Công nghệ sản xuất enzyme papain

Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel va Smith từ nhựa khô.Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại pro

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN KĨ THUẬT THỰC PHẨM III

ENZYME PAPAIN

1.NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG 3005100260 2.NGUYỄN THỊ KIM TUYẾN 3005100886 3.NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN 3005100905

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

*****

BÀI TIỂU LUẬN KĨ THUẬT THỰC PHẨM III

ENZYME PAPAIN

Trình bày: Nguyễn Thị Thúy Hồng Hình ảnh: Nguyễn Thị Kim Tuyến

MỤC LỤC

CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4

2.1Giới thiệu về cây đu đủ 4

2.1.1 Phân bố sinh thái của cây đu đủ 4

2.1.2.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5

2.2 Giới thiệu về enzyme papain 6

2.2.1 Nguồn gốc 6

2.2.2 Tính chất của papain 6

2.2.2.1 Tính chất vật lý 6

2.2.2.2 Tính chất hóa học 7

a) Cấu tạo hóa học: 7

b) Cấu trúc không gian 8

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 8

d) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 11

CHƯƠNG III: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PAPAIN 13

3.1 Nguyên liệu 13

3.2 Thiết bị ……… 13

3.3 Quy trình công nghệ……… 13

3.3.1 Thu nhận papain……… 15

3.3.2 Sơ đồ quy trình công nghệ……… 16

3.4 Ứng dụng của enzyme papain……… 18

3.4.1 Trong y học……… 18

3.4.2 Trong công nghệ thực phẩm……… 18

3.4.3 Trong công nghệp khác ……… 18

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN……… 19

CHƯƠNG V: TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 20

CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU

Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao

gồm: papain, chymopapain và peptidase

Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của

các quả đu đủ xanh Ngoài ra, papain còn là

một loại men phân giải protein tồn tại trong

đu đủ Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu

hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein

một cách dễ dàng hơn Nó có thể giúp phân

giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề

mặt cơ thể Papain có tác dụng tiêu hóa

protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm Và đó chính là nguyên nhân đã đưa nhóm em

CHƯƠNG II:

GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ

Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ

Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac

2.1.1 Phân bố sinh thái của cây đu đủ

Chi Carica L có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C peltata Hook & Ann Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam

Á Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi

Vườn cây đu đủ

2.1.2 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ

1 Nhựa đu đủ có thể gây viêm da

2 Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lyamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan

3 Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng

4 Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó

5 Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu

6 Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain

để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A

và D hơn Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain

2.2 Giới thiệu về enzyme papain

2.2.1 Nguồn gốc

Enzyme papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzyme thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ

chế hoạt động Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi

Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel va Smith từ nhựa khô.Trong nhựa

đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain,

caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and

Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung

2.2.2.2 Tính chất hóa học

a) Cấu tạo hóa học:

Papain là một endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S Papain là một protease

thiol, theo nghiên cứu của R L Hill và E L Smith, papain là một chuỗi

polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lƣợng phân tử là 20.900 Dalton

Bảng 2: Thành phần hóa học:

Amino acid Số lƣợng Amino acid Số lƣợng

Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain đƣợc cấu tạo bởi 212 acid

amin trong đó không có chứa methionine Phân tử lƣợng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine,

có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200

không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25

b) Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính

bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Cấu trúc không gian của enzyme papain

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0

và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain

- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen

- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống nhƣ của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau

Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser

Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:

Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và

các amino acid, đóng vai trò vừa nhƣ endopeptidase vừa nhƣ

exopeptidase

Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k

i+k=n

Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid

(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH 

(H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N-CH(R)-CO-)k

n`+k = n

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain

có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và

sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain

Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase Hoạt hóa papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự

do Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong

đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

Bất hoạt:

Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như:

O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính

là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m)

d) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain

Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng

nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch

Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000

C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain

Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 370C Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%

pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng

lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5 Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút

Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là

methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain

Điều kiện lấy nhựa :

- Cây đang sinh trưởng tốt,

không bị sâu bệnh,thân cây mập mạp cho nhựa nhiều

- Quả : lấy ở những quả còn

xanh,vỏ mịn,từ 0.3 – 1kg,độ

10 tuần tuổi là tốt nhất

- Thời gian lấy nhựa : sáng

sớm Cách tiến hành :

- Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây,dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính cao nhất,các lác khía cách nhau 3 -5cm(không rạch sâu quá 2cm để dịch nước và tinh bột

từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa)

- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng 4-6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào

- Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng.không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng,…vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính

enzyme Lọ, dao, muỗng,…phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ

- Nhựa tươi không bền vì thế nên sấy khô 5 % ẩm

3.3.1 Thu nhận papain

 Chuẩn bị:

Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất cách làm như sau:

Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để

đư pH dịch chiết tới 5.7)

Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền

và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11

Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7

Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh

 Loại bỏ các chất không tan pH9:

Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9 Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong

 Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4:

Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở