nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide ngoại bào của chủn nấm men đất lipomyces strakeyi pt5.1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ SINH POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO CỦA CHỦNG NẤM MEN ĐẤT Lipomyces

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-
 -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG

VÀ SINH POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO CỦA

CHỦNG NẤM MEN ĐẤT Lipomyces starkeyi PT 5.1

Người hướng dẫn: PGS TS Tống kim Thuần Sinh viên thực hiện: Tuấn Thị Thanh Vân Lớp: KSCNSH 0601 – K13

HÀ NỘI – 2010

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tống Kim

Thuần đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bài khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể nghiên cứu khoa học của phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học và các phòng, ban khác trong Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

Nhân dịp này tôi cũng tỏ lòng cám ơn chân thành tới các thầy, cô trong khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong quá trình học tập cũng như tạo điều kiện cho tôi được hoàn thành tốt quá trình thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi đến lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành bài khóa luận này

Hà nội, ngày 25 tháng 05 năm 2010

Sinh Viên

Tuấn Thị Thanh Vân

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

CÁC TỪ VIẾT TẮT

1.1.1 Lịch sử về nghiên cứu giống nấm men Lipomyces 3 1.1.2 Hình thái và sinh sản vô tính của giống nấm men

1.1.3 Chu trình sống và quá trình hình thành bào tử

1.1.4 Đặc tính sinh hóa của nấm men Lipomyces 6

1.2 Chức năng của màng nhầy của vi sinh vật 7

1.3 Các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng

1.4 Tiềm năng ứng dụng của polysaccharide sinh học này 11

1.5 Các nghiên cứu về polymer sinh học trên thế giới, Việt

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 19

điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh

2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí 19 2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 20

2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn

3.1 Đặc điểm sinh học của chủng nấm men Lipomyces starkeyi

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí 26

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn Nitơ 30

(NH 4 ) 2 SO 4 33

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon 34

3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ C : N lên khả năng sinh

3.4 Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide 39

3.5 Quy trình thu sinh khối quy mô phòng thí nghiệm từ

3.6 Nghiên cứu tách chiết polysaccharide ngoại bào của chủng

3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi : dịch màng

3.8 Quy trình tách chiết polysaccharide ngoại bào của chủng

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 1

Mở đầu

Lĩnh vực khoa học và công nghệ vật liệu mới đã và đang đem lại những sản phẩm quan trọng, đồng thời tạo ra những xu hướng phát triển mới Thí dụ, các lĩnh vực như vật liệu sinh học (Biomaterials) và vật liệu nano (Nanomaterials) đang có những bước phát triển mạnh mẽ Các loại vật liệu sinh học mới này có khả năng ứng dụng rộng rãi, từ những ứng dụng thông thường, cho tới những ứng dụng đặc biệt Các vật liệu này sẽ thông minh hơn,

có nhiều chức năng hơn, thân thiện và thích hợp với nhiều điều kiện môi trường Trong đó loại vật liệu mới là polymer sinh học đã và đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu

Polysaccharide sinh học là thành phần quan trọng có trong các cơ thể sống như thực vật, tảo biển, vi sinh vật… Nó đóng vài trò như vật liệu dự trữ năng lượng, vật liệu cấu trúc, vật liệu hình thành gel của nội và ngoại bào… Polymer sinh học được hình thành từ các quá trình biến đổi sinh học như: quá trình hoạt động sống của vi sinh vật, quá trình sinh trưởng của thực vật, động vật…Các polymer sinh học rất đa dạng về chủng loại, cấu trúc phân tử Khác với polymer tổng hợp, để biết được cấu trúc của polymer sinh học chúng ta phải dựa vào kết quả nghiên cứu, phân tích Tuy nhiên, điều này không làm hạn chế tiềm năng sử dụng của các polymer sinh học trong các ứng dụng thực tiễn bởi tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường hơn so với polymer tổng hợp [12]

Ngoài ra, polysaccharide sinh học cũng là các polyme có cấu trúc mạch dài nên nó có các tính chất cơ lý tốt cho các ứng dụng như: kéo sợi, màng, keo, chất làm dầy, hydrogel (gel ướt), tác nhân truyền dẫn thuốc…Loại vật liệu này được hình thành từ các hợp chất sinh học nên nói chung nó là vật liệu

an toàn, không có tính độc và có khả năng phân hủy sinh học tốt Loại

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 2

polymer này được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh, dược, thực phẩm, vật liệu dễ phân hủy sinh học…[9]

Nói đến polysaccharide từ vi sinh vật thì không thể không nói đến các

vi sinh vật sinh màng nhầy, đó là những vi sinh vật mà bên ngoài thành tế bào

còn có lớp nhầy hay dịch nhầy dạng keo, có độ nhầy bất định (hay còn gọi là

giác mạc) Màng nhầy này chủ yếu cấu tạo từ polysaccharide, ngoài ra còn có màng nhầy cấu tạo từ polypeptide và protein [31] Trong đất chứa rất nhiều vi sinh vật sinh màng nhầy Nấm men Lipomyces cũng là một trong những nhóm vi sinh vật sinh màng nhầy tiêu biểu trong đất Khi phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất, nấm men tiết ra các chất nhầy mang bản chất polysaccharide

Vì vậy, hướng nghiên cứu khả năng sinh polysaccharide ngoại bào của

chủng nấm men đất Lipomyces PT 5.1 là rất cần thiết Do đặc tính sinh học

của vi sinh vật là sinh sản và tổng hợp polyme ngoại bào rất nhanh (3-7 ngày) Nên nếu chúng ta tuyển chọn được các điều kiện thích hợp nhất để khả năng sinh polysacaride của chủng là cao nhất và nghiên cứu được phương pháp tách chiết, tinh sạch có hiệu xuất cao thì sẽ đem lại một nguồn polysaccharide

vi sinh vật rất dồi dào Nó cũng mở ra tiềm năng ứng dụng rộng lớn polymer

vi sinh vật này vào các lĩnh vực khác nhau như Y tế, Nano-Sinh học, Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm Trên cơ sở những phân tích, đánh giá trên,

chúng tôi tiến hành Đề tài: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh

polysaccharide ngoại bào của chủng nấm men đất Lipomyces starkeyi PT 5.1

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPOMYCES :

