệng vết thương.[13]

Băng thấm và bán thấm tổng hợp: gồm có băng hydrogel và băng hydrocolloid

Băng hydrogel: là một mạng lưới 3 chiều làm từ polymer ưa nước (có thể chứa được

tới 90 % - 95 % nước).[34] Chúng được làm từ các vật liệu như gelatin hoặc

polysaccharid liên kết với các polymer Các polymer thường sử dụng nhất là polyethylene oxid, polyacrylamid và polyvinylpyrolidin Màng hút nước và có khả năng làm mát, làm giảm đau nên thường được sử dụng sơ cứu khi bị bỏng nhiệt Trên các vết thương khô, màng hydrogel có khả năng tạo môi trường ẩm ướt làm cho vết thương mau lành Một số loại màng hydrogel có chứa các hoạt chất có tác động trên tiến trình lành vết thương như màng Carrasorb® chứa acetylat mannan có tác dụng

kích thích các yếu tố như IL – 1, TNF -
; màng TegadermTM có chứa acid hyaluronic

và chondrotin sulfat liên kết với glucosaminoglycan Những chất nền này có tác dụng kích thích sự tạo thành mô hạt và làm tăng sự biểu bì hóa.[41]

Băng Hydrocolloid: là hỗn hợp các thành phần dính và đàn hồi Trong đó carboxy

methyl cellulose được dùng làm tác nhân hút dịch rỉ vết thương phổ biến nhất Một số sản phẩm trên thị trường như: Duoactive® (Convatec Co.), Absocure® (Nitto Medical Corp.), Duoderm Các loại băng này không dính chặt vào nền vết thương nên khi thay băng sẽ không làm tổn thương biểu bì Ngoài ra sau khi thấm hút dịch từ vết thương loại băng tổng hợp này sẽ tạo ra môi trường ẩm có lợi cho vết thương.[29],[30],[31]

Màng có cấu trúc hạt: một số loại màng còn có cấu trúc từ các hạt tự nhiên phối hợp

với sợi polymer như calcium alginat, chitin, dextran polymer, vải từ than hoạt

Màng alginat: thành phần là alginat natri chiết xuất từ tảo nâu Alginat natri tan trong

nước, có thể chuyển thành muối calci không tan Màng được dùng trị bỏng, viêm loét chân và vết thương nhiễm trùng do chấn thương Một số sản phẩm màng alginat trên thị trường hiện nay như: KaltoStat® (Convatec Co.), Sorbsan® (Alcare Company) [28],[62],[70]

Màng chitin: chitin là một hợp chất cao phân tử cấu tạo bởi N-acetyl D- Glucosamin

là thành phần chính của lớp vỏ loài giáp xác Chitin được làm thành nhiều dạng như dạng xốp, sợi như cotton, dạng lớp, dạng sợi đan lại Nhược điểm là màng không thấm hút dịch và dính vào vết thương.[21],[53]

Màng maltodextrin: maltodextrin có cấu trúc D- glucose polysaccharide Tính ưa

nước của dạng bột này làm cho chúng bị lôi cuốn vào sâu bên trong vết thương và hòa tan các dịch rỉ bám vào vết thương từ đó làm gia tăng khả năng thấm hút dịch.[78]

Các loại băng tổng hợp vô định hình

Hydrogel vô định hình: thành phần giống băng hydrogel, ngoại trừ polymer không

liên kết để tạo thành phiến, chứa một lượng nhỏ collagen, alginate và phức hợp carbohydrate Chúng tạo độ ẩm cho vảy khô của vết thương và tạo điều kiện thuận lợi giúp vảy tự phân hủy Do độ nhớt của hydrogel ưa nước nên khó giữ chúng trên vết thương Tuy nhiên, chúng có tốc độ phủ đầy biểu mô và đóng kín vết thương có thể so sánh với băng hydrocolloid

Băng tổng hợp dạng hơi: tạo thành lớp màng mỏng có khả năng thấm khi xịt vào vết

thương

Băng tổng hợp dạng bọt: tạo thành màng xốp khi sử dụng Đặc tính chính của màng

xốp là độ xốp, sự cách ly và tăng sự bám dính vết thương Những polymer như polyurethane dùng để tạo bọt bền sau khi tiếp xúc với vết thương Những vật liệu này lấp đầy những khoang trên vết thương Chúng mềm, có bề mặt xốp, có khả năng thấm hút khi tiếp xúc với vết thương Dịch rỉ và mảnh vụn tế bào được hấp thu và giữ lại trong màng xốp Sự trao đổi hơi nước và khí được điều chỉnh bằng sự thay đổi thể tích từng phần của polymer và mật độ liên kết Một bất lợi của dạng này là sức bền căng kém và thiếu cấu trúc toàn vẹn

Màng sinh học: màng sinh học có nguồn gốc từ mô tự nhiên, gồm nhiều dạng, có thể

là sự kết hợp giữa collagen, elastin và lipid Hiện nay, nhiều loại polymer sinh học như collagen, fibrin, fibronectin, acid hyaluronic đã được dùng làm màng che phủ vết thương trên da [32]

Không giống như polymer tổng hợp, polymer sinh học trơ với vết thương do đó chúng đóng vai trò quan trọng trong tiến trình làm lành vết thương trên da Màng sinh học có các khả năng: (1) Giữ ẩm tốt; (2) Giảm sự mất protein và chất điện giải của dịch tiết vết thương; (3) Cản khuẩn; (4) Giảm đau; (5) Tái tạo mô, giảm thời gian làm lành vết thương, đặc biệt vết thương sâu và rộng; (6) Ức chế sự tạo thành nguyên bào sợi quá mức, giảm sự co rút vết thương Một số loại màng sinh học điển hình như màng collagen, màng ối đông khô

Màng collagen được thiết kế dưới dạng gel (Collasate®, …) dạng màng sợi hoặc không sợi, dạng hạt (Collamend TM Veterinary Products Laboratory, Phoenix, AZ…), cấu trúc lỗ xốp Sử dụng màng collagen dạng sợi từ bò cho thấy bề mặt vết thương trở nên khô do bị mất nước vì vậy màng không còn tác động như một màng thấm hút Với dạng cấu trúc lỗ xốp cho phép mô mới được tái tạo ngay trong vật liệu, theo thời gian các mô bị tổn thương và mô cấy tiếp xúc chặt chẽ với nhau và không thể tách rời Cuối cùng mô cấy sẽ bị thoái hoá và dần dần được thay thế bằng mô sẹo bình thường

Để tạo collagen dạng xốp, người ta đông khô collagen type I được xử lý trước bằng cách khử nước, chiếu xạ hoặc bằng các chất hoá học như carbodiimid, glutaraldehyd, formaldehyd, hoặc diisocyanat Tuy nhiên, sự có mặt của các tác nhân trên hoặc các chất giải phóng từ sự phân hủy có thể làm cản trở tiến trình lành vết thương Màng collagen có thể được phối hợp với kháng sinh [65]

Màng ối đông khô: cho tác dụng tốt và đã được ứng dụng trên lâm sàng Màng ối có

một số tác dụng trong điều trị vết thương mất da:[7]

- Có tác dụng kích thích mô hạt để chuẩn bị cho ghép da tự thân

- Kích thích biểu bì hóa đối với vết thương nông

- Tăng sinh mạnh mẽ mao mạch mới cải thiện nền ghép để tiếp nhận tốt da ghép

- Giữ cho vết thương ẩm

- Hấp thu các dịch rỉ, giảm mất dịch, điện giải, protein, năng lượng do bốc hơi

- Có hiệu quả kháng khuẩn tương đương mảnh ghép da tự thân

1.3 Chọn lựa các loại băng thích hợp cho vết thương

Không có một loại băng đơn giản nào có thể thích hợp cho tất cả các loại vết thương cũng như tất cả các giai đoạn trong tiến trình lành vết thương Vì vậy có thể sử dụng một số loại băng khác nhau phối hợp để giúp cho quá trình lành vết thương ở những giai đoạn khác nhau trong tiến trình lành vết thương mất da

