Lý do chọn đề tàiTrong sinh giới, một sinh vật được sinh ra, lớn lên, già đi rồi chết. Và con người cũng không phải là ngoại lệ, sự già đi của con người là một tất yếu của tự nhiên, được tự nhiên “lập trình” từ trước. Từ xưa đã có bao câu chuyện về các phương thuốc huyền bí “cải lão hoàn đồng” hay phép màu “trường sinh bất lão”. Tuy nhiên, trong thực tế, chỉ đến giữa thế kỉ XX và cũng chỉ ở các nước phát triển, nhờ có tiến bộ về mức sống và chăm sóc y tế, con người mới có tuổi thọ trung bình vượt hẳn lên so với tuổi sinh sản. Và chỉ vài chục năm gần đây, với sự phát triển của khoa học kĩ thuật trong nghiên cứu Sinh học phân tử đã giúp chúng ta dần dần hiểu được phần nào đâu là nguyên nhân làm cho con người già đi.Con người được tạo ra từ sự kết hợp của trứng và tinh trùng, để tạo ra một tế bào phôi thai. Tế bào đó tiếp tục tự nhân đôi theo cấp số nhân: 1, 2, 4, 8, 16,…, 2n trong tử cung người mẹ cho đến khi thành hình hài của một đứa bé hoàn chỉnh sau khoảng 9 tháng 10 ngày. Mỗi chúng ta đều đã được sinh ra như thế. Do đó, đã có giả thuyết cho rằng tế bào của con người có khả năng nhân đôi mãi mãi, vì thế, chúng ta mới có thể lớn lên từ một đứa bé. Nhưng tại sao chúng ta không lớn lên mãi mà lại già đi? Mãi đến tận năm 1961, hai nhà khoa học người Mỹ Leonard Hayflick và Paul Moorehead mới phát hiện ra tế bào con người khi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì đều có tuổi thọ nhất định, chứ không hề nhân đôi lên mãi mãi. Phát hiện này đã mở đầu cho một giai đoạn mới trong nghiên cứu về quá trình già đi của con người, hay còn gọi là quá trình lão hóa. Các nhà khoa học nhờ đó mà nhận ra rằng con người già đi là do các tế bào dần dần mất đi khả năng nhân đôi của chúng đó cũng là lúc con người già đi để rồi qua đời. Vậy, nguyên nhân nào dẫn đến sự ngừng phân chia của tế bào? Tại sao có những loại tế bào trong cơ thể lại có khả năng phân chia vô hạn? Và những điều này đã được ứng dụng để giải thích các vấn đề trong thực tế ra sao? Để làm rõ một trong số các nguyên nhân dẫn đến vấn đề này, người viết đã chọn đề tài “Telomere, enzyme Telomerase và ứng dụng công nghệ gen ”.Mục đích nghiên cứuThông qua đề tài này giúp bản thân nắm vững hơn những kiến thức lý thuyết về đầu mút nhiễm sắc thể telomere, nghiên cứu rõ hơn mối liên hệ giữa telomere, enzyme telomerase, sự lão hóa và ung thư và ứng dụng công nghệ gen vào chữa các bệnh lão hóa, ung thư.Đồng thời nhằm học tập phương pháp nghiên cứu khoa học, cũng như tích lũy kiến thức phục vụ cho quá trình học tập và giảng dạy về sau.Phương pháp nghiên cứuPhương pháp phân loại lý thuyết: Sắp xếp các tài liệu khoa học từ nhiều nguồn như giáo trình, bài giảng, tạp chí khoa học, internet thành từng đơn vị kiến thức và từng vấn đề.Phương pháp hệ thống hóa lý thuyết: Sắp xếp các thông tin đã thu thập được thành một hệ thống với kết cấu chặt chẽ.Phương pháp chuyên gia: Hỏi ý kiến giáo viên hướng dẫn về vấn đề nghiên cứu.4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứuĐối tượng nghiên cứu: Sinh vật nhân chuẩn.Phạm vi nghiên cứu: Chỉ tập trung nghiên cứu Telomere, enzyme Telomerase trong tế bào và một số vấn đề liên quan đến ứng dụng của công nghệ gen với quá trình lão hóa, ung thư.
Phần I MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong sinh giới, sinh vật sinh ra, lớn lên, già chết Và người ngoại lệ, già người tất yếu tự nhiên, tự nhiên “lập trình” từ trước Từ xưa có bao câu chuyện phương thuốc huyền bí “cải lão hồn đồng” hay phép màu “trường sinh bất lão” Tuy nhiên, thực tế, đến kỉ XX nước phát triển, nhờ có tiến mức sống chăm sóc y tế, người có tuổi thọ trung bình vượt hẳn lên so với tuổi sinh sản Và vài chục năm gần đây, với phát triển khoa học kĩ thuật nghiên cứu Sinh học phân tử giúp hiểu phần đâu nguyên nhân làm cho người già Con người tạo từ kết hợp trứng tinh trùng, để tạo tế bào phôi thai Tế bào tiếp tục tự nhân đơi theo cấp số nhân: 1, 2, 4, 8, 16,…, tử cung người mẹ thành hình hài đứa bé hoàn chỉnh sau khoảng tháng 10 ngày Mỗi sinh Do đó, có giả thuyết cho tế bào người có khả nhân đơi mãi, thế, lớn lên từ đứa bé Nhưng không lớn lên mà lại già đi? Mãi đến tận năm 1961, hai nhà khoa học người Mỹ Leonard Hayflick Paul Moorehead phát tế bào người ni cấy phòng thí nghiệm có tuổi thọ định, khơng nhân đơi