Công nghệ sản xuất ENZYME AMYLASE và ứng dụng AMYLASE trong công nghệ sản xuất MALTOSEDEXTRIN

Công nghệ sản xuất ENZYME AMYLASE và ứng dụng AMYLASE trong công nghệ sản xuất MALTOSEDEXTRIN

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MALTOSEDEXTRIN GVHD : Trần Thị Minh Hà LỚP : 02DHTP2 THỨ 2, TIẾT 11-12, PHÒNG F303 SVTH : NHÓM Tp.Hồ Chí Minh 19/5/2014 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm LỜI MỞ ĐẦU Enzyme chất xúc tác sinh học ý nghĩa cho trình sinh trưởng, sinh sản sinh vật mà đóng vai trò quan trọng công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, công nghệ gen bảo vệ môi trường Ngày nay, ngành công nghệ enzyme phát triển mạnh mẽ ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm Một số enzyme sử dụng phổ biến như: amylase, pectinase, protease, lipase,… Sự có góp mặt enzyme amylase thực phẩm biết từ lâu.Với đề tài “Công nghệ sản xuất enzyme amylase ứng ụng enzyme amylase sản xuất maltose dextrin”, cung cấp thêm cho bạn kiến thức qui trình sản xuất enzyme ứng dụng amylase Trong trình tìm kiếm tài liệu, viết kiến thức hạn chế, không tránh khỏi sai sót Rất mong đóng góp ý kiến từ cô bạn để đề tài hoàn thiện Chân thành cảm ơn! Nhóm thực hiện: Nhóm GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE Tổng quan enzyme amylase maltosedextrin Amylase hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước RR’ + H-OH → RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen dextrin thành glucose, maltose dextrin hạn chế Amylase enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm Maltodextrin polysaccharide sử dụng phụ gia thực phẩm Nó sản xuất từ tinh bột bị thủy phân phần thường tồn dạng bột trắng dễ hút ẩm Maltodextrin dễ dàng tiêu hóa, hấp thu nhanh chóng glucose, vị vừa gần không thơm Nó thường sử dụng để sản xuất nước kẹo 1.1 - Lịch sử nghiên cứu Đầu TK XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men - Năm 1814, Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ từ 40°C - 60°C - Năm 1833, Payen Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu kết tủa có khả phân giải tinh bột thành đường, đặt tên Diastase - Năm 1851, Leuchs phát nước bọt có khả phân giải tinh bột thành đường - Sau đó, amylase nước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn bắt đầu quan tâm nghiên cứu 1.2 Phân loại amylase GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Có loại enzyme xếp vào nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) exoamylase (enzyme ngoại bào)  Endoamylase gồm có: - α-amylase (hay α – 1-4 – glucanohydrolase) - Nhóm enzyme khử nhánh gồm có loại: + Khử trực tiếp Pullulanase (hay α-dextrin – glucosidase) + Khử gián tiếp Transglucosylase Amylose-1,6 glucosidase Các enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide  Exoamylase gồm có: - Enzyme β – amylase - Enzyme γ – amylase Đây enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử chuỗi polysaccharide Enzyme amylase phân loại theo sơ đồ sau: Sơ đồ 1- Phân loại Enzyme amylas • Sự khác biệt loại enzyme amylase GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm - Các loại Enzyme Amylase không khác đặc tính mà khác - pH hoạt động tính ổn định với nhiệt Tốc độ phản ứng Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa chất: Enzyme Amylase có nguồn gốc khác có tính chất, - chế tác dụng sản phẩm cuối trình thủy phân khác Amylase có nguồn gốc khác có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu đặc điểm thủy phân khác 1.3 Cơ chất enzyme amylase Cơ chất tác dụng Amylase tinh bột glucose 1.3.1 Tinh bột - Là nhóm Cacbonhydrat thực vật, có chủ yếu loại củ khoai lang, khoai tây, khoai mì…, hạt ngũ cốc, loại hạt có công thức tổng quát (C6H10O5)n Hạt tinh bột có hình dáng khác với kích thước từ đến 15µm Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 – 1,648 - Tinh bột chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose – mạch thẳng amylopectin Tỷ số amylose amylopectin tinh bột thường vào khoảng : Cả hai tạo gốc α-D-glucose Amylo có cấu tạo mạch thẳng Chúng liên kết nối α-1,4 glucozit α-1,6 glucozit nên tạo thành nhiều nhánh Ngoài amylose amylopectin