1.1.1 Lịch sử về nghiên cứu giống nấm men Lipomyces :

Starkeyi – nhà vi sinh vật học người Mỹ là người đầu tiên phát hiện ra

Lipomyces [18] Khi nghiên cứu về chúng, ông phát hiện ra rằng: tế bào của

chúng có chứa giọt mỡ lớn (tên Lipomyces cũng bắt nguồn từ đặc điểm này),

chúng có khả năng hình thành bào tử Song do kiểu tạo túi này đặc biệt nên ông phủ nhận việc mô tả Lipomyces như một số nấm men đất đã biết:

Candida pulcherria, Torula lipofera [18], mà tách chúng thành một nhóm riêng

Đến năm 1952, Lodder và Kreger – van – Rij quyết định tách chúng

thành một nhóm mới thuộc họ Endomycetoideae, họ phụ Lipomyces và chỉ có một chi Lipomyces [13] Sau đó còn rất nhiều tranh cãi xung quanh việc phân loại Lipomyces [10,13]

Sau khi nghiên cứu chi tiết chủng Lipomyces được phân lập từ các vùng

đất khác nhau của Liên Xô cũ, Kraxilnikov và Babieva [9] đã phân chia những chủng này thành hai nhóm:

+ Zygo Lipomyces: nấm men tạo túi có chứa 4 bào tử

+ Lipomyces: nấm men tạo túi có chứa nhiều bào tử

Hai nhóm này khác nhau theo một loạt dấu hiệu: Khả năng tạo túi bào

tử, hình thái bào tử, đặc điểm hình thái và dựa vào những đặc điểm được công

nhận thời đó mà Zygo Lipomyces được chia thành hai loại [11]:

+ Z tetrasporus: Sử dụng glixerin, không đồng hoá lactoza

+ Z lactorus: không sử dụng glixerin nhưng đồng hoá lactoza

Nhờ những nghiên cứu sâu của các nhà khoa học về thành phần đường đơn trong polysaccharide ngoại bào của Lipomyces, rồi những nghiên cứu của các nhà khoa học Hà Lan về mối tương quan giữa thành phần polysaccharide

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 4

ngoại bào và cấu tạo bề mặt của bào tử túi [26] là những tiêu chuẩn được sử

dụng trong khoá phân loại nấm men do Lodder và Kreger – van – Rij đưa ra

vào năm 1970 Trong khoá phân loại này, các tác giả đã đưa thêm loài mới là

Lipomyces kononenkoae với đặc tính màng ngoài bào tử nhẵn, thường không đồng hoá eritrit, khác hẳn Lipomyces stakeyi có khả năng đồng hoá eritrit, màng ngoài bào tử có nếp nhăn

Sau này nhờ những nghiên cứu mới các tác giả phủ nhận việc tách

Lipomyces có 4 bào tử thành một nhóm riêng là Zygo Lipomyces [5] Bởi vì không có sự khác nhau giữa việc tạo nang ở Lipomyces có 4 bào tử và

Lipomyces có nhiều bào tử Hai loài nấm men Z tetrasporus và Z lactorus

mà nang có 4 bào tử giờ đây được hợp lại thành 1 loài Lipomyces tetasporus

Đến năm 1975, loài thứ năm Lipomyces anomalus đã được phát hiện

Ngày nay, chi Lipomyces gồm có 5 loài Trong đó loài L tetrasporus túi chứa 4 bào tử, bốn loài kia (L anomalus, L stakeyi, L lipofer, và

L kononenkoae) nang chứa nhiều bào tử

1.1.2 Hình thái và sinh sản vô tính của giống nấm men Lipomyces:

Tế bào Lipomyces khá to, rất dễ phân biệt với các loại khác, đường kính

tế bào vào khoảng 10 µm, một số trường hợp còn lớn hơn thế nữa Tế bào phần lớn có hình tròn, trứng, hoặc ovan, ít khi hình trụ dài Những chủng trong cùng một loài mà được phân lập từ các vùng đất khác nhau thì kích thước có thể thay đổi rất lớn Thậm chí cũng có sự thay đổi kích thước của một chủng khi được cấy trên các môi trường khác nhau Thỉnh thoảng trong chủng mới cấy xuất hiện những tế bào riêng biệt rất to chứa vài nhân Chủng

L lipofer mọc trên môi trường khoai tây chứa 6 nhân và có kích thước lớn: đường kính 20 µm Nhưng khi cấy truyền những tế bào này vào môi trường mới thì chúng lại trở về trạng thái kích thước ban đầu và chỉ có một nhân Ở những tế bào non cơ cấu tế bào đồng nhất, khi tế bào già chứa nhiều nhân và xuất hiện giọt mỡ lớn [1]

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 5

Trên môi trường thạch đặc Lipomyces phát triển ở dạng những khuẩn

lạc có mầu trắng sữa Trong ống thạch nghiêng màng nhầy có thể chảy xuống đáy ống nghiệm Kéo dài thời gian nuôi cấy quan sát thấy bề mặt khuẩn lạc ngả mầu vàng nâu Đó là dấu hiệu của sự hình thành bào tử Tuy nhiên vẫn có những trường hợp có màu nâu không liên quan tới việc tạo bào tử [1] Một số

chủng Lipomyces có hai loại khuẩn lạc: loại có màng nhầy và loại không có

màng nhầy Sự xuất hiện màng nhầy phụ thuộc vào nồng độ nitơ trong môi trường Môi trường chứa nhiều nitơ thì khuẩn lạc không có màng nhầy và ngược lại Kích thước màng nhầy thay đổi theo độ tuổi, thành phần môi trường và chủng nấm men Bề dày của màng nhầy phụ thuộc vào tỷ lệ C/N trong môi trường Tỷ lệ này càng cao thì màng nhầy càng lớn, thậm chí có thể lớn gấp đôi tế bào [1]