lên mãi Phát mở đầu cho giai đoạn nghiên cứu trình già người, hay gọi trình lão hóa Các nhà khoa học nhờ mà nhận người già tế bào khả nhân đôi chúng - lúc người già để qua đời Vậy, nguyên nhân dẫn đến ngừng phân chia tế bào? Tại có loại tế bào thể lại có khả phân chia vô hạn? Và điều ứng dụng để giải thích vấn đề thực tế sao? Để làm rõ số nguyên nhân dẫn đến vấn đề này, người viết chọn đề tài “Telomere, enzyme Telomerase ứng dụng cơng nghệ gen ” Mục đích nghiên cứu Thông qua đề tài giúp thân nắm vững kiến thức lý thuyết đầu mút nhiễm sắc thể - telomere, nghiên cứu rõ mối liên hệ telomere, enzyme telomerase, lão hóa ung thư ứng dụng công nghệ gen vào chữa bệnh lão hóa, ung thư Đồng thời nhằm học tập phương pháp nghiên cứu khoa học, tích lũy kiến thức phục vụ cho trình học tập giảng dạy sau Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân loại lý thuyết: Sắp xếp tài liệu khoa học từ nhiều nguồn giáo trình, giảng, tạp chí khoa học, internet thành đơn vị kiến thức vấn đề - Phương pháp hệ thống hóa lý thuyết: Sắp xếp thơng tin thu thập thành hệ thống với kết cấu chặt chẽ - Phương pháp chuyên gia: Hỏi ý kiến giáo viên hướng dẫn vấn đề nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Sinh vật nhân chuẩn - Phạm vi nghiên cứu: Chỉ tập trung nghiên cứu Telomere, enzyme Telomerase tế bào số vấn đề liên quan đến ứng dụng công nghệ gen với q trình lão hóa, ung thư Phần II NỘI DUNG I Tổng quan 1.1 Hệ sau lần phân chia tế bào nhân thực Sự phân chia tế bào xảy dựa sở nhân đơi (tái bản) ADN Bóng chép ADN tổng quát Điểm khởi đầu chép Mạch dẫn đầu Mạch chậm Mạch dẫn đầu tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ AND polymerase III Protein liên kết mạch đơn giúp mạch khuôn sau tháo xoắn trở nên ổn định Helise Mạch đầu Mạch dẫn đầu Mạch chậm Chiều chép dẫn ADN “mẹ” Mạch chậm Primase bắt đầu tổng hợp mồi ARN cho đoạn Okazaki thứ năm ADN pol III hoàn thành tổng hợp đoạn Okazaki thứ tư Khi tiếp cận mồi Okazaki thứ 3, tách ra, di chuyển đến chạc chép tiếp tục bổ sung nucleotide vào đầu 3’ đoạn mồi thuộc đoạn Okazaki thứ ADN pol I loại bỏ đoạn mồi đầu 5’ đoạn Okazaki thứ 2, thay nucleotide ADN việc bổ sung nucleotide vào đầu 3’ đoạn Okazaki thứ ADN ligase nối đầu 3’ đoạn Okazaki thứ với đầu 5’ đoạn Okazaki thứ Hình 1: Tóm tắt q trình chép AND vi khuẩn Trong chế tái bản, ADN tổng hợp theo hai mạch song song Sự tháo xoắn thực từ đầu đến đầu ADN với xúc tác enzyme helicase, mạch kép ADN tháo xoắn đến đâu phức hệ enzyme ADN polymerase xúc tác tổng hợp mạch đến Vấn đề xuất hệ enzyme ADN polymerase cần có đầu 3’-OH tự thực trình tổng hợp kéo dài mạch Nhờ tế bào có enzyme ARN polymerase, tự có đầu 3’-OH tự nên có khả khởi đầu q trình tổng hợp Do đó, chế tự nhân đôi nhân tế bào “mượn tạm” enzyme thực trình tổng hợp đoạn nhỏ mạch ARN (các primer - ARN mồi) bổ sung với mạch khuôn ADN nhằm tạo đầu 3’-OH tự giúp ADN polymerase thực chức Tuy nhiên, việc khắc phục “nhược điểm” lại để lộ “nhược điểm” khác chế tái sinh cấp độ phân tử – tái ADN Do mạch ADN tổng hợp theo chiều từ 5’ - 3’ (dưới tác dụng ADN polymerase trượt mạch khuôn theo chiều 3’ – 5’) nên tái hai mạch đơn ADN diễn không giống nhau: + Một mạch tổng hợp liên tục chiều với tháo xoắn ADN gọi mạch dẫn đầu với đoạn primer cho vị trí khởi tái (điểm ori) + Một mạch tổng hợp gián đoạn ngược chiều với tháo xoắn ADN gọi mạch chậm với nhiều đoạn primer khởi đầu cho phân đoạn Okazaki có chiều dài khoảng 1000 – 2000 cặp nucleotide Các primer dài từ hàng chục đến hàng trăm nucleotide Trên mạch chậm, sau hồn tất q trình tổng hợp phân đoạn Okazaki, ADN polymerase I với hoạt tính exonuclease vừa phân giải primer, vừa tổng hợp đoạn ADN thay dựa đầu 3′-OH đoạn ADN tổng hợp trước Mặc dù khả chép enzyme ADN polymerase “ấn tượng”, tế bào có lượng nhỏ trình tự mà enzyme ADN polymerase khơng thể chép sửa chữa Đối với phân tử ADN mạch thẳng, chẳng hạn nhiễm sắc thể sinh vật nhân thực, ADN polymerase bổ sung nucleotide vào đầu 3’-OH chuỗi polynucletide kéo dài, điều dẫn đến vấn đề là: Bộ máy chép khơng có cách để chép hoàn chỉnh phần đầu 5’-P mạch ADN Ngay đoạn Okazaki bắt đầu đoạn mồi ARN liên kết với đầu tận mạch ADN Hình 2: Đầu mút phân tử ADN mạch thẳng ngắn lại sau lần chép làm khuôn không thay ADN khơng có sẵn đầu 3’-OH phía trước để phản