Việc lựa chọn các loại băng do các bác sĩ điều trị quyết định dựa vào tính chất của vết thương và tính chất của loại băng Giá cả của các loại băng cũng có thể ảnh hưởng đến việc lựa chọn này Bảng 1.2 cho một số ví dụ về việc lựa chọn băng trong điều

trị vết thương mất da [19],[73]

Bảng 1.2 Các loại băng thích hợp cho một số dạng vết thương

Vết thương sạch, tiết dịch nhiều hoặc trung bình

• Băng gạc paraffin

• Băng dạng sợi tổng hợp

Vết thương sạch, khô, tiết dịch ít

• Băng plastic dạng film có lỗ

• Băng dạng film có khả năng thấm hút và thông thoáng

Vết thương sạch, có tiết dịch và tạo mô hạt

• Hydrocolloid

• Băng dạng bọt xốp

• Alginat

Vết thương bị che phủ bởi lớp nhày, có nhiễm trùng

• Hydrocolloid

• Hydrogel

• Băng tẩm chất kháng khuẩn

Vết thương khô và đóng vảy

• Hydrocolloids

• Hydrogels

1.4 Sử dụng cellulose vi khuẩn chế tạo màng trị tổn thương mất da

Một số loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau có khả năng tổng hợp cellulose (gọi là bacterial cellulose) như Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Rhizobium Trong

các loài trên, Acetobacter xylinum là vi khuẩn tạo cellulose hữu hiệu nhất

1.4.1 Đặc tính của cellulose vi khuẩn

1.4.1.1 Cấu trúc

Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn [45]

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn, đường kính sợi bằng 1/100 đường kính của sợi cellulose thực vật So sánh đường kính của sợi cellulose vi khuẩn với đường kính của các sợi nhân tạo cho thấy kích thước của sợi cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hóa học nhỏ nhất

Hình 1.1 Cellulose vi khuẩn Hình 1.2 Cellulose thực vật

(x 20 000 lần) (x 200 lần)

Nguồn: Brown R.M (1999), Pure Appl Chem 71 (5) [14]

Bảng 1.3 Đường kính của các loại sợi

Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30 000 – 75 000

nm hay gỗ bạch dương (betula) là 14 000 – 40 000 nm Những dải vi sợi cellulose mịn

có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được liên kết bởi những liên kết hydro BC khác với cellulose thực vật bởi chỉ số kết chặt, về mức

độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000 đến 6000.[37] Một vài trường hợp đạt tới 16 000 – 20 000 [40] trong khi mức polymer hóa ở thực vật là

13000 – 14 000

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy.[33],[43],[81] Ở điều

kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp lớp cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy và được gọi là S-BC (static BC) Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những

lỗ xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế

bào A.xylinum Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ

nhánh ít hơn các sợi BC được tạo ra từ môi trường nuôi cấy động hình thành A - BC (Agitated – BC) A- BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường giống như mô hình kẻ ô, có cả 2 hướng song song và vuông góc [27],[67],[68]

Hình 1.3 Cellulose trong nuôi Hình 1.4 Cellulose trong nuôi

cấy động cấy tĩnh

Nguồn: Takayasu T., Fumihiro Y.(1997), Pure & Applied Chemistry, 69(11), [68]

Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét Những sợi S-BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau, những sợi A-BC thì rối rắm và cong Ngoài ra

bề mặt cắt ngang của sợi A-BC khoảng 0,1 – 0,2 µm lớn hơn sợi S-BC (0,05 – 0,1 µm) Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau

1.4.1.2 Tính chất cellulose vi khuẩn

BC có độ bền cơ học, hóa học cao và có khả năng cản vi khuẩn.[63],[77] Với tính

chất này màng BC đã được chế tạo làm màng lọc cản khuẩn Khả năng hút nước của

BC lớn hơn rất nhiều so với cellulose thực vật (so sánh với sợi bông, cao hơn gần 200 lần) Khả năng này còn tùy thuộc vào trạng thái của cellulose Cellulose ở trạng thái

ẩm ướt có khả năng hút nước cao hơn ở trạng thái khô (khoảng 10 lần) Nhưng nếu làm khô BC bằng phương pháp đông khô thì khả năng giữ ẩm sẽ tốt hơn BC làm khô

tự nhiên.[57]

Biểu đồ 1.1 So sánh khả năng thấm hút của các dạng BC và sợi vải

Nguồn: Diete K et al (2001).Prog Polym Sci 26 26 26, [29]

Biểu đồ 1.1 So sánh khả năng thấm hút của các dạng BC và sợi vải

Nguồn: Diete K et al (2001).Prog Polym Sci 262626, [22]

Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin,

có thể bị phân hủy bởi một số enzym [46]: CBH I và EG II là hỗn hợp 2 enzym cellulase được tinh chế từ Tricoderma viride với tên thương mại là Meicelase (Meiji Seika, Tokyo, Japan) có khả năng thủy phân BC Có thể kiểm soát được kích thước,

BC dạng ướt

BC đông khô BC dạng khô tự nhiên Sợi vải

cấu trúc (dạng A - BC hay S - BC) và chất lượng của cellulose (kiểm sốt cellulose kết tinh) trong quá trình nuơi cấy tạo cellulose

1.4.2 Nuơi cấy A xylinum thu nhận BC

1.4.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện nuơi cấy A xylinum

Nguồn carbon: A xylinum sử dụng carbon từ nhiều nguồn đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường có thể thay đổi Những loại đường hay được sử dụng nhất là: glucose, fructose, mannitol, sorbitol… Nguồn carbon cho hiệu suất

thấp hơn là glycerol, galactose, saccharose, …[51],[60]

Nguồn nitơ: mơi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là mơi trường do Hestrin và Schramm thiết lập cĩ chứa cao nấm men và trypton Đã cĩ nhiều nghiên cứu thay đổi nguồn trypton như nước ngâm ngơ (corn steep liquor)[52], nguồn nitơ này được cho là cĩ hiệu quả nhất, cho tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh tổng hợp cellulose cao so với các nguồn nitơ khác

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon trên hiệu suất tạo BC

Nguồn carbon Hiệu suất tạo BC

BC (%)

Hiệu suất tổng hợp với nguồn Glucose được coi là 100%

Các chất kích thích tăng trưởng

Các vitamin pyrodoxin, biotin, acid nicotinic, p- aminobenzoic acid (pABA), được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pentothenat và riboflavin cho kết quả ngược lại

1.4.2.2 Các yếu tố lý hóa ảnh hưởng đến quá trình tạo BC

pH: vi khuẩn A xylinum phát triển tốt trong điều kiện môi trường pH thấp Người ta

thường bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy và thấy rằng có sự gia tăng hiệu suất tổng hợp cellulose Hầu hết pH bằng 5 hoặc 6 là dùng trong nghiên cứu nhưng để sản xuất công nghiệp thì pH trong khoảng 4 - 4,5 lại cho kết quả tốt hơn vì giảm được

sự tạp nhiễm

Nhiệt độ: nhiệt độ tốt nhất cho sản xuất BC là 25 oC - 30 oC Ở nhiệt độ thấp quá trình tăng trưởng xảy ra chậm, ở nhiệt độ cao quá trình tăng trưởng bị ức chế, quá trình sinh sản bị đình trệ và hiệu suất tạo cellulose giảm nhiều Ở 24 oC sản lượng cellulose cao hơn 50 % trong suốt 72 giờ nuôi cấy nhưng nhiệt độ đó không thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp

Tác động của oxy: A xylinum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy cần điều kiện thông khí

trong quá trình nuôi cấy Trong thực tế tốc độ thông khí quyết định năng suất tổng hợp cellulose Trong nuôi cấy động, sử dụng cánh khuấy để cung cấp oxy là phù hợp

và cho sản lượng cellulose cao Trong nuôi cấy tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[42],[76]