tinh bột có chứa lượng nhỏ chất khác muối khoáng, chất béo, protit… Hàm lượng chung chúng khoảng 0,2 – 0,7% - Tinh bột không hòa tan nước lạnh, rượu ete Amylose dễ tan nước nóng tạo nên độ nhớt dung dịch Amylopectin hòa tan nước nóng tạo dung dịch nhớt - Trong nước nóng tinh bột hút nước trương nở tạo dạng gel Mức độ trương tinh bột phụ thuộc nhiệt độ Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột biến thành dạng keo gọi hồ tinh bột Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi nhiệt độ hồ hóa tinh bột Trong thực tế luôn tồn giới hạn nhiệt độ hồ hóa, tinh bột nguyên liệu gồm nhiều hạt có kích thước khác GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Tinh bột polysaccharide carbohydrate chứa hỗn hợp amylose amylopectin (tỉ lệ thành phần amylose amylopectin loại củ, hạt ngũ cốc thường khác nhau) + Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ gốc α–D-glucopyranosyl, liên kết với gốc α-1,4 glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo xoắn có gốc glucose tạo thành hình lục giác Cấu trúc xoắn giữ vững nhờ liên kết hidro tạo thành nhóm OH tự Bên xoắn kết hợp với nguyên tử khác Cùng với amylopectin, phân tử amylose tham gia tạo nên cấu hình hạt tinh bột thực vật Ví dụ Amylose tạo thành màu xanh tác dụng với Iodine, đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗi thẳng bị tách khỏi amylose dung dịch màu xanh Amilose thường phân bố phần bên hạt tinh bột Dung dịch amylose có độ nhớt thấp dung dịch amilopectin Amylose bị kết tủa ancol butylic Amylose có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da Amylose cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với liên kết α-1,4-glucoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh + Amylopectin: Là polyme mạch nhánh, cấu tạo từ gốc α-D-glucopyranosyl liên kết với α-1,4 α-1,6 glucozit Mức độ polyme hóa tử amylopectin lên đến giá trị hàng triệu Cấu trúc phân mạch bao gồm nhánh trung tâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh phát nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose Khối lượng phân tử amylopectin khoảng 500000 - triệu Amylopectin phân bố mặt hạt tinh bột Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao, đun nóng làm thay đổi sâu sắc không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây trạng thái hồ hoá tinh bột GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm 1.3.2 Glycogen Glycogen thuộc glucan, dễ tan nước là, polysaccharide dự trữ người động vật Phân tử glycogen có công thức chung (C 6H10O5)n phân nhánh giống phân tử amilopectin mức độ phân nhánh nhiều Phần lớn gốc glucose phân tử kết hợp với qua liên kết α -1,4 glucozit , liên kết α-1,6-glucozit chỗ phân nhánh phân tử Glycogen bị thuỷ phân tác dụng Enzyme amylase acid Khi thuỷ phân hoàn toàn glycogen nhận α-D-glucose Glycogen hoà tan nước nóng, cho màu đỏ tím đỏ nâu với iot Glycogen có số mạch nhiều tinh bột Phân tử lượng khoảng 2– triệu Da 1.4 Đặc tính chế tác dụng amylase Cơ chế tổng quát enzyme amylase sau: -amylase Tinh bộtDextrin + Oligosacharid Dextrin Pulluulanse DextrinMaltose Glucose -amylase Amyloglucosidase 1.4.1 α -amylase GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Enzyme α-amylasecó khả phân cắt liên kết α-1,4 glucozit nội phân tử chất cách ngẫu nhiên, không trật tự Do khả dextrin hóa cao nên gọi enzyme dịch hóa Enzyme α-amylase tác dụng chậm lên tinh bột nguyên thể tác dụng mạnh lên tinh bột bị hồ hóa Quá trình thủy phân tinh bột enzyme amylase:  Giai đoạn 1: dextrin hóa Chỉ số liên kết phân tử chất bị thủy phân tạo thành lượng dextrin, độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh  Giai đoạn 2: đường hóa Các dextrin vừa tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose glucose Dưới tác dụng α-amylase, qua thời gian dài phân tử tinh bột bị biến đổi sau: Thủy phân 87% Maltose + 13% Glucose Amylose Thủy phân 72% maltose + 19% glucose + 8% Isomaltose + 1% dextrin phân tử thấ Amylopectin Nhưng thông thường α-amylase thủy phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp maltose • Đặc tính α-amylase: - Trọng lượng phân tử trung bình từ 40000 – 60000 Da - Bền nhiệt so với loại enzyme khác (do có ion Ca 2+ giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba phân tử enzyme) - Bị kiềm hãm ion kim loại nặng Cu 2+, Pb2+, Hg2+ Các ion Mn2+,Na+,Mg2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính - Có thể thu nhận nấm mốc, vi khuẩn, thực vật GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm - Thường thể hoạt tính vùng acid yếu Ví dụ: + + + α-amylase nấm mốc hoạt động pH 4,5 - 5,8 α-amylase vi khuẩn hoạt động pH 5,8 – 6,1 α-amylase đại mạch hoạt động pH 4,7 -5,4 - Những chủng VSV có khả sinh tổng hợp α-amylase có ý nghĩa công nghiệp: B.subtilis, B.licheniformis, A.oryzae 1.4.2 β -amylase: Enzyme β-amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucozit, cắt gốc maltose từ đầu không khử mạch tinh bột Sản phẩm trình chủ yếu maltose.Enzyme VSV, có hạt nảy mầm Đặc tính β-amylase: - β-amylase khả thủy phân tinh bột sống, mà có khả thủy phân tinh bột hồ hóa - β-amylase giữ hoạt tính Ca 2+ , bị kiềm hãm Cu 2+ , Hg 2+ ,urea, iodine, ozon,… - β-amylase chịu nhiệt α – amylase bền với acid βamylase bị bất hoạt nhiệt độ 70oC Nhiệt độ hoạt động thích hợp β-amylase 50-60oC - β-amylase hoạt động pH thích hợp 4,2-5,6 1.4.3 γ - Amylase Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside phân tử tinh bột polysaccharide tương tự Tách phân tử glucose khỏi đầu không khử mạch để tạo phân tử glucose Đặc tính γ – Amylase: - Nhiệt độ hoạt động tối thích 50-600C, bị hoạt tính đun nóng 700C - γ-amylase hoạt động pH thích hợp 4,5-5 - γ-amylase bền acid bền ethanol, cetone - Không bị ức chế ion kim loại nặng Ag+, Hg 2+ Những chủng VSV có khả sinh tổng hợp γ-amylase có ý nghĩa công nghiệp: nấm mốc: A.niger, A.awamori, nấm men: Endomycopsis GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm 1.4.4 Pullulanase Có thể thủy phân liên kết α - 1,6 tinh bột, glucogen, pululan dextrin tới hạn Có thể thu nhận từ vi khuẩn Aerobacter aerogenes, Klebsiella Sản phẩm tạo thành glucose.Enzyme thường sử dụng kết hợp với amyloglucosidase Hoạt tính tối ưu chúng pH=6 nhiệt độ 600C Khi kết hợp vớiamyloglucosidase hoạt tính tối ưu pH= 4-5, nhiệt độ 450C 1.4.5 Amylo 1,6-glucosidase Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme thủy phân maltose thành glucose không thủy phân tinh bột 1.4.6 Oligo-1,6glucosidase (Transglucosylase) Thủy phân liên kết 1,6-glucoside dextrin tới hạn tạo thành isomaltose, panose làm đắng dịch thủy phân.Được tìm thấy canh trường nấm sợi Asp.niger, Asp oryzae, Asp awamori.Sự có mặt Transglucosylase chế phẩm amylase điều không mong muốn 10 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Sau trộn giống, môi trường trải khay với chiều dài 2-3cm, đưa vào phòng nuôi cấy, đặt giá đỡ Các giá đỡ thiết kế cho lượng không khí lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ độ ẩm không khí Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển 28-300C Nhiệt độ thấp cao ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển Trong trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn môi trường tĩnh nên thay đổi pH vùng ảnh hưởng đến toàn khối môi trường Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 Điều phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae điều kiện môi trường phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy Quá trình phát triển nấm mốc môi trường bán rắn nuôi phương pháp bề mặt trải qua giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn kéo dài 10-14 kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy Ở giai đoạn có thay đổi sau: - Nhiệt độ tăng chậm Sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng màu sữa Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có thay đổi Khối môi trường rời rạc Enzyme bắt đầu đươc hình thành Trong giai đoạn phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không đưa nhiệt độ cao 30 0C thời kỳ đầu giống mẫn cảm với nhiệt độ Giai đoạn 2: Giai đoạn kéo dài 14-18 Trong giai đoạn có thay đổi sau: Toàn bào tử phát triển thành sợi nấm sợi nấm bắt đầu phát triển mạnh sợi nấm tạo mạng sợi chằng chịt khắp hạt môi trường lòng môi trường -Trong giai đoạn ta hoàn toàn nhìn