ứng bổ sung nucleotide diễn Kết sau lần chép, phân tử ADN sợi kép ngày ngắn lại có đầu khơng (còn gọi đầu “so le”) Hiện tượng phân tử ADN có xu hướng ngắn sau lần chép thường không xảy sinh vật nhân sơ, phân tử ADN chúng có dạng vòng (tức khơng có đầu mút) Vậy, chế bảo vệ gene sinh vật nhân thực không sau lần chép ADN nối tiếp nhau? Các kết nghiên cứu Elizabeth Blackburn cộng giải đáp cho vấn đề Các telomere khơng chứa gene; thay chúng có cấu trúc đơn giản gồm trình tự ngắn (6-8 bp) lặp lại nối tiếp ngàn lần đặc thù cho loài 1.2 Lịch sử nghiên cứu Ý tưởng nhiễm sắc thể có cấu trúc đầu mút đặc biệt xuất từ thí nghiệm Hermann Muller - Năm 1928: Muller dùng tia X xử lý đối tượng Drosophila Kết mà ông đạt đảo đoạn khuyết đoạn đầu mút nhiễm sắc thể Khi ấy, ông gợi ý chúng “phần tận cùng”(end part) mà thơi, vai trò chúng ơng chưa biết đến Hình 3: Hermann Muller - Năm 1941-1942: Ý tưởng telomere có phần phát triển nhờ thí nghiệm ngơ Barbara McClintock Bà cho rằng, telomere dạng cấu trúc nằm đầu mút chúng cần thiết cho tính ổn định nhiễm sắc thể Mãi đến năm 70, qua nhiêù cơng trình nghiên cứu nhà khoa học đương thời, trội số nữ khoa học gia Elizabeth Blacburn - Năm 1978: E.Blackburn nghiên cứu gen nhóm lơng tơ Tetrahymena, bà phát thấy chúng chứa nối tiếp với trình tự gồm nucleotit TTGGGG Từ đó, tên telomere (đầu mút nhiễm sắc thể) đặt với cấu trúc trình tự lặp đơn giản Bên cạnh đó, kiện khơng phần quan trọng phát enzyme telomere, telomerase - Năm 1984: C Greider E.Blackburn nghiên cứu ADN nấm men Họ phát thấy chúng có phương thức tái đầu mút khác thường, không giống kiểu tái ADN polymerase Họ thấy nhờ tác nhân khởi đầu kéo dài telomere cách nối thêm vào trình tự đoạn lặp Họ đặt tên cho tác nhân telomerase Với cơng trình trên, nhà khoa học Blackburn, Szostak Greider nhận giải Nobel Y học năm 2009 Hình 4: E.Blackburn, C Greider W.Szostak - Năm 1984, Greider tìm dấu vết hoạt động enzyme dịch chiết tế bào Bà Blackburn gọi chúng Telomerase Telomerase cung cấp sở để ADN polymerase chép toàn chiều dài ADN Với cơng trình trên, nhà khoa học Blackburn, Szostak Greider nhận giải Nobel Y học năm 2009 Trong thời gian sau đó, có nhiều thí nghiệm chứng tỏ đầu mút nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn có cấu trúc tương tự nhau, gồm nhiều nucleotit lặp lại đơn giản Ngoài ra, telomere với cấu trúc khám phá, gắn kết với số protein khác Theo dòng thời gian, ta kể đến số cơng trình sau: - Năm 1980: Oka cs tìm thấy trình tự đầu mút Hypotrichous TTTTGGG - Năm 1986-1987: Cũng từ đối tượng Hypotrichous clitaes này, Gottchling Price phát protein đặc biệt liên kết với telomere - Năm 1988: Eric Richards tìm thấy Arabidopsis với trình tự TTTAGGG Đặc biệt năm trình tự telomere người TTAGGG nhận Moyzis - Năm 1989: Henderson Blackburn thấy telomere có sợi lơ lửng 3’ nhơ giàu C - Năm 1990: Nhóm Titia de Lange phát TRF1-một loại protein gắn kết với ADN telomere đặc trưng động vật có vú - Năm 1999: Nhóm Titia Jack Griffth nhận thấy tượng telomere uốn gấp trở lại tạo thành cấu trúc giống dây thòng lọng, họ gọi nút telomere (t-loop) Bên cạnh đó, vấn đề liên quan mà khơng thể khơng nhắc đến nói telomere Đó lão hố tế bào Nghiên cứu lão hố tế bào có nguồn gốc từ suy nghĩ nhà sinh học người Đức August Weismann - Năm 1881, Weismann cho tế bào động vật bậc cao có giới hạn khả tăng sinh Nhưng vấn đề ơng lại khơng có đủ chứng cho dự đốn Weismann phát biểu “… chết xảy mơ mệt mỏi, khơng thể tái tạo trở lại Đồng thời, mơ có giới hạn sinh trưởng, có nghĩa tế bào khơng phải phân chia mà chúng có giới hạn” (Weismann-1891) - Đến năm 1907: Tế bào bị chết quan sát kỹ từ thí nghiệm ni cấy mơ Ross Harrison Hình 5: AugustWeismann Trong thời gian tiếp đó, có nhiều cơng trình nghiên cứu lão hoá chết tế bào xuất nhiều bàn cãi xung quanh vấn đề Nhưng đại đa số người ta lại tin rằng, tế bào nuôi dưỡng môi trường đầy đủ dinh dưỡng chúng tăng sinh Mãi đến năm 1960, Leonard Hayflick với thí nghiệm ni tế bào sinh dưỡng môi trường dinh dưỡng đầy đủ, ông thấy chúng phân chia xấp xỉ khoảng 50 lần dừng hẳn Sau đó, tế bào giống bị “già đi”, màng hỏng, tiêu thụ thức ăn Khi kết cơng bố, có số người chưa thừa nhận nó, họ cho tế bào có khả tăng sinh vơ hạn Cho đến năm 1977-1985 Hayflick chứng minh cho người thấy tế bào có đươc khả