Công Nghệ Sản Xuất Enzyme Bromelin

2. Enzyme Bromelin Bromelin là proteinenzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về Bromelin được bắt đầu từ những năm 1968 1970. Bromelin là nhóm protease thực vật có mã số EC3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì Bromelin có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau. Bromelin có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả, chiếm 50% protein. Bromelin là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide. Thành phần chủ yếu của Bromelin có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của Bromelin thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro. 2.1. Cấu tạo hoá học Polypeptide của Bromelin thân có acid amin đầu –NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –NH2 là alanine

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 4

PHẦN 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 5

1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu 5

2 Enzyme Bromelin 6

2.1 Cấu tạo hoá học 6

2.2 Tính chất vật lí 7

2.3 Hoạt tính của Bromelin 8

2.3.1 Hoạt tính phân giải 8

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelin 8

2.3.2.1 Ảnh hưởng của pH 9

2.3.2.2 Ảnh hưởng bởi cơ chất 9

2.3.2.3 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ 10

2.3.2.4 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại 10

PHẦN 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME BROMELIN 11

1 Quy trình công nghệ 11

2 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelin 12

2.1 Phương pháp siêu lọc 12

2.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc 13

2.1.2 Các kiểu siêu lọc : 13

2.1.2.1 Kiểu một bước (single pas operation) 13

2.1.2.2 Kiểu lô (batch operation) 14

2.1.2.3 Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation) 14

2.1.3 Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc 15

2.2 Phương pháp kết tủa 15

2.3 Phương pháp hấp phụ 16

PHẦN 3:NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELIN 17

1 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 17

1.1 Bromelin làm mềm thịt 17

1.2 Bromelin sử dụng trong quá trình đông tụ sữa 17

1.3 Bromelin trong chế biến thủy sản 17

3 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 18

4 Bromelin dùng để thu nhận các chất ức chế protease 18

5 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng 18

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sản phẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme Việc sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc biệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an toàn sinh học, không gây bệnh đối với người Một trong những enzyme quan trọng trong cuộc sống đó là enzyme Bromelin nó được ứng dụng trong công nghiệp, thực phẩm và quan trọng nhất là trong y dược

Vậy enzyme bromelin có nguồn gốc từ đâu, quy trình sản xuất như thế nào? Sau đây nhóm của chúng mình sẽ tìm hiểu về vấn đề đó

PHẦN 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu

Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ

(Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng này vẫn có

thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại

Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết ở

các nước trừ ở Châu Âu Các nơi trồng nhiều như là: Hawaii,

Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc

đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản

lượng khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam…

Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish

- Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới,

chiếm khoảng 80% diện tích Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi

như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng Dứa thuộc nhóm này có quả

lớn nhất, mắt phẳng và nông Thịt quả kém vàng, nhiều nước, ít

ngọt và kém thơm hơn dứa Queen

- Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây Đây là nhóm dứa trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (còn gọi

là khóm hoặc thơm) Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt lồi Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi

- Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta Nhóm này được trồng ở Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu Thịt quả

vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa Dứa nhóm này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không được phát triển

2 Enzyme Bromelin

- Bromelin là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế

kỷ 20 Ở nước ta nghiên cứu về Bromelin được bắt đầu từ những năm 1968 -1970

- Bromelin là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa Ở mỗi bộ phận khác nhau thì Bromelin có

pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau

- Bromelin có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả, chiếm 50% protein Bromelin là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội

phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide

- Thành phần chủ yếu của Bromelin có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của Bromelin thì thu

được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro

2.1 Cấu tạo hoá học

- Polypeptide của Bromelin thân có acid amin đầu –NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –NH2 là alanine

OH OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

CH OH 2

CH OH2

CH OH 2

OH OH

- Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme

Bromelin trích từ thân cây dứa và thấy như sau:

Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelin thân

35.500 ***

* : Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán

** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong

*** : Tính bằng phương pháp Archibald

2.3 Hoạt tính của Bromelin

2.3.1 Hoạt tính phân giải

- Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của Bromelin

Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của Bromelin

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của Bromelin thân cao hơn trong quả xanh và quả chín

- Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của Bromelin

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của Bromelin

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelian quả chín

- Qua bảng trên ta thấy Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn Bromelin thân và quả chín

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelin

- Giống như các loại chất sinh học khác, Bromelin cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết

- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của Bromelin không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa…

2.3.2.1 Ảnh hưởng của pH

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, pH tối thích của Bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập Bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định

ở pH = 4.6 - 5.4 Bromelin đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0

và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63º

C Bromelin có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất

2.3.2.2 Ảnh hưởng bởi cơ chất

Trên những loại cơ chất khác nhau, Bromelin có hoạt tính khác nhau Nếu cơ chất

là hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelin mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của Bromelin tương tự như papain Đối với các cơ chất tổng

hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của Bromelin yếu hơn papain