Điều kiện nuôi cấy: khi nuôi cấy động, BC ở dưới dạng huyền phù phân tán và chúng

có hình những hạt tròn như viên bi hay hình elip, có khi là những hạt bông hình sao

Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh Acetobacter xylinum tạo ra cellulose tích lũy

thành màng dày trên bề mặt môi trường Màng BC thu được dẻo dai, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng, chứa rất nhiều môi trường

Theo các nhà nghiên cứu, các phương pháp nuôi cấy động sẽ cho năng suất BC cao hơn vì cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động, đồng thời BC tạo thành còn có khả năng thấm hút nước tốt hơn BC từ phương pháp nuôi cấy tĩnh Tuy nhiên trở ngại

ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến Cel- một cách ngẫu nhiên sau một thời

gian nuôi cấy động Các chủng này sẽ không còn khả năng sản sinh BC nữa vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể sau đó.[27]

Danuta Ciechánska (2004)[21] đã thêm chitosan vào suốt quá trình sinh tổng hợp màng BC, kết quả tạo thành một loại BC mới, trong đó glucosamin và N-acetylglucosamin kết hợp chặt chẽ với những bó sợi cellulose Loại màng mới này có

ưu điểm giữ ẩm tốt hơn, giải phóng mono và disaccharid dưới tác dụng của lysozym, tác dụng kìm khuẩn với vi khuẩn gram (+) và gram (-) Đây sẽ là lựa chọn mới trong điều trị bỏng và những vết thương sâu, khó lành

Maren Grunert và William T Winter đã thành công trong việc tạo thành những tinh thể cellulose siêu nhỏ từ BC (Baterial Cellulose Nanocrystal) [50] Những tinh thể này đặc biệt bền Ngoài ưu điểm chịu được lực rất lớn nhưng lại dễ dàng bị vi khuẩn phân hủy, những tinh thể này còn có ưu điểm là rẻ tiền

1.4.2.3 Các nguồn nguyên liệu thường dùng để nuôi A xylinum thu nhận BC

Các nguồn nguyên liệu truyền thống thường được sử dụng trong sản xuất BC từ A xylinum như: nước dừa già, rỉ đường, nước mía, nước ép trái cây…[5] Tùy theo nguồn

nguyên liệu mà sản lượng BC tạo thành sẽ cao hay thấp Theo một số nghiên cứu cho

thấy Acetobacter xylinum nuôi cấy trên môi trường nước dừa già cho BC cao hơn trên

môi trường nước cốt dừa hay rỉ đường Nhưng môi trường nước ngâm ngô cho lượng

BC cao nhất (Takayasu Tsuchida và Fumihiro Yoshinaga-1997).[68]

Nước dừa già: nước dừa già là môi trường thường được sử dụng nuôi cấy A xylinum

thu BC ở những nước nhiệt đới có trồng nhiều dừa Nước dừa già là nguồn nguyên liệu được thu nhận ở các nhà máy sản xuất dầu dừa Nước dừa già chứa nhiều chất dinh dưỡng và các yếu tố tăng trưởng như hexitol, cytokinin, myoinositol, sorbitol…

Bảng 1.5 Thành phần nước dừa già [40]

Natrium (mg/100g) 105,0 Acid béo no (g/100 g) 0,176

Kẽm (mg/100g) 0,10 Acid béo không no (g/100 g) 0,01

Nước mía: nước mía là một môi trường tốt để lên men vi sinh vật Nước mía cũng có

thể được sử dụng làm nguyên liệu tốt để sản xuất BC nhưng cần tính đến hiệu quả kinh tế

1.4.2.4 Sử dụng BC chế tạo màng sinh học điều trị vết thương mất da: màng BC

thu được sau khi nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu sử dụng làm da nhân tạo nhờ có một

số tính chất đặc biệt như khả năng hút dịch, khả năng cản khuẩn, được sử dụng trong những trường hợp bị bỏng nặng.[26],[35],[61],[64],[77] Hơn nữa, người ta thấy dường như BC còn có khả năng làm cho các tế bào da phát triển Với những ưu điểm này, màng BC được sản xuất và bán ra thị trường và được sử dụng trong điều trị các loại vết thương mất da (chế phẩm BioFill®, Gengiflex®, Bioprocess ®) [55]

Nguồn: Oscar M Alvarez, Mayank P.,(2004), Wounds, Health Management Publication,

(7) [56]

Hình 1.5 Sử dụng màng BC điều trị vết thương

A) Màng BC trước khi sử dụng; B) Sử dụng màng BC trong tuần 1;

C) Hình thành biểu bì hóa ở vết thương đắp màng BC

Người ta đã nghiên cứu tẩm nano bạc vào màng BC nhằm tạo cho màng có hoạt tính kháng khuẩn Trong nghiên cứu này NaBH4 được thêm vào để làm giảm sự hấp thu ion Ag+ vào màng, chỉ cho dạng nano Ago thấm vào màng.[69] Màng BC có tẩm nano

bạc có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli và Staphylococcus aureus

1.5 Một số dược liệu được sử dụng phối hợp trong điều trị vết thương

1.5.1 Dầu mù u

Dầu mù u có tên khác: Huile de Fahara, Huile de Kanami, Huile de Tamanu

Dầu mù u được ép từ hạt của cây mù u Calophyllum inophylum L., Clusiaceae Dầu

mù u thô có màu xanh đen, còn lẫn nhiều tạp chất, nhựa Sau khi tinh chế, dầu có màu vàng, vị đắng, mùi đặc trưng của dầu mù u Dầu mù u thô có chứa khoảng 72 % dầu

béo và 28 % nhựa, có loại chứa tới 90,3 % dầu béo và 9,7 % nhựa.[23]

Các nhóm lipid có trong dầu mù u [66]: triacylglycerol (TAG) là nhóm lipid có hàm lượng cao trong tất cả các mẫu dầu thô của nhân hạt C inophyllum (76,7 %) Sau đó

là diacylglycerol (DAG) (5,1 %) và acid béo tự do (FFA) (7,0 %) Sự có mặt của monoacylglycerol (MAG) và FFA trong dầu có thể do sự thủy phân từng phần TAG trong quá trình bảo quản hạt

Bảng 1.6 Phân loại lipid trong dầu mù u

Acid béo có trong dầu mù u: thành phần acid béo có trong hạt mù u được trình bày

trong Bảng 1.6 Trong một tài liệu khác, thành phần % trung bình acid béo từ dầu mù

u cũng được nghiên cứu, kết quả tuy khác nhưng tỷ lệ giữa các acid này hầu như không đổi

Bảng 1.7 Hàm lượng acid béo có trong dầu mù u

Acid myristic < 0,1 Acid arachidic 1,1 ± 0,4 Acid palmitic 11 ± 0,8 Acid gondoic 0,4 ± 0,1 Acid palmitoleic 0,10 Acid behenic 0,4 ± 0,1 Acid stearic 13,4 ± 0,8 Acid erucic 0,10

Acid oleic 50 ± 1,7 Acid lignoceric 0,20

Acid linoleic 21,7 ± 1 Acid nervonic 0,20

Acid linolenic 0,5 ± 0,2 Acid eicosenoic 0,72

Tác dụng sinh học của dầu mù u

 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm: dầu và nhựa mù u có khả năng kháng

khuẩn tương đương nhau đối với 2 chủng Staphylococcus aureus và Bacillius subtilis

Calophylloid có khả năng ức chế toàn bộ sự tăng trưởng của vi trùng lao

Mycobacterium tuberculosis H37 – RV

 Độc tính tế bào: không độc đối với gen, không gây ung thư, không độc theo đường uống, không kích ứng da, không hoặc kích ứng yếu đối với mắt