tăng sinh vô hạn chúng bị tác nhân làm biến đổi, chúng khơng giữ đặc tính tế bào bình thường Củng cố cho thuyết Hình 6: Leonard Hayflick có nghiên cứu nhà sinh học khác như: - Năm 1973: Olovnikov nhận thấy rằng, giới hạn sống vật chất di truyền bị qua lần tái - Năm 1990: Harley cs tìm mối tương quan chiều dài telomere tuổi thọ tế bào Ông chứng minh ngắn dần telomere theo tuổi thọ qua thí nghiệm nguyên bào sợi người - Năm 1992: Allsopp cs chứng minh tái nguyên bào sợi phụ thuộc vào chiều dài telomere Theo ông, telomere ngắn theo tuổi thọ người - Năm 1994: Kim cs nhận thấy hầu hết tế bào ung thư có hoạt hố telomerase Trong tế bào khác lại khơng Điều chứng tỏ, có mặt telomerase làm telomere kéo dài, tế bào ung thư tăng sinh II Telomere Mỗi nhiễm sắc thể eukaryote có đầu mút với cấu trúc đặc trưng gọi telomere Các telomere khơng chứa gene; thay chúng gồm trình tự ngắn (6-8 bp)lặp lại nối tiếp ngàn lần có tính bảo tồn cao tiến hóa Chẳng hạn, Tetrahymena – nhóm động vật ngun sinh có lơng tơ, , Caenorhibditis: ; người động vật có vú đoạn lặp nối tiếp (1.000-2.000 lần) telomere sau: 5’-TTAGGG-3’ 2.1 Cấu tạo Telomere (b) (a) Hình 7: (a) Ảnh chụp NST người kĩ thuật FISH (b) thành phần cấu trúc telomere Mỗi lần phân bào, bình quân người 30 – 200 cặp base Telomere tế bào Những tế bào bình thường phân chia khoảng 40 – 70 lần với ngắn dần Telomere lão hóa, chết trì sai sót di truyền dẫn đến ung thư Trong tế bào máu người, độ dài Telomere biến đổi sau: Sự biến đổi cặp base telomere theo độ tuổi tế bào máu người Độ tuổi Mới sinh 35 tuổi Số cặp base 8000 3000 65 tuổi 1500 Phần tận Telomere liên kết với prôtêin đặc trưng tạo thành cấu trúc dạng vòng, hay gọi cấu trúc "kẹp tóc" Các vùng giàu Guanine Telomere trung tâm giúp cho cấu trúc “kẹp tóc” hình thành Chúng đóng vai trò điểm đính prơtêin, gọi vị trí liên kết Những vị trí có cấu trúc đặc trưng cho việc đính prôtêin đặc hiệu phục vụ cho việc bảo vệ đầu tận Telomere Các prôtêin hoạt động cách vừa che chắn phần cuối Telomere, vừa tham gia vào cấu hình cấu trúc Telomere phức tạp Các prơtêin bám dọc suốt Telomere Một nhóm gồm thành phần gọi Telosome (hay Shelterin) Thành phần Shelterin hay Telosome biểu hình sau: Hình 8: Sơ đồ cấu tạo Shelterin (Telosome) Shelterin hay Telosome có thành phần chủ yếu: - Nhóm bám trình tự TTAGGG cách nhận diện trực tiếp: TRF1, TRF2, POT1 - Nhóm prơtêin cho phép tế bào phân biệt Telomere với phần ADN bị sai hỏng (khơng có gắn thành phần này): TIN2, TPP1, RAP1 + Telomeric Repeat Binding Factor (TRF1): Gắn vào mạch kép cách nhận diện trình tự lặp đặc trưng Telomere + Telomeric Repeat Binding Factor (TRF2): Gắn vào để kết nối đoạn mạch đơn đoạn mạch kép Telomere, làm cho Telomere cong lại hình kẹp giấy Chúng kèm với TRF1 Telosome + Protection of Telomere (POT1): Gắn vào mạch đơn ADN trùm lấy phần cuối đoạn mạch kép Telomere, đảm bảo cho phần không bị tổn thương, bị kích thích tiến hành tổng hợp tiếp tục thành mạch kép + Telomere Protecting Protein (TPP1): Tương tác với POT1 + TIN2: Tương tác với TPP1 + RAP1: Tương tác với TIN2 TRF2 Nhờ bảo vệ chặt chẽ prôtêin cấu trúc “kẹp tóc” mà Telomere giúp nhiễm sắc thể khơng có “cơ hội” gắn kết với đầu tận chúng, đồng thời bảo vệ Telomere khỏi cơng enzyme polymerase có hoạt tính exonuclease (phân giải acid nucleic từ đầu 3′-OH 5’-OH) Sau hồn tất q trình gắn kết prơtêin vào Telomere, mơ hình cấu trúc phức hợp có dạng sau: 10 Hình 9: Cấu trúc phân tử Telomere 3.1 Bản chất, cấu tạo enzyme telomerase Telomerase ribonucleoprotein có chất enzyme phiên mã ngược chỗ tổng hợp ADN từ khn ARN có vai trò tổng hợp đoạn lặp Telomere bị trình phân bào Enzyme có mặt loại tế bào mầm, tế bào gốc phôi, tế bào ung thư sinh vật nhân thực đơn bào Tetrahymena thermophila Trong đó, tế bào soma bình thường động vật có vú khơng có mặt Telomerase, có hàm lượng khơng đáng kể Cấu tạo phân tử enzyme Telomerase gồm thành phần: - Phần ARN (TERC – Telomere RNA Component): Cung cấp khn ARN cho việc tổng hợp trình tự lặp ngắn telomere, đặc trưng cho loài Ví dụ: Telomerase Tetrahymena có đoạn ARN dài 160 nucleotide có chứa trình tự 3’CAACCCCAA-5’ làm khn cho tổng hợp đoạn lặp 5’TTGGGG-3’ Telomere nó; người, phân tử ARN Telomerase dài khoảng 450 nucleotide có chứa trình tự 3’-AAUCCC-5’ làm khn cho tổng hợp