Cấy chuyền Lipomyces trên môi trường dinh dưỡng, những tế bào già bắt đầu nảy chồi nhiều phía Lipomyces nảy chồi theo kiểu chân đế rất đặc

trưng cho các loại nấm men có túi Ranh giới giữa tế bào mẹ và tế bào con có thể khác nhau và nhiều khi nhìn thấy rất rõ Chồi con sau khi phát triển rời khỏi tế bào mẹ và sinh trưởng thành tế bào trưởng thành

Quá trình tạo khuẩn ty giả chỉ thấy ở một số loài, thường thấy ở

L anomalus và một số chủng L kononenkoae Khuẩn ty giả là những chuỗi

tế bào hình ovan gắn nối với nhau bằng những chân đế tương đối rộng Chuỗi này có thể đâm nhánh và tạo thành những búi Khi già khuẩn ty giả phân chia thành những tế bào riêng [1]

1.1.3 Chu trình sống và quá trình hình thành bào tử của nấm men

Lipomyces:

Lipomyces là chi nấm men thuộc họ Lipomycetaceae có khả năg hình

thành túi dao động từ 4 – 8 bào tử hoặc nhiều hơn Hình dạng, số lượng và

kích thước bào tử khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài Lipomyces khác nhau

Thường thì túi bào tử được sinh ra nhờ các chồi hoạt động của tế bào mẹ Có

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 6

hai dạng túi: túi kiểu ngồi, túi kiểu không đối xứng hay túi hình quả lê Cũng

có trường hợp chính tế bào mẹ chuyển thành túi chứa bào tử, nhưng rất ít khi gặp kiểu tạo túi này [1]

1.1.4 Đặc tính sinh hóa của nấm men Lipomyces :

* Màng nhầy và polysaccharide ngoại bào:

Hầu hết các chủng, loài Lipomyces đều có khả năng sinh màng nhầy và tiết polysaccharide vào môi trường Đại diện duy nhất của Lipomyces không sinh màng nhầy là L anomalus Slodki và Wickerham đã phát hiện thấy trong thành phần polysaccharide ngoại bào của một số chủng Lipomyces chỉ chứa

maltoza và axit gluconic, một số chủng loại khác có thêm galactoza trong

thành phần [17] Đặc tính này được dùng để phân loại Lipomyces đến loài

Polysaccharide sinh học là thành phần quan trọng có trong các cơ thể sống như thực vật, tảo biển, vi sinh vật… Nó đóng vài trò như vật liệu dự trữ năng lượng, vật liệu cấu trúc, vật liệu hình thành gel của nội và ngoại bào… Polymer sinh học được hình thành từ các quá trình biến đổi sinh học như: quá trình hoạt động sống của vi sinh vật, quá trình sinh trưởng của thực vật, động vật…Các polymer sinh học rất đa dạng về chủng loại, cấu trúc phân tử Mức

độ đa dạng của chúng phụ thuộc vào từng quá trình biến đổi sinh học nhất định Khác với polymer tổng hợp, để biết được cấu trúc của polymer sinh học chúng ta phải dựa vào kết quả nghiên cứu, phân tích Tuy nhiên, điều này không làm hạn chế tiềm năng sử dụng của các polymer sinh học trong các ứng dụng thực tiễn do các polymeơr sinh học có nhiều tính ưu việt so với polymer tổng hợp như: tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường Loại polymer này được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh, dược, thực phẩm, vật liệu dễ phân hủy sinh học…[12]

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 7

Ngày nay, các nhà khoa học quốc tế cũng như trong nước rất chú ý tới loại vật liệu polymer có nguồn gốc polysaccharide sinh học do chúng là nguồn vật liệu có thể tái tạo, duy trì được và đặc biệt là an toàn

Ngoài việc sử dụng các chất ngoại bào dưới dạng thô như trên còn có nhiều công trình nghiên cứu đi sâu vào việc tách chiết và phân tích cấu trúc của polymer sinh học [9] Trong công trình nghiên cứu này, nhóm tác giả đã thành công trong việc tách chiết và phân tích cấu trúc của polysaccharide của

vỏ nhãn Trong đó hàm lượng của các phân tử monosaccharide được xác định bằng phương pháp sắc ký khí (GC): L-arabinofuranose (32.8%), D-glucopyranose (17.6%), D-galactopyranose (33.7%) và D-galacturonic acid (15.9%), cầu nối liên kết glycoside xác định bằng phương pháp methyl hóa và sắc ký khí/ phổ khối đã tìm ra cấu trúc mạch chính ? →5)-L-Araf-(1→, →6)-D-Glcp-(1→, →3)-D-Galp-(1→, →3)-D-GalpA-(1→, →6)-D-Galp-(1→, xác định cấu hình α, β của các monosaccharide bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và xác định khối lượng phân tử polymer bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) là 420 kDa Nghiên cứu về tính chất hóa lý của polysaccharide gum tách chiết từ Yanang (dây sương sâm) [19] cũng cho thấy những tiềm năng ứng dụng và sản xuất công nghiệp các polysaccharide gum

tự nhiên

* Lipit :

Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của Lipomyces là khả

năng tổng hợp lipit cao và tích lũy trong tế bào dưới dạng giọt mỡ (bản thân tên gọi của nấm men cũng thể hiện tính chất này) [1] Cần phải nhấn mạnh

rằng Lipomyces không tiết ra những giọt mỡ ra ngoài môi trường như

Rhodotorula [2] Một trường hợp duy nhất người ta phát hiện được 3 chủng

Lipomyces phân lập từ đất Liên Xô cũ có khả năng tiết lipit ra ngoài môi trường, nhưng khả năng này lại mất đi khi trải qua một năm giữ giống triên thạch nghiêng [3]

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 8

Các loài Lipomyces khác nhau tích lũy từ 10 tới 65- 75% chất béo trên một gam trọng lượng khô: chiếm 18,6 – 58,6% chất khô ở L lipofer, 40- 43%

ở L starkeyi [21] Qúa trình tổng hợp, tích lũy lipit này chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố quan trọng, đặc biệt là tỷ lệ C/N trong môi trường [21] Trong môi trường dần hết nguồn cacbon thì kích thước giọt mỡ sẽ giảm dần Sự tích lũy lipit tăng lên khi tổng hợp glycogen xảy ra yếu và không có mặt của enzyme lipaza ngoại bào [28]