 Tác dụng mau lành vết thương in vivo: những nghiên cứu thực nghiệm về sự

lành sẹo của dầu mù u đã được Jeason thực hiện trên thú chịu một sự kích thích ở da

và đi đến kết luận rằng, dầu mù u được đắp nhiều giờ trên vết bỏng cho phép tránh được sự hoại tử ở những vết thương nặng Khoa Chỉnh hình Bệnh viện Chợ Rẫy và Viện Y Dược học dân tộc khảo sát tác dụng mau lành sẹo của dầu Mù u cho thấy vết thương mất da, lộ xương sẽ nhanh chóng được che phủ khi bôi dầu.[2]

 Một số công dụng khác của dầu mù u: tác dụng chống huyết khối, tác dụng kháng viêm và mau lành vết thương, tác dụng chống loạn nhịp tim, tác dụng ức chế trên HIV, tác dụng chống gốc tự do, chống oxy hóa, tác dụng đối với tia UV, điều trị viêm dây thần kinh

1.5.2 Hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u

Hoạt chất có tác dụng kích thích sự tái sinh mô giúp cho vết thương mau lành được chiết từ dầu mù u là các acid béo Phân tích thành phần hóa học các acid béo này cho thấy có chứa hàm lượng lớn acid béo không no đặc biệt là một số các acid béo đặc biệt mà các loại dầu thực vật khác không có như acid Eicosenoic.(Bảng 1.8) Cơ chế làm lành vết thương của acid béo này là làm gia tăng sự phát triển các nguyên bào sợi nên làm tăng sinh mô hạt và tác động lên sự tái tạo lớp thượng bì Kết quả các thử nghiệm khả năng làm mau lành vết thương, với hàm lượng 50 % hoạt chất tái sinh mô trong chế phẩm cũng đủ có tác dụng mau lành vết thương tốt

Bảng 1.8 Thành phần của hoạt chất tái sinh mô

Palmitic Palmitoleic Margaric Stearic Oleic Linoleic Linolenic Arachidic Eicosenoic

Behenic

13,830 0,200 0,103 14.750 39.980 29.350 0.209 0.800 0,2510

0.295

1.5.3 Tinh dầu tràm trà Úc

Tinh dầu tràm trà Úc (viết tắt là T.T.O.) là tinh chất dầu được cất kéo theo hơi nước từ

Melaleuca alternifolia, một loại cây tràm ở Úc T.T.O tinh khiết không màu hoặc

màu vàng nhạt, có mùi thơm dễ chịu đặc trưng T.T.O là một hỗn hợp phức tạp của gần 100 thành phần gồm monoterpen, sesquiterpen hydrocarbon và alcol của nó Thành phần chính là terpinen – 4 – ol, chiếm hơn 30 % T.T.O đã được sử dụng ở Úc hơn 80 năm để điều trị nhiễm khuẩn da cũng như các nhiễm khuẩn khác Thời gian gần đây nó đang trở nên nổi tiếng vì cho hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn so với nhiều kháng sinh thương mại đã có.[16],[71]

Nghiên cứu cho thấy thành phần tan trong nước của T.T.O., đặc biệt là terpinen – 4 –

ol và α−terpineol có thể điều hòa chức năng tế bào một cách chọn lọc trong suốt quá trình viêm, đặc biệt là hoạt động của bạch cầu đơn nhân, và sự đáp ứng cục bộ có thể kiểm soát các phản ứng viêm đối với những tác nhân bên ngoài tác động lên da T.T.O có khả năng hoạt hóa bạch cầu trung tính phát huy tối đa tác dụng trong phản ứng viêm cấp tính và giới hạn những tác nhân lạ, đồng thời ức chế sự sản sinh những chất trung gian gây viêm của bạch cầu đơn nhân và sự sản sinh superoxid, từ đó ngăn cản sự tổn thương mô do oxy hóa, hiện tượng này có thể được thấy trong nhiều tình trạng viêm mãn tính [38]

Tính kháng khuẩn, kháng nấm của T.T.O đã được chứng minh và có phổ kháng

khuẩn rất rộng (MRSA, Pseudomonas aeruginosa, Streptococci, ).[15],[18] T.T.O

được dùng trị mụn trứng cá, viêm da, viêm khớp, vết côn trùng cắn, nhiễm trùng đường hô hấp, đau nhức cơ, bị bỏng, T.T.O có tính gây tê nhẹ và đặc biệt có tính sát khuẩn làm giảm nguy cơ nhiễm trùng Khi điều trị, có thể bôi trực tiếp T.T.O lên vết bỏng, hoặc có thể dùng dưới dạng kem sát khuẩn không dính (non – grease antiseptic cream) [20],[44]

Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các thành phần của T.T.O trên một số vi

khuẩn cho thấy chỉ có terpinen - 4 - ol ức chế được sự phát triển của Pseudomonas aeruginosa Trong khi đó Bacteroides fragilis, Candida albicans, và Clostridium perfringens bị ức chế bởi tất cả các thành phần T.T.O Terpinen – 4 – ol ức chế tất cả

12/12 chủng vi khuẩn thử nghiệm Linalool và α −terpineol ức chế hầu hết vi khuẩn

thử nghiệm ngoại trừ P aeruginosa Thành phần ức chế kém nhất là ρ - cymeme, chỉ

ức chế được 4/12 chủng vi khuẩn thử nghiệm Thử nghiệm về khả năng sát khuẩn và tính nhạy cảm của da cho thấy T.T.O có khả năng sát khuẩn trên các vi khuẩn thử

nghiệm Strept hemolyticus và P aeruginosa sau 10 phút.[34],[36] Ở nồng độ sử dụng

10 %, T.T.O không gây kích ứng da T.T.O đã và đang được sử dụng như một liệu pháp phụ trong điều trị viêm tủy xương và những vết thương nhiễm khuẩn mãn tính trong những thử nghiệm lâm sàng nhỏ gần đây

Nghiên cứu về tác dụng kháng Candida của terpinen – 4 – ol và 1,8 – cineol trong T.T.O cho kết quả MIC 90 của terpinen – 4 – ol là 0,06 % (v/v) và của 1,8 – cineol là

4 % (v/v) Nhóm nghiên cứu này kết luận rằng terpinen – 4 – ol được xem là thành

phần chính cho hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo của T.T.O Từ đó cho thấy hợp

chất tinh khiết này hứa hẹn vai trò to lớn trong điều trị nhiễm Candida âm đạo [48],[58],[59]

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

Xây dựng tiêu chuẩn của nguồn nguyên liệu chủ yếu sử dụng để chế tạo màng gồm: (1) Tiêu chuẩn nước dừa (2) Tiêu chuẩn hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u (3) Tiêu chuẩn sinh học của tinh dầu tràm trà Úc

2.1.1 Xây dựng tiêu chuẩn nước dừa

a Đối tượng nghiên cứu: nước dừa lấy từ trái dừa khô Dừa khô có vỏ màu nâu, cơm

dừa đã dày, cứng Nước dừa lấy ra khỏi trái sau các khoảng thời gian: mới lấy, sau 1giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ

b Bố trí thí nghiệm

Qui mô: thử nghiệm trên 5 mẫu nước dừa ở 5 thời điểm như trên, thử nghiệm lặp lại

5 lần

Thời gian thực hiện: tháng 1/ 2008

Địa điểm: BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM

c Phương pháp nghiên cứu

Nguyên tắc: nước dừa có nguồn chất dinh dưỡng phong phú, là môi trường thuận lợi

cho nhiều loại vi khuẩn phát triển Nước dừa khi còn ở trong trái, được lớp vỏ dày bảo

vệ nên gần như vô khuẩn Tuy nhiên khi đập ra khỏi trái và tiếp xúc với môi trường bên ngoài nước dừa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn Các tạp khuẩn khi nhiễm vào nước dừa sẽ nhanh chóng sử dụng các nguồn dinh dưỡng, trong đó đặc biệt quan trọng là các yếu

tố vi lượng cần thiết cho sự phát triển của Acetobacter xylinum Chính vì vậy chúng

tôi xây dựng tiêu chuẩn nước dừa khô dựa trên tiêu chuẩn về độ nhiễm khuẩn cho phép, mà ở độ nhiễm khuẩn này không ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi

khuẩn Acetobacter xylinum

Phương pháp: khảo sát độ nhiễm khuẩn của nước dừa bằng cách đếm sống tổng số vi

khuẩn hiếu khí trong 1ml bằng phương pháp pha loãng và trải bản thạch

Tiến hành

Pha loãng nước dừa thành các nồng độ 1/ 10, 1/ 100, 1/ 1000, … Lấy 0,2 ml ở mỗi nồng độ cho vào một hộp petri Thạch đếm được đun chảy và để nguội đến 45 oC rồi