đoạn lặp Telomere 5’TTAGGG-3’ mạch đơn có đầu mút 3’ - Phần prơtêin – enzyme phiên mã ngược (TERT – Telomerase Reverse Transcriptase): Đảm nhiệm cơng việc xúc tác, phục vụ cho q trình kéo dài mạch Telomere từ TERC (như retrovirus) Thành phần ARN Telomerase người có chừng 445 nucleotide, nucleotide 46-56 vị trí gắn vào đầu 3’-OH Telomere, khn để từ thêm vào nucleotide Telomere Telomerase người cấu thành thành phần sau: Telomerase ARN (hTR hay hTERC), phân tử Telomerase phiên mã ngược (hTERT), dyskerin (DKC1) Các gene quy định thành phần phân bố 12 10: Sơ đồ cấu tạo telomerase người Hình nhiễm sắc thể khác genome người Gene hTERT dịch mã thành prôtêin gồm 1132 acid amin Chuỗi polypeptide hTERT cuộn với hTERC, ARN khơng quy định tính trạng gồm 451 nucleotide hTERT có cấu trúc kiểu găng tay hở cho phép trùm lên sợi nhiễm sắc thể để thêm vào trình tự lặp lại Telomere III.2 Tiến hóa ARN telomerase Telomerase động vật có xương sống ARN telomerase động vật có xương sống chứa phần tử cấu trúc trì cách phổ biến, bao gồm vùng khuôn mẫu, khu vực CR4-CR5 khu vực trì, miền giả, hộp H / ACA miền CR7 (Hình A) Vùng khn mẫu tìm chuỗi 3’UCCCAAUC-5’ phổ biến tất động vật có xương sống Khn mẫu chia thành hai miền: Miền kéo dài xác định lặp lại GGTTAG miền liên kết liên quan đến vị trí ADN kéo dài Trong miền kéo dài CCAAUC bất biến động vật có xương sống, miền liên kết hay đổi từ nucleotide (nt) loài gặm nhấm đến nt người Bởi số động vật có xương sống có vùng mẫu nt, người ta cho nt độ dài tối thiểu cần thiết cho chức telomerase Miền giả (Hình A) chứa yếu tố cấu trúc giả vùng khuôn mẫu xác lập phần tử ghép nối P2a.1, P2a, P2b P3, tạo thành xoắn ốc Các đường giao J2b/3 trì theo Hình 11: Sơ đồ cấu tạo telomerase ARN trình tự chiều dài, dùng để trì cấu hình giả ổn định Các nucleotide người phía đầu cặp base mẫu với nucleotide bên không tạo thành xoắn ốc P1 ARN telomerase số động vật có xương sống, bao gồm người Tuy nhiên, loài gặm nhấm ARN telomerase thiếu P1 đoạn đầu 5' nt mẫu Tuy nhiên, miền CR4-CR5 tìm thấy phía phần cuối miền giả bao gồm cấu trúc vòng gốc Vòng chứa vùng kết hợp (P6.1) bên Miền 13 chứa vòng J6, P4, P7a, P7b, Hộp H Hộp ACA tạo thành miền dạng hộp H/ ACA, cấu trúc trì tương tự ARN nhỏ (snoRNAs) Hộp H / ACA chịu trách nhiệm cho tập trung ARN Cuối cùng, miền CR7 chứa xoắn P8a P8b vòng L8 ARN telomerase trùng cỏ Cấu trúc thứ cấp ARN telomerase từ lồi khác trùng cỏ có điểm giống với ARN telomerase động vật có xương sống (Hình B) Cấu trúc lõi trùng cỏ bao gồm vùng khuôn mẫu, miền giả, gọi là Helix III Nucleotides 5’ cặp base mẫu với khu vực phía cuối miền giả để hình thành Helix I, có lẽ tương tự Helix P1 động vật có xương sống Cuối cùng, cấu trúc vòng gốc IV, xác định quang phổ NMR, tạo thành cấu trúc xoắn kết thúc vòng lặp Vòng IV trùng roi giống với miền CR4-CR5 động vật có xương sống Hộp H / ACA miền CR7 động vật có xương sống có yếu tố đặc hiệu TR ARN telomerase trùng cỏ ngắn nên khơng có cấu trúc Hình 12: Sơ đồ cấu tạo telomerase ARN trùng cỏ ARN telomerase nấm men Hình 13: Sơ đồ cấu tạo telomerase ARN nấm men 14 Xác định cấu trúc ARN telomerase nấm men (TLC1) nhiệm vụ khó khăn kích thước lớn nó, nhiên bốn phòng thí nghiệm đồng thời báo cáo cấu trúc thứ cấp cách sử dụng kết hợp phân tích so sánh phân tử, dự đốn vi tính kiểm tra RNase H để xác nhận vùng đơn Một mơ hình cho cấu trúc thứ cấp TLC1 (hình 4C) bao gồm trung tâm trung tâm với ba cánh tay phát từ lõi, liên kết với protein khác thể Cần có giả định vùng giả cạnh vùng mẫu để kết hợp với Est2p Các mơ hình đề xuất thay cho miền giả Một mơ hình đề cập đến tồn hai “kẹp tóc”, V VII miền (Hình C) Các yếu tố biên mẫu (TBE) mối liên kết trung gian vòng kết nối gốc với heterodimer Ku70/80 dễ dàng nhận ngược dòng mẫu Một cấu trúc vòng gốc cồng kềnh bên mẫu tương tác với Est1p Ghép nối sở dải dài, gọi helix I, mang mẫu gần vị trí liên kết Est2p có cấu trúc tương tự cấu trúc P1 trùng cỏ cấu trúc P1 động vật có xương sống Tuy nhiên TLC1, vùng dài bất thường (86 bp); cấu trúc xa đầu ' cánh tay liên kết với protein Sm chịu trách nhiệm chức sinh học TLC1 IV Phương thưc tái Telomese Tại tế bào mầm, tế bào sinh dục sơ khai, tế bào gốc phơi, tế bào ung thư lại có khả phân chia vơ hạn, hay nói cách khác, chúng tế bào bất tử? Vấn đề giải