* Amilaza ngoại bào:

Trong các đặc tính sinh hóa của Lipomyces, đặc tính sinh amilaza giữ

vai trò quan trọng nhất Hiện nay, có khoảng 25% loài nấm men có khả năng đồng hóa tinh bột, trong đó Lipomyces có hệ số cao nhất, đạt 0,6g sinh khối

khô trên 1g tinh bột [1] Hoạt tính amilaza của các loài Lipomyces là khác nhau và đạt cao nhất ở L kononenkoae là 100% và thấp nhất ở L anomalus 18% Sinh trưởng của Lipomyces trên tinh bột và glucoza xảy ra như nhau, ngoại trừ pha lag ở tinh bột bị kéo dài thêm Amilaza của L kononenkoae

gồm một phức hệ enzyme ngoại bào đảm bảo chuyển hóa hoàn toàn tinh bột trong quá trình sinh trưởng và tạo sinh khối [1] Đặc tính này đã đưa

L kononenkoae vào trong số những chủng sản xuất protein đơn bào từ tinh bột [1]

Ở Việt Nam đã có công trình của PGS TS Tống Kim Thuần và Đỗ Thanh Hoa về khả năng phân giải tinh bột và hoạt tính amilaza của các chủng

nấm men Lipomyces, tuy nhiên hoạt tính amilaza thu được thấp chỉ có 105

đv/ml dịch nuôi cấy [28]

1.2 Chức năng của màng nhầy của vi sinh vật:

- Bảo vệ vi sinh vật khỏi sự tổn thương khi khô hạn, bảo vệ tế bào tránh khỏi hiện tượng thực bào của bạch cầu, nhờ đó chúng có khả năng gây bệnh Ngược lại, khi không có màng nhầy chúng nhanh chóng bị bạch cầu tiêu diệt

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 9

- Màng nhầy là nơi dự trữ năng lượng, đề phòng khi thiếu thức ăn có thể sử dụng vỏ nhầy như một nguồn chất dinh dưỡng Khi môi trường cạn kiệt

vi sinh vật sẽ tiêu thụ dần chất dinh dưỡng có trong vỏ nhầy và làm cho vỏ nhầy bé lại dần

- Một số vi khuẩn hình sợi như Thiobacteria dùng vỏ nhầy để bám vào các giá thể dưới nước Còn vi khuẩn Streptococcus salivarius, S mutans đã

sinh ra enzym hexozotransfeara, giúp cho vi khuẩn bám được trên bề mặt của răng để lên men đường tạo axit lactic làm hỏng men răng gây sâu răng [14]

- Một số vi sinh vật sắt dùng màng nhầy để tích luỹ sắt

- Ngoài ra màng nhầy còn có rất nhiều chức năng quan trọng đang được nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt là khả năng cải tạo đất trống đồi trọc Đối với những vùng đất nghèo chất dinh dưỡng và khô cằn, chúng có khả năng tạo mùn cho đất, giữ đất, giữ nước và làm bền vững cấu tượng đất, chống xói mòn

1.3 Các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng sinh polysaccharide:

* Nguồn cacbon:

Lipomyces sử dụng nguồn cacbon rất phong phú: tinh bột, rượu, đường đơn, đường kép, dextrin, axit hữu cơ…[1] Nghiên cứu khả năng đồng hóa

của 300 chủng Lipomyces ở 32 nguồn cacbon người ta nhận thấy không

chủng nào sử dụng D- riboza và axit lactic Phần lớn chúng đều phát triển trên

môi trường có chứa lactoza, glyxerin, axit focmic Tất cả các chủng L

kononenkoae đều không đồng hóa eritrit và chỉ có L stakeyi đồng hóa inozit [1] Lipomyces không đồng hóa H2S khi nuôi cấy trong môi trường nước

Lipomyces còn có khả năng sử dụng vitamin C làm nguồn cacbon duy nhất Đây là một đặc điểm riêng khác hẳn với các loại nấm men khác [1]

Lipomyces không những có khả năng đồng hóa mà còn có khả năng tổng hợp vitamin C Theo Heick và cộng sự thì khả năng tích lũy vitamin C ở

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 10

L stakeyi cao nhất đạt tới 200 µg/g sinh khối tươi, trong đó 80% vitamin C ở

dạng khử [4] Theo các tác giả, nấm men Lipomyces còn có khả năng đồng

hóa hydrocacbon (dầu thô, diezel) [26]

Khả năng sử dụng nguồn cacbon phong phú rất phù hợp với đặc tính

sinh trưởng của nấm men Lipomyces: thường phân bố nhiều ở những lớp đất

nghèo chất dinh dưỡng [1]

* Nguồn nitơ

Lipomyces là nhóm vi sinh vật sử dụng rất ít nitơ Bởi vậy, để phát triển chúng cần một lượng nitơ rất nhỏ trong môi trường Theo Vononenro với

nồng độ nitơ là 0,003% Lipomyces vẫn phát triển chậm Vậy chúng có khả

năng cố định nitơ hay không? Một số tác giả cho rằng chúng có khả năng này

Số khác lại giả thiết rằng chúng không Kết thúc cuộc tranh luận này là những

lập luận chứng minh Lipomyces không có khả năng cố định nitơ Chúng chỉ

có khả năng liên kết các phân tử nitơ tự do Quá trình liên kết này được tăng

cường khi Lipomyces cộng sinh với Azotobacter Một trong những nguyên nhân dẫn đến kết luận Lipomyces có khả năng cố định nitơ là do vi khuẩn phát

triển và được giữ lại ở trong màng nhầy của nấm men Mặt khác màng nhầy

của Lipomyces có khả năng hút những hơi NH4+ từ không khí [1]

Larue và Spencer cho biết Lipomyces không sử dụng nitrat nhưng

chúng có khả năng sử dụng những hợp chất hữu cơ chứa nitơ: pepton, axit amin, purin…