đổ vào hộp, lắc xoay tròn hộp để trộn vi khuẩn với thạch cho đều (khoảng 30 vòng),

để cho đông đặc Ấp hộp thạch ở 37 oC trong 72 giờ Ở độ pha loãng thích hợp mỗi vi

khuẩn sẽ phát triển thành 1 khóm vi khuẩn Chọn hộp có từ 30 - 300 khóm để đếm

tổng số khóm

Kết quả: tính kết quả theo công thức:

tổng số vi khuẩn/ ml nước dừa = tổng số khóm x độ pha loãng x 5

d Chỉ tiêu theo dõi

- Tổng số vi khuẩn sống / 1ml nước dừa

e Sản phẩm nội dung cần đạt: giới hạn tổng số vi khuẩn / ml nước dừa để sử dụng

làm nguồn nguyên liệu tạo màng BC

2.1.2 Xây dựng tiêu chuẩn hoạt chất tái sinh mô

a Đối tượng nghiên cứu

- Hoạt chất tái sinh mô chiết từ dầu mù u

b Bố trí thí nghiệm

Qui mô

- Thử nghiệm trên 5 mẫu hoạt chất tái sinh mô được chiết từ dầu mù u để xác định các

chỉ tiêu lý hóa và tác dụng sinh học

Thời gian: tháng 2-9/2008

Địa điểm: BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM, Trung tâm dịch

vụ phân tích thí nghiệm, Sở Khoa học và Công nghệ TP HCM , Bộ môn Dược lý

Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM

c Phương pháp nghiên cứu

c 1 Các thử nghiệm hóa lý

Xác định các chỉ tiêu lý hóa: đo tỷ trọng, xác định các chỉ số: chỉ số iod, chỉ số acid,

chỉ số xà phòng, chỉ số ester, chỉ số peroxyd, chất không xà phòng hóa (Phụ lục)

Xác định thành phần acid béo: dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC, do

Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở Khoa học và Công nghệ TP HCM thực

hiện

c 2 Các thử nghiệm sinh học th

Phương pháp thhhhử nghiệm độc tính bán cấp của hoạt chất tái sinh mô

Đánh giá độc tính bán cấp của hoạt chất tái sinh mô trên thú vật thử nghiệm sau khi cho thú vật dùng thuốc liên tục trong thời gian hai tháng

- Thú vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng chủng DDY, thuần chủng, khỏe mạnh, không

dị tật, giới tính ngẫu nhiên, trọng lượng 18 g – 22 g, do viện Pasteur cung cấp

Chuột mua về để ổn định 2 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm Đảm bảo điều kiện nuôi trong suốt thời gian thử nghiệm với thức ăn là cám viên do viện Pasteur cung cấp

• Thời gian theo dõi: 2 tháng

Đánh giá kết quả:

• Theo dõi thể trọng và tổng trạng chung: quan sát hình thái bên ngoài chuột trong

thời gian thử nghiệm như sự linh hoạt, ăn uống, phân…Theo dõi trọng lượng chuột mỗi 5 ngày

• Xét nghiệm máu: thực hiện các xét nghiệm vào thời điểm giữa và cuối đợt thử

nghiệm bao gồm:

- Xét nghiệm huyết học: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu

- Xét nghiệm sinh hóa: bao gồm các chỉ số đánh giá chức năng gan (Transaminase: SGOT, SGPT; bilirubin trực tiếp và gián tiếp) và các chỉ số đánh giá chức năng thận (BUN, creatinin)

Các xét nghiệm được thực hiện ở Khoa xét nghiệm Sinh hóa và Huyết học, Bệnh viện Chợ Rẫy TP Hồ Chí Minh

• Về tổ chức học: mổ chuột quan sát đại thể giữa và cuối đợt thử nghiệm và khi

chuột chết có nghi vấn trong quá trình thử nghiệm Mổ chuột lấy gan, thận, quan sát

vi thể dưới kính hiển vi kết hợp với chụp ảnh cuối đợt thử nghiệm Xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Khoa Y Trường Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh

Xử lý kết quả: Dùng các phép toán thống kê so sánh 2 phương sai trong MS – Excel,

(F-Test Two – Sample for Variances) để xử lý kết quả.[6]

Phương pháp thử tính kích ứng da của hoạt chất tái sinh mô và tinh dầu tràm

Dùng phương pháp thử tính kích ứng của dầu thực vật đối với da được áp dụng trong

chuyên đề Các phương pháp thử nghiệm sinh học in vivo qui định trong USP 28.[75]

Dùng 3 thỏ thử nghiệm, tiêm trong da HCTSM với liều 200 µl vào mỗi vị trí, mỗi thỏ tiêm 10 vị trí Quan sát vị trí tiêm sau 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ, HCTSM được xem là không gây kích ứng phải đạt các tiêu chuẩn trên tổng số 30 vết chích ở 3 thỏ như sau:

• Ban đỏ (erythema): không được quá 3 vị trí

• Phù (edema): không được quá 6 vị trí

Không được có vị trí nào có những phản ứng trên da rộng quá 10 mm

d Các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu sinh học

- Khả năng gây kích ứng da

e Sản phẩm nội dung cần đạt

Xác định được các chỉ tiêu lý hóa và sinh học của hoạt chất tái sinh mô

2.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn sinh học của tinh dầu tràm trà Úc

a Đối tượng nghiên cứu: tinh dầu tràm trà Úc được chiết từ cây tràm trà Úc

Phương pháp thử nghiệm tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm trà Úc

Vi khuẩn thử nghiệm: sử dụng các chủng vi khuẩn thường hay gây nhiễm các vết bỏng, vết thương mất da như Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, và chủng MRSA phân lập từ vết thương

Vi khuẩn được phân lập trên môi trường thích hợp 24 giờ (môi trường thử nghiệm

kháng sinh tiêu chuẩn 2 đối với thử nghiệm Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus và môi trường thạch Pseudomonas đối với thử nghiệm Pseudomonas aeruginosa) Lấy 3 – 5 khóm vi khuẩn cấy vào môi trường canh thang dinh dưỡng cho

thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2, ủ ở 35 oC trong 6 giờ Sử dụng vi khuẩn này pha một huyền trọc vi khuẩn có mật độ vi khuẩn vào khoảng 1 x 106 – 2 x106 CFU/ ml

Môi trường thử nghiệm: môi trường thạch Pseudomonas [4], môi trường thạch dinh

dưỡng cho thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn No2

Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường rắn: tạo những bản

thạch có chứa chất thử nghiệm với nồng độ tăng dần Chấm 1 µl vi khuẩn thử nghiệm với nồng độ 106 CFU / ml lên các bản thạch Sau khi ấp ở 37 ºC trong 24 giờ, quan sát

sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng mắt thường Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường

d C hỉ tiêu theo dõi

Tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm trên các vi khuẩn thường gây nhiễm vết thương

a Đối tượng nghiên cứu

• Chủng vi khuẩn tạo cellulose Acetobacter xylinum do Viện Sinh học nhiệt đới TP

Hồ Chí Minh cung cấp

Kiểm tra độ tinh khiết của giống vi khuẩn A xylinum, sau đó hoạt hóa giống để đạt

lượng vi khuẩn 108 CFU/ ml môi trường nuôi cấy và sử dụng nguồn giống này để thử nghiệm khảo sát môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giai đoạn nhân giống Môi trường khảo sát: sử dụng môi trường cơ bản sau đây và bổ sung pepton, glucose