nghiên cứu Greider Blacburn năm 1984 việc tìm vai trò chế hoạt động enzyme Telomerase thực việc tổng hợp kéo dài Telomere hai đầu tận nhiễm sắc thể (nghiên cứu trao giải Nobel sinh lý y học năm 2009) 4.1 Hoạt động enzyme Telomerase chép đầu mút NST 15 Hình 14: Hoạt động enzyme Telomerase chép đầu mút NST - Telomerase vào, liên kết với đầu 3' ADN sử dụng đoạn ARN ngắn để làm khn tổng hợp cho trình tự ADN (Telomere) bổ sung vào đầu 3' chuỗi xoắn kép - Sau bổ sung trình tự lặp Telomere, enzim Telomerase tiếp tục dịch chuyển tới đầu mút đoạn lặp vừa tổng hợp để gắn thêm đoạn khác Telomerase gắn thêm nhiều đoạn lặp cách lặp lại bước Sau đó, mạch đối diện, ADN polymerase hồn thành việc tổng hợp “các đầu mút khơng đầy đủ” mạch đối diện sau mồi hóa bên Telomerase đó; cuối đoạn mồi bị cắt bỏ - Khi hoàn thành nhiệm vụ, Telomerase rời khỏi đầu 3' 4.2 Phương thức tái không phụ thuộc vào telomerase lengthening of telomerase= ALT) (Alternative Ở số dòng tế bào động vật khối u có trì vượt trội chiều dài telomere vắng mặt Telomerase Đặc tính tế bào ALT người tính khơng đồng kích cỡ telomere (bởi dao động từ ngắn đến dài) Sự hoạt hóa ALT suốt q trình có liên quan đến gen đột biến lặn, nhiên chưa tìm thấy rõ ràng Tác nhân kìm hãm hoạt tính ALT có mặt tế bào bình thường số tế bào có telomerase âm tính 16 Sự tái telomere gián tiếp xảy sau: Một sợi ADN điểm cuối lấn sang sợi khác sử dụng mẫu để làm tăng thêm trình tự telomere Điều nút T, đoạn ADN dạng vòng ngồi nhiễm sắc thể hoạt động Telomerase, đồng tồn bên tế bào nuôi cấy khối u Cuối cùng, việc thêm vào tồn chế ALT làm phong phú thêm cho giả định việc sử dụng chúng tham số quan hệ với telomere dự đoán chẩn đoán ung thư Ngồi ra, từ thách thức đặt cho liệu pháp phòng chống ung thư thơng qua việc hạn chế trì telomere V Telomere, telomerase vấn đề liên quan đến lão hóa, ung thư Trẻ (telomere bình thường) Telomere dài tế bào gôc Telomere ngắn dần Telomere ngắn dần Đổi mô Già (telomere ngắn đi) Khối u (telomere mức cao) Khối u Mơ già Hình 15: Sự điều chỉnh chiều dài telomere tế bào bình thường, tế bào già 5.1 Telomere lão hóa ung thư Những tế bào bình thường có giới hạn khả phân chia Qua nghiên cứu, mà khởi đầu cơng trình Hayflick, người ta thấy tế bào phơi thai có thời gian phân chia nhiều tế bào đứa trẻ, tế bào đứa trẻ có thời gian phân chia nhiều người trưởng thành Theo đó, chiều dài telomere suy giảm kéo theo suy giảm làm giảm tuổi thọ thời gian phân chia tế bào Khi telomere ngắn đến giới hạn cho phép tế bào khơng khả phân chia nữa, cấu trúc chức tế bào ngừng hoạt động để vào giai đoạn lão hoá 17 5.1.1 Telomere liên quan với lão hóa? Để đến lão hóa, tế bào thường phải trải qua giai đoạn sau: - Giai đoạn M1 (giai đoạn lão hóa) xảy chiều dài telomere ngắn đến mức cho phép Khi gây cảm ứng truyền tín hiệu ADN bị gây hại 92 telomere có ngắn riêng biệt Thơng qua đó, M1 gián tiếp gây ngừng sinh trưởng tế bào nhờ gen ức chế gen p16RB1 gen p53 Sau đó, tế bào lại tiếp tục phân chia telomere tiếp tục bị ngắn giai đoạn M2 - Giai đoạn M2 (giai đoạn chết) gọi giai đoạn cảm ứng Ở giai đoạn M2 điển hình mặt sinh lý học ngắn tối thiểu telomere tế bào khơng khả bảo vệ đầu mút nhiễm sắc thể Vì vậy, suy thối từ đầu đến đầu (end - to end) xảy Đây nguyên nhân làm cho hệ gen không ổn định dẫn đến tế bào chết Tuy nhiên, có tế bào mang mầm ung thư, chúng vượt qua giai đoạn có khả biểu tái hoạt telomerase, có khả kết cặp bazơ trì chiều dài telomere phân chia tế bào phân chia liên tục 5.1.2 Telomere bệnh liên quan đến lão hóa Ở người, tế bào phân chia khoảng 40 lần vào lão hố Nhưng với tế bào người già người bị hội chứng già trước tuổi, chúng phân chia trước vào lão hố Tuy nhiên, nay, nhà nghiên cứu nỗ lực làm rõ ngắn tới hạn telomere lão hoá tế bào để hiểu rõ chất tuổi thọ Riêng người bị hội chứng già trước tuổi, người ta thấy tế bào họ có telomere ngắn cách khác thường, kèm theo ngắn bệnh tật y người già (trong tuổi họ khoảng thiếu niên) người ta coi chứng cung cấp cho thuyết: Sự ngắn dần telomere ảnh hưởng nhiều đến tuổi thọ Hình 16: Hội chứng già trước tuổi (bên phải) tế bào Sự ngắn bất thường Telomere tăng nguy mắc bệnh 18 người, bệnh tim mạch, tiểu đường, tâm thần phân liệt, sa sút trí tuệ, Alzheimer, Parkinson, già trước tuổi… Sự căng thẳng kéo dài áp lực môi