rõ sợi nấm có màu trắng xám mắt thường 28 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm -Môi trường kết lại chặt -Độ ẩm môi trường giảm dần -Nhiệt độ môi trường tăng nhanh lên tới 40-45 0C -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh đồng hoá mạnh nấm sợi -Enzyme amylase tổng hợp mạnh -Lượng O2 không khí giảm CO2 tăng dần, giai đoạn cần phải thông khí mạnh nhiệt độ cố gắng trì khoảng 29-300C tốt Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài 10-20 Ở giai đoạn có số thay đổi sau: - Quá trình trao đổi chất yếu dần, mức độ giảm chất dinh - dưỡng chậm lại Nhiệt độ khối môi trường giảm, làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25% Nhiệt dộ nuôi trì 300C,trong giai đoạn này, bào tử hình thành nhiều luợng enzym amylase tạo giảm xuống Chính việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym cần thiết 3.3.4.4 Thu nhận chế phẩm enzyme thô Kết thúc trình nuôi cấy ta thu nhận chế phẩm enzym amylase, chế phẩm gọi chế phẩm enzym thô (vì thành phần enzym ra, chúng chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường nước môi trường) Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme thô đến độ ẩm thấp Độ ẩm cần đạt sau trình sấy kết thúc nhỏ 10% độ ẩm Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy nhiệt độ 38400C Enzym α-amylase nấm mốc Asp.oryzae bị bất hoạt nhiệt độ lên đến 60-700C Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà nhà sản xuất mà dùng enzyme thô mà không cần trình tinh Trong trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm enzyme 29 GVHD: Trần Thị Minh Hà 3.3.4.5 SVTH: Nhóm Tinh Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành sau: • Nghiền: Toàn khối lượng enzym thô amylase đem nghiền Mục đích trình nghiền vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ thành phần chế phẩm thô Khi thành tế bào phá vỡ, enzym nội bào chưa thoát khỏi tế bào dễ dàng thoát khỏi tế bào Phần lớn enzyme amylase ngoại bào tổng hợp thoát khỏi tế bào thấm vào thành phần môi • trường Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát khỏi thành phần dễ dàng Trích ly: Sau nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym αamylase Các loại enzyme thủy phân có khả tan nước nên người ta thường dùng nước dung môi hòa tan Cứ phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ sau lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( ý cần loại bỏ cát thạch anh bột thủy tinh khỏi hỗn hợp bã cho gia súc ăn) Dịch thu nhận dạng chế phẩm enzym thô có chứa nước, chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tách enzym khỏi vật chất Dịch thu nhận dạng chế phẩm enzym thô có chứa nước, chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tách enzym khỏi vật chất 3.3.4.6 Kết tủa enzyme Để làm việc người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ tác nhân gây tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn sulfat amon Hai tác nhân kết tủa dễ tìm kiếm giá rẻ so với tác nhân gây tủa khác Trong tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh dung dịch enzyme thô tác nhân kết tủa xuống từ 4-7 0C để tránh làm hoạt tính enzyme Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải từ từ để tránh tượng biến tính 30 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn sulfat amon với liều lượng sau: Cứ phần dung dịch enzym thô người ta 2,5 lần cồn sulfat amon Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau để yên điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7 0C) theo thời gian, enzym tạo kết tủa lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn lọc thu nhận kết tủa dạng paste (độ ẩm lớn 70%W) Ở trạng thái enzym dễ bị biến tính nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme α-amylase 400C độ ẩm cuối đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng máy sấy phun sương) Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme α-amylase dạng kết tủa hoàn toàn chưa mặt hóa học chứa số enzyme enzyme amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzyme α- amylase chứa hoạt tính protase có tính acid cellulose muốn thu nhận enzyme có độ tinh khiết cao ta phải tinh tiếp tục