ở những nồng độ khác nhau để xác định nồng độ thích hợp trong môi trường:

Amoni sulfat 0,5g Diamoni phosphat 0,3g Glucose 5 g/l

Nước dừa già vừa đủ 1000 ml

b Bố trí thí nghiệm

Qui mô: mỗi mẻ nhân giống với thể tích 8lít giống (nuôi cấy lắc), 30 lít (nuôi cấy

tĩnh) Xác định các thông số thích hợp cho qui trình nhân giống được thực hiện lặp lại

5 lần

Thời gian: tháng 1/2008 – 7/2008

Địa điểm: thử nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ, BM

Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM

c Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuôi cấy nhân giống gồm có:

- Khảo sát môi trường nuôi cấy nhân giống: nhằm xác định nguồn nitơ thích hợp và ảnh hưởng của yếu tố tăng trưởng

- Xác định các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến quá trình nhân giống như yếu tố thông khí trong quy trình nuôi cấy, pH môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng và thời gian nhân giống

- Xác định đường cong tăng trưởng để biết thời gian thu sinh khối thích hợp

Qui trình nhân giống gồm các giai đoạn:

Giai đoạn hoạt hóa giống: đây là giai đoạn chuyển giống từ trạng thái tiềm ẩn sang

giai đoạn tăng sinh (giai đoạn logarit) có khả năng tăng sinh nhanh và các đặc tính sinh hóa ổn định

- Hoạt hóa lần thứ nhất: lấy vi khuẩn trong môi trường thạch nghiêng của ống gốc

cho vào 50 ml môi trường nhân giống, cho vào máy lắc, nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ

- Kiểm tra giống: sau khi hoạt hóa, kiểm tra tính tinh khiết của giống Giống không được nhiễm vi khuẩn lạ, vi khuẩn A xylinum phải ở dạng hoạt hóa có hình dạng và kích thước đặc trưng: tế bào có dạng que hơi cong, hai đầu tròn hoặc dạng bầu dục dài

- Hoạt hóa lần thứ hai: giống vi khuẩn sau khi kiểm tra đạt tiêu chuẩn tinh khiết và

hình dạng đặc trưng được tiếp tục hoạt hóa lần thứ 2: cho giống vào môi trường nhân giống mới theo tỷ lệ nhân giống là 1/10, nuôi cấy trong máy lắc ở nhiệt độ 30 oC trong

72 giờ

- Đếm số vi khuẩn trong 1 ml môi trường ban đầu, đến khi đạt được số lượng vi khuẩn khoảng 108 vi khuẩn/ml môi trường, đây là giống đã hoạt hóa được sử dụng cho giai đoạn nuôi cấy nhân giống với thể tích môi trường lớn

Giai đoạn nhân giống: vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cho vào môi trường khảo sát

và nuôi cấy động trên máy lắc Sau các khoảng thời gian, xác định số lượng vi khuẩn trong 1 ml môi trường nuôi cấy

Khảo sát nguồn nitơ thích hợp cho quá trình nhân giống: khảo sát sự tăng trưởng của

A xylinum với 2 nguồn nitơ là cao chiết nấm men và pepton từ thịt Nuôi cấy vi khuẩn

ở các nồng độ chất thử nghiệm khác nhau, xác định hiệu quả nuôi cấy tính bằng sinh khối thu được (số vi khuẩn / ml môi trường nuôi cấy) và xử lý số liệu thống kê để đánh giá kết quả

Khảo sát pH thích hợp cho quá trình tăng trưởng: pH môi trường ảnh hưởng đáng kể

đến sự tăng trưởng của vi khuẩn Mỗi loài có một pH thích hợp nhất cho sự tăng

trưởng A xylinum là vi khuẩn có khả năng chịu được pH acid trong quá trình tăng

trưởng Vì vậy cần khảo sát xác định pH thích hợp cho qui trình nhân giống A xylinum Nuôi cấy động vi khuẩn trong các môi trường có pH khác nhau: pH 4,5; 5,5 ;

6; 6,5; 7,5 Đánh giá hiệu quả nuôi cấy bằng sinh khối thu được

Xác định thời gian thu sinh khối: sau khi xác định được môi trường thích hợp,tiếp tục

xác định lượng sinh khối vi khuẩn theo thời gian, từ đó xác định thời gian thu sinh

khối tối ưu trong giai đoạn tăng sinh

Khảo sát môi trường, điều kiện lý hóa quá trình nhân giống

Sơ đồ 2.1 Các giai đoạn nhân giống

Đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy nhân giống: đánh giá bằng sinh khối vi

khuẩn (số tế bào) thu được / ml môi trường

Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn: sử dụng 2 phương pháp sau:

(1) Phương pháp đếm trực tiếp tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: phương pháp sử

dụng buồng đếm hồng cầu

(2) Phương pháp đếm sống: đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

bằng phương pháp pha loãng và trải bản thạch

Sử dụng cả hai phương pháp để đánh giá sinh khối Với phương pháp sử dụng buồng

đếm hồng cầu cải tiến Neubauer cho kết quả nhanh chóng, dùng để xác định tổng số

vi khuẩn ở thời điểm ban đầu, sau đó kết quả được tiếp tục xác định bằng phương

pháp đếm sống

Giống A xylinum

Hoạt hóa lần 1

Hoạt hóa lần 2

Thu hoạch giống A

xylinum đã hoạt hóa

Thu hoạch giống cho giai đoạn lên men

d Các chỉ tiêu theo dõi

- Số lượng vi khuẩn / ml môi trường nhân giống

- Mức độ nhiễm vi khuẩn lạ

e Sản phẩm nội dung cần đạt: qui trình nuôi cấy nhân giống ổn định

2.3 Xây dựng qui trình tạo màng BC

a Đối tượng nghiên cứu

• Chủng vi khuẩn tạo cellulose Acetobacter xylinum từ giai đoạn nhân giống

• Môi trường khảo sát

Amoni sulfat 0,5g

Diamoni phosphat 0,3g

Nước dừa già vừa đủ 1000ml

Bổ sung đường glucose và pepton ở những nồng độ khảo sát khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ trong quá trình lên men thu BC

b Bố trí thí nghiệm

Qui mô: xác định các thông số thích hợp cho qui trình lên men được thực hiện lặp lại

5 lần Quá trình lên men tạo BC được thực hiện trong hộp nhựa kích thước 12cm x 22

cm x 10 cm Sau khi xác định được các điều kiện lên men và độ dày màng cần đạt sẽ tiến hành sản xuất thử với qui mô 5 mẻ/ lô, mỗi mẻ dùng 50 lít môi trường

Thời gian: từ 1/2008 đến 7/2008

Địa điểm: thử nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ, BM

Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM

c Phương pháp nghiên cứu

Lên men A xylinum thu màng BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Khảo sát các yếu tố

ảnh hưởng đến quá trình này cần nghiên cứu như nguồn dinh dưỡng, pH môi trường, lượng giống sử dụng ban đầu

Khảo sát nguồn dinh dưỡng: khảo sát nguồn carbon, nguồn nitơ, vai trò của nước

dừa già đối với quá trình tạo BC

Khảo sát điều kiện nuôi cấy

+ Tìm pH thích hợp: nuôi cấy A xylinum trong khoảng pH từ pH 4,5 đến pH 7,0 Xác

định pH tốt nhất cho hiệu suất tạo BC cao

+ Xác định lượng giống vi khuẩn thích hợp đưa vào môi trường lên men: thử nghiệm lên men vi khuẩn với những số lượng vi khuẩn ban đầu khác nhau: 104 CFU/ ml; 105 CFU/ ml; 106 CFU/ ml