Đặc biệt, L stakeyi có khả năng đồng hóa rất tốt nguồn nitơ mạch vòng Rất nhiều vi sinh vật đất phát triển trên môi trường chứa nitơ mạch

vòng nhưng chỉ Lipomyces có khả năng phân hủy hoàn toàn hợp chất này Trong đó, L stakeyi chuyển hóa mạnh nhất Bổ sung saccaroza nồng độ 0,1 –

1% vào môi trường thì kích thích quá trình sinh trưởng và phân hủy chất này

* Các chất kích thích và các yếu tố sinh trưởng :

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 11

Vấn đề một số vi sinh vật muốn phát triển cần phải được cung cấp những chất sinh trưởng nào đó đã được Paster phát hiện từ những năm 1859 –

1864

Lipomyces có thể phát triển trên môi trường không có vitamin (trừ

L anomalus) Tuy nhiên, nếu bổ sung một ít nước chiết nấm men vào môi trường trên thì sự phát triển của chúng sẽ tăng lên rất nhiều

Theo Slodki – Wickerham yếu tố kích sinh trưởng của Lipomyces là biotin [13] Nhu cầu biotin cần cho L stakeyi phụ thuộc vào pH của môi trường pH = 5,5, L stakeyi sinh trưởng bình thường trên môi trường thiếu

biotin Nhưng pH = 6,5, thiếu biotin, chúng không phát triển bình thường [1]

Mặt khác Lipomyces có khả năng tổng hợp biotin và enzyme xúc tác quá trình

tổng hợp này bị ức chế ở pH ≥ 6 [4] Qúa trình thẩm thấu biotin vào tế bào

L stakeyi xảy ra khi pH = 2- 8; pH tối thích = 4,2 Ở pha log sự vận chuyển

biotin vào tế bào Lipomyces diễn ra mạnh nhất [1]

* Trao đổi năng lượng ở Lipomyces :

Lipomyces là một nhóm nấm men có tốc độ sinh trưởng chậm Tất cả

các loài của chi Lipomyces đều có khả năng trao đổi chất bằng con đường oxy

hóa các cơ chất, chúng không có khả năng len men [1] Đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy glucoza theo con đường hiếu khí là pentozo photphat oxy hóa [1]

Ty thể của chúng có khả năng photphoril hóa và chứa tất cả các enzyme trong chu trình Krebs

* pH môi trường :

Các loài Lipomyces chỉ phát triển trong một giới hạn pH xác định Trên

các môi trường tổng hợp với pH = 4 và glucoza là nguồn cacbon duy nhất thì

tất cả các loài Lipomyces đều phát triển Khả năng sinh trưởng của Lipomyces

ở pH ≤ 4 còn chưa xác định rõ

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 12

L anomalus không phát triển được trong điều kiện pH > 6 Khi pH =

8,5 phần lớn các chủng thuộc loài L stakeyi, L kononenkoae đều không sinh trưởng được, trong khi đó L tetrasporus, L lipofer có thể phát triển [1]

* Nhiệt độ :

Một số loài Lipomyces có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ khá rộng Nhiệt độ max cho L anomalus phát triển là 28oC, cho L lipofer là 30- 35oC,

L kononenkoae: 35- 37oC, L stakeyi: 30- 35oC, L tetrasporus: 35oC Nhiệt

độ thấp mà Lipomyces vẫn sinh trưởng chưa được xác định rõ Tuy nhiên,

người ta biết được rằng L anomalus và L lipofer có thể phát triển ở nhiệt độ

4oC

1.4 Tiềm năng ứng dụng của polysaccharide sinh học này:

Gần đây loại vật liệu polysaccharide sinh học đã bắt đầu được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

+ Sử dụng làm chất chống keo tụ của CaCO3, BaSO4… Trong công nghiệp hiện nay nhiều chất chống keo tụ được sử dụng trong các thiết bị trao đổi nhiệt, trong các đường ống dẫn nước: polyacrylate, polysulfonate, phosphonate… để giữ cho đường ống sạch [8] Tuy nhiên các chất này khi được thải ra ngoài môi trường lại trở thành tác nhân gây ô nhiễm và không thân thiện với hệ sinh thái Polysaccharide sinh học là một tác nhân hữu dụng cho việc chống keo tụ Ngoài ra, đây còn là chất thân thiện với hệ môi trường sinh thái và có thể phân hủy sinh học tốt Nên loại polymer sinh học này là một trong những nguyên liệu mới rất được quan tâm nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng

+ Sử dụng làm chất biến tính bề mặt cho các hạt nano Ống cacbon nano là loại vật liệu có nhiều tính chất ưu việt như độ dẫn điện, tính chất cơ học Tuy nhiên loại vật liệu này cấu tạo từ các nguyên tử cacbon nên nó không có khả năng phân tán trong các dung môi nên nó làm hạn chế khả năng đưa vào các ứng dụng thực tế, trong đó có các ứng dụng sinh học

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 13

Polysaccharide đã được sử dụng như là chất biến tính bề mặt cho ống nano cacbon để làm sensor sinh học [7] Nhờ đó mà ống nano cacbon có thể phân tán đều trong các dung môi khác nhau, dễ chế tạo dạng màng và có tính tương thích sinh học cao Ngoài ra, polysaccharide sinh học cũng được sử dụng làm chất biến tính bề mặt cho nhiều loại hạt nano khác như hạt nano từ, nano bán dẫn đề đưa vào các ứng dụng trong xử lý môi trường [6], điều trị bệnh [20];

+ Sử dụng làm chất tăng cường các đặc tính sinh học cho các polymer tổng hợp trong công nghệ mô [14] Vật liệu polycaprolactone-chitosan composite có cấu trúc lỗ xốp đồng đều và có thể ứng dụng làm vật liệu khung trong công nghệ mô [15]

1.5 Các nghiên cứu về polymer sinh học trên thế giới, Việt Nam và các ứng dụng của chúng:

1.5.1 Trên thế giới:

Cùng với sự phát triển về nghiên cứu và ứng dụng các polyme sinh học trong nhiều lĩnh vực khác nhau, rất nhiều trung tâm lớn về hóa học polysaccharide ở Nhật, Châu Âu, Nam Mỹ và nhiều nơi khác trên thế giới đã được hình thành Các hướng nghiên cứu về polymer sinh học trên thế giới tập trung vào 2 lĩnh vực chính: (1) vật liệu phân hủy sinh học như là vật liệu thay thế cho các sản phẩm chất dẻo truyền thống và (2) là các ứng dụng y sinh