trường sống nguyên nhân làm cho Telomere bị ngắn nhanh chóng, dẫn đến lão hóa sớm phát sinh nhiều bệnh tật Những nghiên cứu E Blackburn chứng minh thiền định biện pháp giảm căng thẳng có tác dụng làm chậm q trình lão hóa Theo nghiên cứu chuột, kết đem lại tương tự Tuy nhiên, nay, q trình lão hố tế bào chưa giải thích cách trọn vẹn ngắn telomere Bởi theo nhiều nghiên cứu cho thấy telomere người ngắn chuột, mà chuột, tuổi thọ chúng kéo dài khoảng năm 5.2 Telomere bệnh ung thư 5.2.1 Telomere liên quan với bệnh ung thư Nếu telomere tạo nên giới hạn tuổi thọ tế bào Vậy làm mà tế bào ung thư vượt giới hạn ấy? Bằng cách mà chúng tăng sinh vô hạn? Làm mà tế bào ung thư có telomere vượt giới hạn so với tế bào khoẻ mạnh Và cách chúng trở nên bất tử? Ở người, thể có nhiều loại tế bào khác Nhưng đại đa số chúng khơng có hoạt động telomerase Chính lẽ phần làm cho telomere bị ngắn dần qua lần phân bào Tuy nhiên, ung thư, người ta tìm thấy đến 90% số có mặt telomerase Có thể nói, telomerase enzyme tái phục hồi nguyên phân thể đồng hồ tế bào Tác dụng telomerase làm kéo dài telomere thông qua việc thay mảnh nhỏ ADN bị Tế bào soma bình thường Lão hóa Tế bào ung thư 19 Tế bào ung thư Hình 17: Sự điều chỉnh chiều dài telomere bình thường tế bào ung thư Theo suy luận, hoạt động telomerase làm cho tế bào sống Từ telomerase tìm thấy hầu hết tế bào ung thư, nhà nghiên cứu tin rằng, nhân tố thiết yếu cho tế bào Nếu telomere bị ngắn với việc khơng có mặt telomerase khiến tế bào già ngăn chặn tăng sinh bất thường tế bào gần có nhiều chứng lại cho việc ngắn telomere tạo nên hoạt động di truyền bất thường gây ung thư Đây chứng khả quan cho mối liên kết telomere bị ngắn hiểm nguy gây ung thư người Thêm vào đó, chứng từ thí nghiệm cho thấy: telomere bị ngắn góp phần làm ung thư biểu giai đoạn sớm Từ nghiên cứu ung thư tuyến tiền liệt Johns Hopkins University School of Medicine, chuyên gia tìm thấy telomere tế bào ngắn gấp lần so với tế bào bình thường Qua đó, họ tin ngắn telomere việc làm ổn định hệ gen bên tế bào, dẫn đến ung thư (mặc dù trường hợp tìm thấy) (Meeker cs- 2002) Thông qua việc nghiên cứu telomerase thấy chúng có mặt hầu hết tế bào ung thư, nhiều nhà sinh học nghiên cứu để chọn lọc loại thuốc, liệu pháp phòng chống ung thư cách có hiệu (Buys CHCM-2000) Quả vậy, telomerase cần thiết cho tăng sinh tế bào Bằng chứng cho thấy, tế bào người bình thường, chúng phân chia 30-50 lần, tế bào ung thư, chúng phân chia đến khoảng 80 lần Vì vậy, theo nhà nghiên cứu, hoạt hoá telomerase cần thiết cho sinh trưởng tế bào ung thư Kết nghiên cứu Galina I Botchkina cs (2005) cho thấy tất bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt biểu hoạt tính telomerase mức độ cao Ngược lại, phần lớn bệnh nhân có khối u lành tính tuyến tiền liệt (BPH) khơng biểu hoạt tính telomerase (70% số tất bệnh nhân BPH), trường hợp khơng có ung thư mức độ hoạt động thấp (18%) Tuy nhiên, khoảng 12% bệnh nhân BPH cho thấy mức độ cao hoạt tính telomerase có khả phản ánh tiền 20 ung thư tuyến tiền liệt Họ đề xuất phân tích định lượng hoạt tính telomerase hữu ích cho chọn lọc trường hợp ung thư không ung thư tuyến tiền liệt Chính telomerase làm tế bào ung thư phát triển “hưng thịnh”, cần phải sử dụng thuốc kháng telomerase để điều trị ung thư Nhưng qua đó, số tác giả cảnh báo sử dụng thuốc kháng telomerase gây nên đầu độc đến số phần khác thể Bởi số tế bào bình thường tế bào mầm, tế bào máu,… có hoạt động telomerase thuốc kháng telomerase gây độc tính loại sau: - Độc tính máu: Sẽ làm ức chế việc tạo tế bào máu để nuôi sống thể - Độc tính hệ miễn dịch: Làm hệ miễn dịch yếu bình thường, làm giảm khả chống lại nhiễm khuẩn - Độc tính da: Telomerase làm da chóng lành ta bị thương Nêu dùng thuốc kháng telomerase làm trễ việc phục hồi vết thương - Độc tính tuyến sinh dục: Gây trở ngại cho việc tạo giao tử (mặc dầu điều mang tính chất suy đốn) (Theo Sharma cs- 1997) Tuy nhiên, liệu pháp sử dụng thuốc kháng telomerase phải dựa vào thời gian Bởi tế bào ung thư phải trải qua 20 hay 30 lần phân chia để telomere đủ ngắn để ngừng phát triển Thời gian có dài, vậy, tốt kết hợp phương pháp kháng telomerase với hoá trị liệu điều trị ung thư VI Ứng dụng công gen vào điều trị Bởi telomerase tìm thấy 90% ung thư kích thích cho tế bào ung thư