tinh enzyme - Hoà tan dung dịch đệm Tris-HCI 0,05M (pH= 8) nhằm giúp trạng thái pH - dung ổn định Thực sắc kí trao đổi ion dung dịch enzyme vừa hoà tan cột DEAE-cellulose với mục đích loại protein tạp kể acid nucleic khỏi enzyme Có thể tiếp tục thực tiếp lần lọc thứ hai sau lần lọc thứ thay chất giá cellulose chất giá Sephadex Sau enzyme tách rửa - NaCl nồng độ 0,5M Dịch enzyme sau thu đưa siêu lọc nhằm cô đặc enzyme lại Đem enzyme sấy khô để enzyme dạng bột tinh khiết Để nâng cao giá trị sử dụng, người ta thường tạo chế phẩm enzyme gọi enzyme không tan (hay enzym cố định) Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme không tan: phương pháp hấp phụ vật lí; phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel; phương pháp cộng hóa trị enzyme chất mang phương pháp dùng phổ biến 3.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae 3.3.5.1 Sinh trưởng sinh tổng hợp amylase từ nấm 31 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Khi nuôi VSV tạo amylase có trình liên quan mật thiết với Quá trình tổng hợp sinh khối VSV trình tích tụ enzyme tế bào môi trường Ở số VSV, trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với trình sinh trưởng, nghĩa tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào tăng khối Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc pha logarit đồng thời với ngưng sinh trưởng bắt đầu pha phát triển ổn định sau Tuy nhiên theo ý kiến nhiều tác giả, tạo thành amylase cực đại thường xảy sau quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng Trong trường hợp này, sinh trưởng VSV không kèm theo tích lũy enzyme amylase canh trường, sau kết thúc pha sinh trưởng xảy tổng hợp enzyme cực lớn 3.3.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng Nitơ quan trọng Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô Natri Nitrat nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase Hàm lượng thường sử dụng 0,91% Nari Nitrat Amoni Nitrat có hiệu qủa so với loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….) Cho nguồn Nitơ định vào môi trường kích thích tổng hợp amylase ức chế tổng hợp amylase khác Ví dụ: Kết qủa thí nghiệm Fenikvova cộng tác viên việc sử dụng nguồn Nitơ từ muối khác 32 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Bảng : Ảnh hưởng nguồn nitơ tới sinh tổng hợp enzyme amylase) ( trích sách Công nghệ enzym Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004) Ngoài cần phải xác định tỷ lệ nguồn carbon Nitơ môi trường phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển Tính cân môi trường dinh dưỡng carbon Nitơ có ý nghĩa lớn sinh tổng hợp sinh khối nấm Asp.oryzae tạo thành amylase Ảnh hưởng Amino acid Amino acid cấu tử hợp thành phân tử enzym, có số amino acid không đồng giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid có giá trị lớn cho chất lượng Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý nấm mốc việc sinh tổng hợp enzym amylase nguyên nhân sau: -Amino acid đồng thời vừa nguồn carbon , nguồn Nitơ vừa nguồn lượng -Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng vai trò vô quan trọng trao đổi amino acid cụ thể sinh tổng hợp nhiều amino acid khác qúa trình chuyển amine hóa Nhờ số amino acid trước hết glutamic acid, aspatic acid mà thực đồng hóa dị dưỡng CO2 -Nhiều amino acid tham gia vào thành phần vitamin tan nước như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …các vitamin có ý nghĩa sinh học lớn Ngoài có nhận xét cho tổng hợp ARN tế bào số VSV phụ thuộc vào có mặt amino acid môi trường nuôi -Amino acid có tính đặc hiệu cảm ứng kiềm chế sinh tổng hợp enzyme Một số amino acid kích thích làm tăng cường sinh tổng hợp enzyme amylase, số lại có tác dụng ức chế ngược lại số khác ảnh hưởng Ảnh hưởng nguồn khoáng dinh dưỡng Các yếu tố đa lượng vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tổng hợp enzym, α-amylsae nấm mốc Asp.oryzae -Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bên nhiệt enzym Thiếu MgSO4 có ảnh hưởng xấu đến tổng hợp amylase nấm sợi Khi tổng hợp αamylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu muối cho tổng hợp α-amylase 0,05% 33 