2.3.2.3 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme Ví dụ: Ở dịch chiết quả dứa (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến

60ºC thì Bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng nếu tăng cao quá thì Bromelin sẽ mất hoạt tính Ở 5º

C, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24h Ở 55ºC, pH

= 6.1 thì enzyme mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút

2.3.2.4 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại

Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Bromelin và mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ của muối

PHẦN 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME BROMELIN

Ly tâm 1

Bã

Bromelin

Mô tả sơ đồ :

Thân, chồi và quả của trái dứa sẽ được rửa sạch sau đó tiến hành đem xay nhuyễn những phần đó thu được hệ huyền phù Đem lọc sẽ thu được dịch ép, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút sẽ thu được dịch ly tâm, khi đó sẽ cho tác nhân kết tủa (acetone tinh khiết -20°C, ethanol -4°C hoặc ammonium sulfate 70% bão hòa) vào dung dịch trên để làm kết tủa enzyme Bromelin với thời gian 30 phút rồi tiến hành ly tâm lạnh 6000 vòng/phút trong 20 phút thu được kết tủa enzyme này cuối cùng đem sấy đông khô sẽ được enzyme Bromelin thô

2 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelin

2.1 Phương pháp siêu lọc

- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách phân đoạn các thành phẩm trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng

- Dung dịch enzyme thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn Sau đó chuyển sang phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein, enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme

- Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều lỗ rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua

Các sợi này được chế tạo từ các lọai polime bền như fluoropolime (FS:

Fluorosurfactant), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp Ví dụ: cô đặc protein (dùng màng FS, GR); Cô đặc enzyme (dùng màng GR)

Hình 2.1: Lọc cross - flow

2.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc

- Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng Khi chọn

nhiệt độ sử dụng cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì quá trình này có thể làm kín màng

- Áp suất: Thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1m2 màng trong 1h)

sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại Nếu áp suất tăng lên cao hơn nữa thì dòng chảy sẽ giảm Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên được điều chỉnh từ 4 - 5 lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI1 - PI2 ở trong khoảng 0.5 - 3bar Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1max) là 7bar (tương đương 102Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI2min) là 0.5bar (tương đương 7.25Psi)

2.1.2 Các kiểu siêu lọc :

Có ba kiểu hệ thống siêu lọc

2.1.2.1 Kiểu một bước (single pas operation)

Dịch học Vật liệu học Chất rắn

Hình 2.2: Kiểu một bước

2.1.2.2 Kiểu lô (batch operation)

Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu

Hình 2.3: Kiểu lô

2.1.2.3 Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation)

Dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu

2.1.3 Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc

- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể

- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính

- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao

- Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme,

do đó nhiệt độ 10 - 20ºC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất cao mà không làm mất hoạt tính enzyme Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ thấp (5ºC)

2.2 Phương pháp kết tủa

- Nguyên tắc: Dựa trên tính hoà tan Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH = 7 do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có thừa điện tích âm đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước lưỡng cực, cũng như các ion dương khác có trong dung dịch Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng và để có thể kết tủa được các enzyme thì ta nhất thiết phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch các dung môi hoặc các hoá chất ưa nước có ái lực mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống

- Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa Bromelin Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ, do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành trong điều kiện lạnh Như vậy dịch dứa phải được làm lạnh

ở 0ºC đến 4ºC và acetone tinh khiết ở - 20ºC Ethanol cũng được sử dụng để làm kết tủa Bromelin và cũng phải giữ ở nhiệt độ thấp Sau khi thu được kết tủa, tủa Bromelin phải rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để Bromelin không bị biến tính

- Thông thường những yếu tố chính có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là:

o Nồng độ của tác nhân kết tủa

o pH của dịch chiết

o Nhiệt độ kết tủa

o Thời gian tiếp xúc của tác nhân và dịch chiết

Ngoài ra, ta còn sử dụng ammonium sulfate Sự kết tủa với tác nhân này là một quá trình thuận nghịch và có thể thực hiện ở nhiệt độ thường Do có những ưu điểm như vậy nên tác nhân ammonium sulfate thường được dùng để kết tủa Bromelin thu về chế phẩm enzyme thô

- Hiện nay người ta kết tủa enzyme Bromelin bằng CMC (carboxyl methyl cellulose) do enzyme thu được có độ tinh khiết cao, thời gian đợi kết tủa ngắn và tiến hành thuận lợi hơn

- Quá trình tạo ra CMC:

Vải màn Alkalicellulose

2.3 Phương pháp hấp phụ

Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme như kaolin hay bentonite

để hấp phụ Bromelin Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt, kích thước hạt nhỏ hơn 1µm

do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều Một lí do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH- và O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với chất bị hấp phụ

Hình 2.6: Cấu tạo của kaolin

NaOH

Carboxylmethylcellulose

(CMC)