Nhiều chương trình lớn ở Châu Âu nghiên cứu về vật liệu sinh học như: chương trình ECLAIR (European Collaborative Linkage of Agriculture and Industry Through Research) năm 1988-1993 đã chi 95 triệu

đô cho việc phát triển sự đa dạng cây trồng và vi sinh vật [32] Chương trình này tập trung về vấn đề tách chiết và chuyển đổi các vật liệu sinh học thành các sản phẩm thương mại Chương trình AIR (Agricultural and Agro-Industry Research) (1991-1994), đã chi 90 triệu đô cho việc phát triển các quá trình chuyển đổi các vật liệu từ nông nghiệp, lâm nghiệp và ngư nghiệp thành các sản phẩm công nghiệp Một trong những tiêu chí của chương trình

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 14

này là nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học và sự ảnh hưởng đến hệ sinh thái của các polymer sinh học Chương trình nghiên cứu BRITE (the Basic Research on Industrial Technologies in Europe) (1991-94) về các vật liệu đóng gói phân hủy sinh học và nhiều chương trình nghiên cứu khác [33] Ở

Mỹ, năm 1993 Chính phủ liên bang đã chi 4 tỉ đô hỗ trợ cho nghiên cứu và phát triển các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến công nghệ sinh học trong đó

có chương trình phát triển polymer sinh học Chương trình polymer sinh học tập trung vào các polymer phân hủy sinh học có trong tự nhiên như polysaccharide, polyesters và proteins

Ở Nhật cũng có nhiều chương trình nghiên cứu về polymer sinh học của Bộ Công nghiệp và Thương mại Quốc tế Nhật (METI), chương trình đáng chú ý nhất là phát triển polymer phân hủy sinh học từ các vi sinh vật với khoản đầu từ là 45 triệu đô trong thời gian 8 năm Ở nhiều phòng thí nghiệm thuộc METI đã tập trung nghiên cứu về polymer trộn hợp của polyester vi sinh vật, tinh bột, polycaprolactone Còn một số phòng thí nghiệm ở Tsukuba

và Osaka (Nhật Bản) thì nghiên cứu về vật liệu polymer phân hủy sinh học trên cơ sở chitosan và cellulose METI cũng tiến hành đầu tư mạo hiểm khoảng 45 triệu đô cho các Công ty để phát triển công nghệ gỗ vi sinh Hiện nay, ở Nhật đã có nhiều Công ty cung cấp các sản phẩm thương mại về polymer sinh học như: Mitsubishi Kasei, Kureha Chemical, Showa Denko…

Theo một nghiên cứu về: “Sản xuất exopolysaccharide từ dịch hỗn hợp

nuôi cấy của nấm men Rhodotorula rubla GED10 và vi khuẩn làm sữa chua (Streptococus themophilus 13a + Lactobacillus bulgaricus 2-11)” của Viện

khoa học Bungari thì hàm lượng exopolysaccharide của hỗn hợp ba chủng nói trên đạt được là 19,3 g/l và trọng lượng sinh khối khô là 21 g/l sau 84h nuôi cấy ở 28oC Hỗn hợp nuôi cấy của ba chủng được nuôi trong thiết bị lên men hiện đại (có hệ thống cung cấp khí tự động ), môi trường có chứa 44 g/l Lactoza, 4 g/l (NH4)2SO4 [34]

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 15

Một nghiên cứu nữa về: “ Qúa trình lên men sản xuất polysaccharide”

theo US Patent 4692480 Polysaccharide được nghiên cứu là Xanthangum từ hai chủng Xanthomonas juglandis NCPP1B 413 và Xanthomonas campestris

NC1B 11781 [35]

- Chủng X juglandis NCPP1B 413 được nuôi cấy trong thiết bị lên men

hiện đại (có hệ thống cung cấp khí tự động, 300C, pH 7,0) Với môi trường có chứa 102 g/l glucoza, 2 g/l (NH4)2SO4 thì hàm lượng polysaccharide của chủng là 27 – 30 g/l

- Còn chủng X campestris NC1B 11781, sau 48h nuôi cấy hàm lượng

polysaccharide đạt 16 – 20 g/l Chủng được nuôi cấy ở 30oC trong thiết bị lên men hiện đại, môi trường có bổ sung 43 g/l lactoza, 1,5 g/l (NH4)2SO4,

1.5.2 Ở Việt Nam:

Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính

đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, rạn san hô Hệ sinh thái của Việt Nam rất phong phú, bao gồm nhiều loài động thực vật và đặc biệt có khoảng hơn 3.000 loài vi sinh vật, trong đó

có rất nhiều loài vi sinh vật được sử dụng để sản xuất các vật liệu sinh học mới (xăng sinh học, polymer sinh học…) Vi sinh vật luôn là đối tượng quan tâm hàng đầu của các nhà công nghệ sinh học bởi những đặc tính quí báu của chúng: sinh sản nhanh, nuôi cấy dễ và có thể tổng hợp những chất có hoạt tính sinh học quí mà các cơ thể khác không có

Ở nước ta hiện nay cũng có nhiều tổ chức khoa học đã tiến hành nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các sản phẩm của polysaccharide sinh học vào các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp dầu khí và y học

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cũng đã có một số Đề tài về nghiên cứu về sinh tổng hợp và ứng dụng các chủng VSV sinh polysacaride ngoại bào vào việc sản xuất một số chế phẩm

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 16

VSV sinh học Kết quả thu được rất khả quan PGS.TS Tống Kim Thuần và cộng sự (Phòng Công nghệ vật liệu Sinh học) đã thành công trong việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh giữ ẩm đất Lipomycin M từ chủng nấm

men sinh polysacaride ngoại bào Lipomyces starkeyi PT7.1 phân lập từ Việt

Nam [27] Khả năng giữ độ ẩm cho đất của chế phẩm này có được là nhờ các polymer ngoại bào (glucan) được hình thành trong quá trình hoạt động sống của nấm men PT7.1 Các polymer ngoại bào này có thành phẩn chủ yếu là các polysaccharide được hình thành từ quá trình ngưng tụ các monosaccharide tạo cầu nối glucoside Polysacaride ngoại bào của chúng làm tăng độ kết cấu của đất, có khả năng giữ nước, chống rửa trôi và làm giảm sự bay hơi nước Kết quả ứng dụng chế phẩm Lipomycin M trên đất khô hạn của Mê Linh, Vĩnh Phúc và một số tỉnh Tây Nguyên cho thấy, chúng làm tăng độ ẩm đất lên 12-16% và cải thiện được một số tính chất hóa lý của đất [29] Với thành công

bước đầu về việc sử dụng chủng vi sinh vật Lipomyces sinh polysaccharide

làm tác nhân giữ ẩm đất, chúng tôi hoàn toàn tin tưởng vào sự thành công của hướng nghiên cứu mới này

PGS.TS Lại Thúy Hiền và cộng sự (Phòng VSV Dầu mỏ) đã nghiên cứu qui trình sản xuất Xanthan-gum từ vi khuẩn sinh polysacaride ngoại bào

Xanthomonas campestris phân lập từ nhà máy đường Thanh Hóa [23] Các tác giả đã đưa ra qui trình sản xuất Xanthan gum trong nồi lên men qui mô 20 lít bằng nguyên liệu trong nước và TS Phan Văn Đoàn (Viện nghiên cứu dầu khí) đã nghiên cứu một số tính chất hóa lý của xanthangum [22] Chế phẩm xanthan - gum này đã được ứng dụng thử nghiệm thành công trong việc khoan thăm dò và khai thác dầu khí (hút nước trong các giếng dầu nhằm nâng cao hiệu suất khai thác dầu thô [23] TS Phạm Thanh Hà (Phòng Công nghệ vật liệu Sinh học) đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp polymer nội bào của

chủng vi khuẩn Alcaginensis phân lập từ nước ao hồ Việt Nam Kết quả cho

thấy, biopolymer do chủng vi khuẩn này sinh ra đạt tới 46% sinh khối khô

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 17

Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS.TS Nguyễn Văn Khôi đã biến tính bột sắn bằng phản ứng trùng hợp để tăng khả năng giữ nước của chúng lên hàng trăm nghìn lần và sử dụng chúng như là chất giữ ẩm đất phục vụ cho nông nghiệp Còn PGS.TS Đỗ Trường Thiện, cũng đã nghiên cứu tạo loại polymer gắn tinh bột (Polyethylene- starch blend polymer) để cho VSV đất dễ phân hủy, chống ô nhiễm môi trường [25] Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Hữu Lý cũng đã bắt đầu sử dụng chitosan làm polyme bọc hạt nano để ứng dụng trong y sinh… Tại Trường

ĐH Bách Khoa Hà Nội, nhóm nghiên cứu của TS Trần Đại Lâm cũng đã thành công bước đầu trong việc bọc hạt nano từ bằng chitosan để làm chất dẫn thuốc [24]

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 18

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU:

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Chủng nấm men Lipomyces starkeyi PT 5.1 được phân lập từ đất đồi

huyện Hạ Hoà, Phú Thọ năm 2003 và được tuyển chọn định hướng theo khả năng sinh màng nhày

Chủng nấm men thuần khiết được bảo quản trong ống thạch nghiêng Hansen và giữ ở nhiệt độ 40C Cấy chuyền định kỳ 2 tháng/ lần

2.1.2 Dụng cụ và hoá chất:

* Dụng cụ và máy móc: Để tiến hành thực hiện đề tài này chúng tôi đã

sử dụng các thiết bị sau:

• Tủ cấy vô trùng ( Trung Quốc)

• Nồi khử trùng.( Trung Quốc)

• Tủ ấm ( Nhật Bản)

• Tủ sấy ( Trung Quốc)

• Máy lắc (Nhật Bản)

• Kính hiển vi quang học ( Opympus)

• Máy đo mật độ quang học (Đức)

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 19

• K2HPO4 ( Trung Quốc)

• MgSO4 7 H2O (Trung Quốc)

• (NH4)2SO4 (Trung Quốc)

• NaNO3 ( Merck - Đức)

• Glutamat natri (Trung Quốc)

• Tinh bột (Trung Quốc)

• Glyxerin ( Merck -Đức)

• Etanol 98o (Trung Quốc)

• Cao nấm men ( Merck -Đức)

• Glucoza ( Merck -Đức)

• Saccaroza ( Việt Nam)

• Lactoza ( Merck -Đức)

• Metanol ( Trung Quốc)

• Ethylaxetat ( Trung Quốc)

• Clorofom (Merck – Đức)

2.1.3 Môi trương nuôi cấy:

* Môi trường Hansen cơ sở để nuôi cấy và giữ giống nấm men (g/l)

•Saccaroza 30

• Pepton 5

• KH2PO4 3

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái :

Chủng nấm men nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường Hansen cơ

sở để quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào Ngoài ra chủng này còn được nuôi cấy trên môi trường Hansen dịch thể cải tiến để quan sát đặc tính nuôi cấy

+ Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường, mô tả màu sắc, kích thước và đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường đặc

+ Làm tiêu bản, quan sát hình thái tế bào, khả năng nảy chồi của chủng dưới kính hiển vi Olympus- CH2 ở vật kính 40X và chụp ảnh

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của nấm men PT 5.1:

2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí :

Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 5 độ thoáng khí (v:v): 1/10, 1/5, 1/3, 2/5 và 1/2 lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng

nấm men Lipomyces PT5.1 Thí nghiệm được tiến hành như sau :

- Môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến (dịch thể)

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 21

- Môi trường được phân vào các bình tam giác 250ml với các độ thoáng khí (v:v) khác nhau là: 1/10, 1/5, 1/3, 2/5 và 1/2 Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút

- Bổ sung 3% giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc tốc (độ 220 v/p) ở 28 - 30oC trong 168h (7 ngày)