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm -Phospho cần để tổng hợp hợp phần quan trọng sinh chất (nucleic phospholipide acid) nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trình oxy hóa sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản nấm sợi, mà tăng cường tổng hợp enzym Các muối phosphate thường dùng với nồng độ cao tới 0.15M Hoạt độ α-amylase tăng cao có 0,1% KH2PO4 -Canxi(Ca) cần cho tổng hợp ổn định α-amylase hoạt động cấu tử thiếu enzym Canxi có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động protease ( Hsiu et amiloza, 1964) Muốn tích lũy nhiều αamylase cấn có lượng Ca môi trường 0,01-0,05% -Lưu huỳnh(S) kích thích tạo amylase ( S có thành phần amino acid quan trọng : methionine, cystein, cystine) Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường thích hợp cho Asp.oryzae tạo amylase Ngoài nguyên tố đa lượng cần ý thêm với nguyên tố vi lượng Chẳnng hạn như: Coban, kẽm,…và nguyên tố gây ức chế tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, … 3.4 Ứng dụng Enzyme amylase nghiên cứu ứng dụng rộng rãi sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương nước chấm …ở quy mô công nghiệp + Trong sản xuất maltosedextrin: sử dụng amylase xúc tác thủy phân không hoàn toàn tinh bột tạọ thành maltosedextrin + Ứng dụng amylase sản xuất bia: sử dụng enzyme amylase tổng hợp để thay cho enzyme amylase có malt đại mạch + Ứng dụng amylase sản xuất cồn : Giai đọan đường hóa sản xuất cồn, bắt buộc phải sử dụng enzym amylase để thủy phân tinh bột (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột acid) + Ứng dụng amylase chế biến thực phẩm gia súc: 34 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm khối lượng lớn Enzym amylase tham gia phân giải tinh bột ngũ cốc tạo thành đường, giúp cho trình chuyển hóa tinh bột tốt + Ứng dụng enzym amylase công nghiệp dệt:Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase vi khuẩn để tẩy tinh bột làm cho vải mềm 35 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN XUẤT MALTOSEDEXTRIN Giới thiệu maltosedextrin Maltosedextrin loại polysaccharide không ngọt, có CTPT (C 6H 10O 5) H2O, sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn (bằng enzyme acid), có đương lượng dextrose (DE) từ đến 20 Đặc tính maltosedextrin phụ thuộc vào số DE Sản phẩm dạng bột dung dịch đậm đặc Maltosedextrin dạng bột có màu trắng, hút ẩm, tan tốt dung dịch trong, không màu, không ngọt Maltosedextrin loại phụ gia có nhiều Maltosedextrin ứng dụng công nghệ thực phẩm dược phẩm Trong công nghệ thực phẩm, maltosedextrin chất cố định mùi vị, thay đổi cấu trúc tăng cảm quan thực phẩm, chất trợ sấy tăng lượng cho thực phẩm ăn kiêng, giúp thực phẩm dễ hòa tan, dễ tiêu hóa, tăng giá trị dinh dưỡng Maltosedextrin dùng sản xuất sữa bột, bột trái hòa tan, cà phê, bánh ngọt, tương ớt, Trong dược phẩm maltosedextrin dùng làm chất độn để phối chế thuốc 4.1 Qui trình sản xuất maltosedextrin 36 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm Tinh bột Thủy phân Enzyme Amylase Tẩy màu Lọc Sấy Thành phẩm 4.2 Thuyết minh qui trình 4.2.1 Nguyên liệu Sản xuất maltosedextrin từ tinh bột sắn, nguồn nguyên liệu dồi rẻ tiền, chất lượng phù hợp để sản xuất maltodextrin Nguyên liệu chứa tinh bột tinh, hàm lượng protein chất lượng dịch thủy phân tốt, bị sẫm màu, tinh chế dễ dàng 4.2.2 Thủy phân Trong qui trình này, tiến hành thủy phân tinh bột sắn enzyme có trình sau: • Quá trình hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào tinh bột biến đổi tinh bột sang dạng hòa tan nước Hồ hóa nhiệt độ lớn 100 0C, nhiệt độ cao làm duỗi cấu trúc xoắn kép amylopectin, phức amylose-lipid giải phóng giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể, tạo điều kiện để nước enzyme 37 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm xâm nhập sâu vào cắt mạch polyme dài thành mạch ngắn cách đồng • Quá trình dịch hóa: dung dịch hồ có độ nhớt cao gây cản trở hoạt động enzyme dễ gây cháy cục nâng nhiệt Dưới tác dụng -amylase, phân tử tinh bột bị cắt ngẫy nhiên thành dextrin làm độ nhớt dung dịch giảm nhanh chóng Với có mặt -amylase, dịch hóa xảy song song với hồ hóa khởi đầu trình thủy phân tinh bột Nước nóng có nhiệt độ 30 – 400C hoà với tinh bột sắn nồi nấu theo tỷ lệ nước/bột 4/1-5/1 cho cánh khuấy hoạt động Cho chế phẩm enzyme cần dùng vào khối nấu (tỉ lệ chế phẩm enzyme amylase 0,02-0,03% so với khối lượng bột).