Xác định hiệu suất BC thu được: màng BC sau khi tinh chế được sấy trong tủ sấy ở

105 oC, áp suất thường đến khối lượng không đổi (sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm một giờ trong tủ sấy so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg, theo Phụ lục

5, trang phụ lục 98, DĐVN IV, 2010),[4] được khối lượng BC khô So sánh hiệu suất tạo BC (g/l) của từng môi trường và các điều kiện khảo sát để tìm được môi trường và các thông số thích hợp cho năng suất tạo BC cao

Xây dựng qui trình lên men

Dịch nhân giống được cho vào môi trường lên men tạo BC sau đó cho vào hộp nhựa

đã được hấp tiệt trùng Nuôi cấy tĩnh trong bảy ngày, thu sản phẩm màng BC thô, sau

đó tinh chế màng

Cho vào các hộp nhựa

Giống A xylinum từ giai

đoạn nhân giống

Lên men

Nuôi cấy tĩnh

Khảo sát các điều kiện lên men

Sơ đồ 2.2 Các bước lên men A xylinum thu BC

d Các chỉ tiêu theo dõi

- Hiệu suất BC thu được

e Sản phẩm nội dung cần đạt

- Qui trình lên men thu BC

2.4 Xây dựng qui trình tinh chế màng BC thô

a Đối tượng nghiên cứu: màng BC được tạo thành sau quá trình lên men A xylinum

b Qui mô: mỗi lô 1500 màng

Thời gian: từ 5/2008 đến 11/2008

Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ, BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược,

ĐH Y Dược TP.HCM

c Xây dựng qui trình tinh chế màng BC thô

c 1 Phương pháp tinh chế màng BC thô

Sử dụng dung dịch kiềm mạnh để phá vỡ tế bào vi khuẩn và loại pepton còn lại trong môi trường nuôi cấy Quá trình xử lý được gia nhiệt để tăng thêm hiệu quả và rút ngắn thời gian xử lý Các bước tinh chế bao gồm:

Ngâm trong NaOH nóng/ 3 giờ, tiếp tục ngâm trong NaOH đến khi màng trắng

Ngâm màng trong HCl 1 %

Kiểm tra tạp chất, pH

Sơ đồ 2.3 Các bước tinh chế màng BC thô

Loại bỏ môi trường: tách lấy màng BC, ép màng bằng máy ép để loại bỏ môi trường

Ép màng loại bỏ môi trường

Trung hòa kiềm trong màng

Thu BC tinh chế Màng BC thô

- Phá vỡ và loại bỏ vi khuẩn trong mạng lưới cellulose: ngâm màng trong NaOH 3 %

nóng trong 3 giờ sau đó tiếp tục ngâm trong NaOH 3 % ở nhiệt độ phòng đến khi màng trắng Tiếp tục xử lý màng trong dung dịch HCl 1% để trung hòa NaOH cho tới

pH trung tính rồi ép màng loại bỏ nước Sau khi tinh chế, sấy màng trong tủ sấy để có các độ ẩm cần khảo sát

c 2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của màng

Tìm sự hiện diện của glucose trong màng BC sau khi tinh chế

Định tính glucose trong màng BC bằng thuốc thử Fehling Màng BC tinh chế 10 cm x

10 cm được cắt nhỏ, cho vào 50 ml nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện glucose trong dịch chiết màng Mẫu chứng âm

là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch D - glucose Phản ứng dương tính với

sự xuất hiện tủa nâu đỏ trong ống nghiệm

Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế

Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo tủa của protein với acid triclor acetic Màng BC tinh chế 10 cm x 10 cm được cắt nhỏ, cho vào 50 ml nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng dung dịch acid triclor acetic 1 % để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1 % (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn)

và màng BC thô Phản ứng dương tính khi cho tủa đục So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein

Xác định pH của màng BC tinh chế: sau khi tinh chế pH của màng phải nằm trong

khoảng pH trung tính

Đo pH dịch chiết màng bằng máy đo pH Cân và cho màng BC vào 1 bình nón chứa nước khử khoáng theo tỷ lệ màng và nước là 1:100 (khối lượng / thể tích) Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Lấy dịch chiết và đo pH dung dịch ở mỗi bình bằng pH kế, chỉnh pH điện cực ở 2 khoảng pH là pH 4 và pH 7

Tìm sự hiện diện của vi khuẩn trong màng BC

Khảo sát màng BC dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét

Quan sát và so sánh màng BC thô chưa xử lý và màng BC đã qua xử lý để xác định

sự hiên diện của vi khuẩn trong màng BC trước khi tinh chế và sau khi tinh chế

Chuẩn bị mẫu:

Chuẩn bị mẫu để quan sát dưới kính hiển vi quang học: cắt màng thô và màng tinh chế thành những lát mỏng, nhuộm với fuschin

Chuẩn bị mẫu dùng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JOEL-JSM-550: màng

BC thô và màng BC tinh chế được đông khô sau đó được phủ một lớp bạch kim mỏng trong môi trường chân không

Quan sát: quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét JOEL-JSM-550 và kính hiển vi

quang học

Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần thơ và Bộ môn Vi sinh Khoa Dược ĐH Y Dược TP HCM

d Các chỉ tiêu theo dõi

- pH của màng, các tạp chất glucose, vi khuẩn, protein của vi khuẩn và dư lượng pepton trong môi trường nuôi cấy

e Sản phẩm nội dung cần đạt

- Qui trình tinh chế màng ổn định

2.5 Xây dựng qui trình tạo màng thành phẩm Acetul, qui trình đóng gói màng

và tiệt trùng màng bằng tia gamma

a Đối tượng nghiên cứu: màng thành phẩm Acetul

c1 Xây dựng qui trình tạo màng thành phẩm Acetul

Xác định các tiêu chuẩn của màng BC tinh chế sử dụng chế tạo màng trị bỏng

Màng BC tinh chế dùng để tạo màng trị bỏng Acetul phải đạt được những tính chất sau:

- Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt, có khả năng cản khuẩn

- Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và HCTSM

Để đạt các tiêu chuẩn này cần khảo sát:

- Màng BC thô có độ dày thích hợp Tạo màng BC có độ dày khác nhau bằng cách

sử dụng lớp môi trường nuôi cấy tĩnh có độ dày khác nhau Môi trường được cho vào các hộp nuôi cấy với độ dày lớp môi trường như khác nhau để tạo lớp màng BC có độ dày cần khảo sát

- Độ ẩm thích hợp của màng BC sau khi đạt các tiêu chuẩn về độ tinh khiết

Tất cả các thông số này sẽ được khảo sát đồng thời để xác định thông số thích hợp nhất

Khảo sát độ ẩm thích hợp của màng BC dùng để tạo màng trị bỏng: màng BC thu

được từ các lô được tinh chế và làm khô tạo màng ở những độ ẩm khác nhau bằng cách sấy màng trong tủ sấy và xác định độ ẩm, sau đó thử nghiệm khả năng hút nước của màng để xác định độ ẩm thích hợp của màng BC tinh chế sử dụng chế tạo màng trị bỏng

Phương pháp khảo sát khả năng hút nước của màng BC tinh chế

Mô hình thử nghiệm: màng BC ở những độ ẩm khác nhau được ngâm ngập trong

nước, sau những khoảng thời gian xác định 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ màng được vớt ra khỏi nước bằng kẹp, giữ màng cho đến khi nước trên màng không còn chảy xuống nữa, cân lại màng để xác định lượng nước hút được sau những khoảng thời gian thử nghiệm

Phối hợp các hoạt chất với màng BC tinh chế tạo màng trị bỏng Acetul

Chế tạo màng BC phối hợp với hoạt chất tái sinh mô và các tá dược để đáp ứng yêu

cầu thể chất mềm, mịn, trắng, trong, bám dính vào da tốt, không bị khô nhanh khi để ngoài không khí, có khả năng che phủ tốt