- Sau 7 ngày nuôi cấy, xác định sinh khối khô và hàm lượng polysaccharide của chủng bằng cách thu dịch nuôi cấy ở các độ thoáng khí khác nhau đem li tâm ở tốc độ 10000 v/p ở 4oC để tách polysacharide Tủa polysacharide bằng etanol 98o với tỉ lệ 1 : 2 Thu lấy cặn kết tủa và làm khô ở nhiệt độ từ 80 - 100oC, cân đến trọng lượng không đổi Sinh khối tế bào sau khi li tâm đem làm khô ở 105oC và cân đến trọng lượng không đổi

2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH :

Dải pH sử dụng cho nghiên cứu này từ 4 - 8

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến

- Môi trường được phân vào các bình tam giác 250ml (độ thoáng khí là

1/5) với các độ pH khác nhau: 4, 5, 6, 7, 8 và được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút

- Bổ sung 3% giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc (tốc độ 220 v/p) ở 28 - 30oC trong 168h (7 ngày)

- Sau 7 ngày nuôi cấy, xác định sinh khối khô và hàm lượng polysaccharide của chủng bằng cách: thu dịch nuôi cấy ở các độ pH khác nhau đem li tâm ở tốc độ là 10000 v/p ở 4oC trong 15 phút để tách polysaccharide Tủa polysaccharide bằng etanol 98o với tỉ lệ 1 : 2 Thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ từ 80 - 100oC, cân đến trọng lượng không đổi Sinh khối tế bào sau khi li tâm đem làm khô ở 105oC và cân đến trọng lượng không đổi

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 22

2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ:

Nguồn nitơ sử dụng cho nghiên cứu này gồm: (NH4)2SO4, NaNO3 và Glutamat natri Thí nghiệm được tiến hành như sau :

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến không có

nguồn nitơ (môi trường đối chứng), pH = 7

- Môi trường được phân vào các bình tam giác 250ml (độ thoáng khí là

1/5 v:v), sau đó bổ sung các nguồn nitơ (NH4)2SO4, NaNo3 và Glutamat natri vào môi trường với nồng độ 0,1% và được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến, pH = 7

- Môi trường được đổ vào các bình tam giác 250ml (độ thoáng khí là

1/5), sau đó bổ sung nguồn (NH4)2SO4 vào môi trường với các nồng độ khác nhau: 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,5% Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút

- Bổ sung 3% giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc (tốc độ 220 v/p) ở 28 - 30oC trong 168h (7 ngày)

- Xác định sinh khối khô và hàm lượng polysaccharide của chủng tương tự như các phương pháp trên

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 23

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn Cacbon :

Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 6 nguồn cacbon: Glucoza, Saccaroza, Latoza, Glyxerin, Tinh bột và Etanol (16o)

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến không có

nguồn cacbon nào, pH = 7

- Môi trường được phân vào các bình tam giác 250ml (độ thoáng khí là

1/5), sau đó bổ sung vào môi trường các nguồn cacbon khác nhau: Glucoza, Saccaroza, Latoza, Glyxerin, Tinh bột và Etanol (16o) với nồng độ 1% Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút Riêng môi trường có chứa etanol thì trước khi cấy giống mới bổ sung etanol

- Bổ sung 3% giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc (tốc độ 220 v/p) ở 28 - 30oC trong 30h

- Lấy mẫu tại các các thời điểm 0, 6, 12, 24 và 30h Xác định khả năng

sinh trưởng của chủng nấm men bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm

2.2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ Saccaroza khác nhau :

Các nồng độ Saccaroza sử dụng để nghiên cứu: 0, 3, 5, 7, 10, 12 và 15%

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến không có

nguồn cacbon nào, pH = 7

- Môi trường được phân vào các bình tam giác 250ml (độ thoáng khí là

1/5), sau đó bổ sung vào môi trường nguồn Saccaroza với các nồng độ khác nhau : 0, 3, 5, 7, 10, 12 và 15% Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút

- Bổ sung 3% giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc (tốc độ 220 v/p), ở 30oC trong 168h (7 ngày)

- Xác định sinh khối khô và hàm lượng polysaccharide của chủng tương tự như phương pháp trên

Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 24

2.2.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide:

Sau khi nghiên cứu và tìm ra được các điều kiên thích hợp để chủng nấm men cho khả năng sinh polysaccharide là nhiếu nhất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide của chúng

- Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến 3%

Saccaroza, 0,1% (NH4)2SO4, pH = 7

- Môi trường được phân vào bình tam giác 1lit (độ thoáng khí là 1/5) và

được khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 30 phút

- Bổ sung 3 % giống nấm men 24h tuổi đã được hoạt hóa Các mẫu thí nghiệm được nuôi lắc (tốc độ 220 v/p) ở 30oC trong 192h (8 ngày)

- Lấy mẫu tại các các thời điểm 0, 12 , 24 , 36 , 48 , 60 , 72 , 96 , 120 ,

144 , 168 và 192h Xác định sinh khối khô và hàm lượng polysaccharide của chủng tương tự như phương pháp trên

2.2.4 Phương pháp tách chiết polysaccharide ngoại bào:

Sau khi nuôi cấy thu lấy dịch sinh khối nấm men, đem li tâm để tách riêng polysaccharide ngoại bào và sinh khối nấm men ở tốc độ 10000 v/p ở

4oC trong 15 phút Kết quả thu được dịch nuôi cấy đã tách thành 2 pha: polysacharide ở phía trên ( phần dịch trong) còn sinh khối tế bào ở phía dưới (sát đáy ống li tâm, có màu trắng đục)

Kiểm tra độ tinh sạch của dịch trong (màng nhầy + dịch nuôi cấy) phía trên bằng kính hiển vi quang học Olympus ở vật kính 40X Xác định được khả năng tách polysaccharide khỏi tế bào nấm men

Dịch nuôi cấy sau khi loại bỏ tế bào được chiết với Etanol 98o, với tỉ lệ

1 : 2, khuấy đều dịch chiết trong 30 phút để tách polysaccharide Polysaccharide thu được có màu trắng đục Thu cặn kết tủa và làm khô ở nhiệt độ từ 80 - 100oC, xác định trọng lượng khô bằng phương pháp cân đến trọng lượng không đổi