Điều chỉnh pH phù hợp với pH nguyên liệu Sau đạt giá trị DE theo yêu cầu, pH dịch thuỷ phân sản phẩm đưa giá trị acid, nhằm mục đích dừng phản ứng thuỷ phân enzyme, bảo đảm sản phẩm có giá trị DE đạt yêu cầu Ngoài ra, có tác dụng làm giảm phản ứng polyme hoá ngược tạo phần tử kích thước lớn làm tăng độ nhớt tính thoái hoá, pH acid hạn chế tối đa phản ứng phân huỷ phản ứng Mailard gây sẫm màu 4.2.3 Tẩy màu Dung dịch tinh bột sau thuỷ phân thường bị sẫm màu Tiến hành tẩy màu than hoạt tính để thu dung dịch trong, hoàn toàn không màu, không mùi không vị 4.2.4 Lọc Dung dịch tinh bột sau thuỷ phân thường chứa khoảng 0.9-1.9% khối lượng chất lơ lửng (bao gồm phân tử protein, lipid nguyên liệu ban đầu, tinh bột chưa thuỷ phân) Dung dịch sau tẩy màu lọc phương pháp lọc hút chân không lọc ép khung có trợ lọc diatomic (áp suất lọc lên tới 0.3-0.5 MPa) nhiệt độ 700C 4.2.5 Sấy Dịch maltodextrin sau lọc tẩy màu sấy phun chế độ thích hợp để thu sản phẩm bột hay dạng mịn màu trắng 38 GVHD: Trần Thị Minh Hà 4.3 SVTH: Nhóm Vai trò amylase sản xuất maltosedextrin Quá trình thuỷ phân thực enzyme -amylase vi khuẩn từ chủng Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis enzyme có hoạt tính cao khả bền nhiệt cao Việc sử dụng nguồn enzyme có khả tạo nhiều đường oligo mạch dài trung bình giúp sản phẩm maltodextrin thu có tính chất tốt vị, độ nhớt độ ổn định Enzyme α-amylase từ nguồn khác có nhiều điểm giống Enzyme α-amylase có khả phân cắt liên kết α-1,4 glucozit nội phân tử chất cách ngẫu nhiên, không trật tự Enzyme α-amylase tác dụng chậm lên tinh bột nguyên thể tác dụng mạnh lên tinh bột bị hồ hóa Quá trình thuỷ phân tinh bột trình đa giai đoạn Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hoá) số phân tử chất bị thuỷ phân tạo thành lượng lớn dextrin phân tử lượng thấp, độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose amylopectin bị dịch hoá nhanh) Dưới tác dụng α-amylase, amylose bị phân giải nhanh thành oligosacharide gồm 6-7 gốc glucose Sau polyglucose bị phân cắt tiếp tục nên mạch polyglucose colagen ngắn dần bị phân giải chậm đến maltodextrose maltotriose maltose Tác dụng α-amylase lên amylopectin xảy tương tự, α-amylase không phân cắt liên kết α-1,6 glucoside nên chỗ mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu sản phẩm cuối có dextrin phân tử lượng thấp izomaltose Đặc tính quan trọng α-amylase sản xuất maltodextrin enzyme thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine maltose Khả dextrin hoá cao α- amylase tính chất đặc trưng Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá Enzyme α-amylase bền nhiệt enzyme khác Người ta cho đặc tính enzyme α-amylase có liên quan đến hàm lượng Calcium có phân tử (α-amylase vi khuẩn ưa nhiệt có nhiều canxi α39 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm amylase nấm mốc 3- lần nên bền nhiệt hơn) Ưu điểm việc sử dụng enzyme - Tính ổn định nhiệt tốt cho trình dịch hóa tinh bột - Sinh dịch dextrose có độ nhớt thấp 80 – 900C 90 phút - Dịch hóa toàn tinh bột pH = 5.8 nhiệt độ 80 – 850C - Làm tăng suất trình lên men trình nấu cháo - Sinh lên men sinh vật không biến đổi gen - Thành phần hoàn toàn tự nhiên, thành phần nhân tạo tổng hợp Thủy phân tinh bột không enzyme, acid có qui trình thay đổi bên Tuy nhiên, 40 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm KẾT LUẬN-BÀN LUẬN-ĐỀ NGHỊ 41 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Hiền ( chủ biên), Công nghệ sản xuất mì sản phẩm lên men cổ truyền, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2006 Nguyễn Đức Lượng số tác giả, Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004 Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp ( Công nghệ vi sinh Tập 2), NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2006 Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2006 Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình công nghệ enzym, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp.HCM, 2008 www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf www.en.wikipedia.org http://ttmindustry.vn http://www.semvn.net 42 [...]