Tiến hành

 Chuẩn bị màng: màng BC tinh chế có kích thước 10 cm x 10 cm Tiệt trùng màng

BC tinh chế bằng phương pháp nhiệt ẩm trong autoclave 121 oC / 20 phút

 Chuẩn bị hỗn hợp hoạt chất tái sinh mô, tinh dầu tràm và tá dược: phối hợp tá

dược với HCTSM, tinh dầu tràm ở những nồng độ khác nhau

 Phối hợp màng BC tinh chế với HCTSM và tá dược ở các nồng độ khảo sát

 Đánh giá chất lượng màng ở giai đoạn này:

- Khả năng thấm hút nước và hoạt chất tái sinh mô

- Tính chất cảm quan: phải đạt tính mềm mại, dính sát vào da

- Khả năng thông thoáng của màng

- Tác dụng điều trị bỏng

Các yếu tố này sẽ là cơ sở để lựa chọn tá dược và nồng độ tá dược thích hợp Sau khi phối hợp với hoạt chất và tá dược, đóng gói màng trong bao PE và bao nhôm, hàn kín

và tiệt trùng bằng tia gamma

c2 Đánh giá khả năng thấm hút nước và tính thông thoáng của màng Acetul

Phương pháp khảo sát khả năngthấm hút nước của màng Acetul

Mô hình thử nghiệm: thử khả năng hút nước của màng Acetul trên những bản thạch

bán lỏng chứa 0,2 % thạch, kích thước bản thạch 20 cm x 15 cm dày 2 cm Ở nồng độ này bản thạch chứa hàm lượng nước lớn (99,8 %) và có một bề mặt rất ẩm ướt, gần giống bề mặt vết thương

Màng thử nghiệm được cân sau đó đặt màng trên những bản thạch bán lỏng, sau những khoảng thời gian xác định cân lại màng để xác định lượng nước đã thấm hút vào màng

Phương pháp khảo sát khả năng cho thoát hơi nước của màng

Khả năng cho thoát hơi nước của màng được tính dựa trên lượng nước mất đi theo thời gian của màng trong tình trạng đã hút nước Các màng thử nghiệm được đặt trên những bản thạch bán lỏng 12 giờ để màng hút nước và có độ ẩm tối đa Lấy màng và cân, ghi trọng lượng ban đầu, sau đó đặt màng thử nghiệm vào những hộp nhựa không đậy nắp Đặt hộp ở nhiệt độ 37 oC, sau những khoảng thời gian khác nhau cân lại trọng lượng màng Tính lượng nước mất đi theo thời gian Thử nghiệm trên màng Acetul và màng BC tinh chế

c3 Thử nghiệm in vivo tác dụng điều trị vết bỏng của màng Acetul

Thú thử nghiệm: thỏ trắng, mắt đỏ không phân biệt giới tính, trọng lượng từ 2,5 kg-

2,8 kg/ thỏ Dùng 15 thỏ chia làm 3 lô Thỏ được cạo sạch lông ở vùng lưng 48 giờ trước khi thử nghiệm

Phương pháp

Mô hình gây bỏng ở thỏ [10]

Chọn mô hình gây bỏng bằng nhiệt khô với các điều kiện thí nghiệm như sau:

 Nhiệt độ gây bỏng: 90 oC, thời gian: 10 giây

 Độ bỏng: II nông

 Diện tích bỏng: 18-20 %

 Vị trí gây bỏng: vị trí gây bỏng là vùng hai bên sống lưng thỏ (vì ở vùng này, da tương đối rộng và bằng phẳng, da tương đối dày nên không gây thương tổn quá nặng cho các cơ quan nội tạng)

 Dụng cụ gây bỏng: dùng một bình nhôm hình trụ có đường kính đáy là 5 cm, trong

đó có đổ đầy nước sôi, nhiệt độ đáy bình khoảng 90 oC Dùng một quả cân 1 kg đè lên bình tạo một áp lực ổn định, giúp đáy bình ép sát da thỏ

 Chẩn đoán độ sâu của vết thương bỏng: tiêm tĩnh mạch vành tai thỏ đã được gây bỏng 12-15 ml dung dịch natri fluorescein Quan sát vết thương phát quang dưới đèn Wood trong phòng tối

 Khảo sát mức độ tổn thương da sau khi gây bỏng: quan sát sự phát quang của vết

thương dưới đèn Wood trong phòng tối Nếu vết bỏng sâu sẽ không phát quang, ngược lại vết bỏng nông sẽ có phát quang màu vàng

Điều trị bỏng

Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 5 thỏ, mỗi thỏ 2 vết bỏng Thỏ được thay băng mỗi 24 giờ 1 lần trong vòng 15 ngày đầu, bắt đầu ngay sau khi gây bỏng Theo dõi điều trị trong vòng 22 ngày

Lô 1: đắp màng BC phối hợp hoạt chất tái sinh mô

- Giải phẫu bệnh lý: sau khoảng thời gian điều trị, giải phẫu bệnh lý vùng da bị bỏng

đã được đắp màng, xem xét mức độ biểu mô hóa và tính bất thường về mặt tế bào học Thực nghiệm được tiến hành tại BM Giải phẫu Bệnh, Trường Đại Học Y Dược

TP Hồ Chí Minh

c4 Qui trình đóng gói màng và tiệt trùng màng

Qui trình đóng gói

Chuẩn bị bao bì: màng PE, bao nhôm

- Tạo bao nhôm: cắt màng bao nhôm với kích thước 15cm x 15 cm, ép tạo thành túi

- Cắt màng PE tạo bao với kích thước 12 cmx 12 cm

Đóng gói

- Màng thành phẩm được đặt trong bao PE, hàn kín bao

- Bao PE chứa màng sẽ tiếp tục được đặt trong bao nhôm, sau đó hàn kín bao nhôm

- Quá trình thao tác được thực hiện trong tủ Laminar

- Qui mô đóng gói: mỗi mẻ khoảng 500 màng

Qui trình tiệt trùng

Màng thành phẩm Acetul được tiệt trùng bằng tia bức xạ

- Thiết bị chiếu xạ: nguồn Cobalt – 60: SVST – Co 60/B

- Loại bức xạ sử dụng: tia gamma

- Suất liều: 1,3 KGy/ h, liều kế đo: ECB

d Các chỉ tiêu theo dõi

- Kiểm nghiệm màng dựa trên các chỉ tiêu màng bán thành phẩm và thành phẩm, tác dụng làm mau lành vết thương của màng Acetul trên thú thử nghiệm

e Sản phẩm nội dung cần đạt

- Màng thành phẩm Acetul đạt tiêu chuẩn cơ sở

2.6 Xây dựng qui trình kiểm nghiệm màng BC tinh chế và màng thành phẩm Acetul (tiêu chuẩn cơ sở)

a Đối tượng thử nghiệm: màng BC tinh chế và màng thành phẩm Acetul

b Bố trí thí nghiệm

Thời gian: tháng 10/2008

Địa điểm: BM vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM

c Phương pháp thử nghiệm

c.1 Xây dựng qui trình kiểm nghiệm màng bán thành phẩm

Phương pháp xác định kích thước màng và các đặc điểm về cảm quan

- Dùng thước panme đo độ dày của màng, thước chia cm đo kích thước

- Dùng tay sờ kiểm tra tính mềm mại của màng và đắp lên da kiểm tra độ bám dính

Phương pháp khảo sát trọng lượng khô của màng BC tinh chế

Màng BC tinh chế kích thước 10 cm x 10 cm được làm khô bằng cách sấy ở 104 oC đến trọng lượng không đổi [4], sau đó cân và xác định khối lượng màng khô

Xác định độ ẩm của màng

Chọn mẫu: chọn màng ngẫu nhiên10 màng BC tinh chế Xác định khối lượng màng

trước khi sấy (a) và sau khi sấy khô ở 104 oC đến trọng lượng không đổi (b), từ đó tính độ ẩm của màng A % = [(a - b ): a] x 100