... nghiệp + Trong sản xuất maltosedextrin: sử dụng amylase xúc tác thủy phân không hoàn toàn tinh bột tạọ thành maltosedextrin + Ứng dụng amylase trong sản xuất bia: sử dụng enzyme amylase tổng hợp để thay thế cho enzyme amylase có trong malt đại mạch + Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn : Giai đọan đường hóa trong sản xuất cồn, bắt buộc phải sử dụng enzym amylase để thủy phân tinh bột (không thể sử dụng. .. nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme theo qui mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm  VSVcó thể tổng hợp cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau • Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ sản xuất enzyme  Quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy: giống tốt thì năng xuất enzyme thu được sẽ cao  Quyết định đến hoạt tính enzyme: sử dụng hoạt tính riêng để so sánh và đánh giá chất lượng của enzyme  Quyết... Asp.oryzae tạo amylase Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng Chẳnng hạn như: Coban, kẽm, và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, … 3.4 Ứng dụng Enzyme amylase được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp... DE Sản phẩm có thể ở dạng bột hoặc dung dịch đậm đặc Maltosedextrin ở dạng bột có màu trắng, ít hút ẩm, tan tốt trong dung dịch trong, không màu, không ngọt hoặc ít ngọt Maltosedextrin là một loại phụ gia có nhiều Maltosedextrin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm Trong công nghệ thực phẩm, maltosedextrin là chất cố định mùi vị, thay đổi cấu trúc và tăng cảm quan thực phẩm, chất trợ sấy và. .. acid) + Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc: 34 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm 9 Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột trong ngũ cốc tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn + Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt :Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase. .. tinh bột và làm cho vải mềm 35 GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm 9 CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN XUẤT MALTOSEDEXTRIN 4 Giới thiệu về maltosedextrin Maltosedextrin là các loại polysaccharide không ngọt, có CTPT là (C 6H 10O 5) H2O, là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn (bằng enzyme hoặc acid), có đương lượng dextrose (DE) từ 4 đến 20 Đặc tính của maltosedextrin phụ thuộc vào chỉ... Minh Hà SVTH: Nhóm 9 CHƯƠNG 3: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α -AMYLASE 3 Nguồn thu nhận Enzyme Amylase có trong các tế bào thực vật, động vật, vi sinh vật (nấm mốc) • Động vật Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia... Bac Circulans - Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α -Amylase hoạt động ở 65 0C cùng với proteinase và các Enzyme khác Enzyme amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật và VSV Hiện nay việc sản xuất enzyme theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh vật... định đến vốn đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất enzyme: giống tốt, năng suất cao thì vốn đầu tư sẽ ít đi  Quyết định giá thành sản phẩm: giống có chất lượng cao, chi phí cho một đơn vị enzyme sẽ thấp hơn giống có chất lượng thấp • Yêu cầu giống VSV trong công nghệ enzyme:  Phải có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme cần sản xuất  Phải có khả năng thích ứng rất nhanh và phát triển mạnh 16 GVHD: Trần Thị... hợp enzyme tạo ra sản phẩm cuối này − Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme: Trong quá trình trao đổi chất ở VSV có quá trình dị hóa (dị hóa trong tế bào, dị hóa ngoài tế bào) Để thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa đó, VSV sẽ phải tổng hợp ra những enzyme tương ứng Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực hiện các hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bào Các enzyme