tăng sinh vô hạn Trong nhiều năm, nhà nghiên cứu nỗ lực để tìm liệu pháp nhằm ngăn chặn trình Muốn vậy, cần phải ức chế hoạt hoá telomere, khối u không sinh trưởng Tại trường đại học California, Bekely, nhà sinh học phát hoạ rõ ràng tranh hoạt hố telomerase cơng bố tờ Nature Cell Biology vào ngày 26/08/2002 Theo đó, họ tìm thấy telomerase ẩn diện vùng nhân tế bào, gọi hạch nhân Và enzime telomerase phóng thích tế bào thực phân chia Sau thực xong nhiệm vụ, chúng lại quay hạch nhân cách nhanh chóng Tuy nhiên, ung thư, telomerase lại tìm thấy nơi tế bào Điều 21 chứng tỏ: Hệ thống chuyển hoá qua lại telomerase bị phá vỡ Các nhà khoa học hy vọng tìm protein có liên quan đến hiệu ứng chuyển telomerase, họ tìm liệu pháp kháng telomerase với hiệu tốt (Wong JM cs, 2002) Theo số nhà nghiên cứu khác, họ tiến hành phương thức "ức chế" trực tiếp telomerase Riêng trường đại học Rochester Medical Center, họ sử dụng kỹ thuật gây nhiễu ARN để làm ngắt quãng việc sản xuất telomerase tế bào ung thư Mặc dù kỹ thuật không làm dừng lại hết nửa telomerase sản xuất ra, bước đầu họ làm giảm lượng telomerase tế bào ung thư Với phương pháp này, triển vọng làm suy thoái dần telomerase điều trị ung thư khơng xa Còn trường đại học Texas Southwester Medical Center, kỹ thuật phát hoạ họ cơng bố tạo chí Cancer Research 15/09/2003 triển vọng Họ cho có thành phần gọi Oligonucleotide (Polynucleotide phân tử lượng thấp) làm dừng sinh trưởng tế bào khối u Trên thí nghiệm, sau vài lần áp dụng phương pháp này, tế bào thật ngừng phân chia chiều dài telomere không bị làm dài thêm Tuy nhiên, biện pháp tiến hành thời gian dài, kết hợp với hố trị liệu Còn thời gian ngắn, chưa có biện pháp cụ thể Cuối cùng, tương lai không xa, nhà nghiên cứu lạc quan tin với nỗ lực tìm kiếm, thí nghiệm, sử dụng nhiều phương pháp mới, đem lại kết tốt việc điều trị số loại ung thư Lão hóa có liên quan đến ngắn lại telomere ADN Nhà sinh học Aubrey De Grey Methuselah Foundation SENS Research Foundation đề xuất liệu pháp gen chương trình nghiên cứu tế bào gọi Strategies for Engineered Negligible Senescence SENS Trong ngày 15 tháng năm 2015, Elizabeth Parrish trở thành người sử dụng liệu pháp gen để chống lão hóa – gần xác 25 năm sau lần liệu pháp gen chứng nhận sử dụng thành công Liệu pháp gen phương pháp đưa acid 22 Nghiên cứu yếu tố có vai trò việc kích thích ức chế hoạt tính telomerase Tại trường đại học Alabama, nhà nghiên cứu phát thấy mẫu xúc tác siêu phân tử hTERT, cần thiết để khởi đầu kích thích hoạt tính telomerase hTERT có vai trò then chốt tế bào bất tử, tác nhân khởi xướng ung thư Trong đó, gen điều chỉnh hoạt tính hTERT phát vào năm 1999 Người ta thấy hTERT biểu hiện, khởi đầu cho biểu telomerase Nghiên cứu cho thêm nhìn khác telomerase.Và người ta thấy rằng, hTERT bị dập tắt, telomerase không biểu hiện, dẫn đến tế bào ung thư lại chết lần nữa.(Tollefsbol TO-2001) Bên cạnh hTERT, nhóm nhà nghiên cứu trường đại học Princeton phát thấy thành phần telomerase nấm men - protein ESt1 ESt1 dường có tác dụng làm hoạt hố telomerase Thơng qua đó, họ hy vọng tìm liệu pháp cho dự định làm giảm ngăn ngừa hoạt hoá telomerase (Taggart AK cs, 2002) Ngồi ra, việc tìm thấy gen ức chế nằm NST thứ thứ người (Bahsch 2001) góp phần làm phong phú cho dự định ngăn chặn điều trị ung thư tương lai Trong tương lai, việc nghiên cứu telomerase, telomerase tập trung vào phần lớn mô quan trọng cách kỹ lưỡng, chi tiết Để qua đó, tìm mối quan hệ chúng nhằm ngăn chặn điều trị ung thư Một mục tiêu nghiên cứu thực phương thức bảo vệ việc giới hạn công sản xuất telomerase tế bào ung thư, để cuối giết chết tế bào Đây niềm hy vọng lớn cho việc loại trừ ung thư Cho đến nay, có số cách khác để ứng dụng hiểu biết telomere telomerase Với hoạt tính telomerase, dùng phương pháp kính bơi Pap (Pap Smear) để dự báo tìm thấy ung thư giai đoạn sớm Từ đó, tìm cách chữa trị phù hợp Hoặc người bị ung thư buồng trứng, người ta dùng phương pháp xét nghiệm protein máu Trong tương lai, liệu pháp dùng thuốc kháng sinh telomerase phát triển chúng dùng để điều trị giai đoạn sớm mà thơi Bên cạnh đó, 23 người có ung thư theo gia đình, họ tham gia ngăn chặn cách làm ức chế telomerase theo phương pháp phù hợp PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Từ nghiên cứu đây, thấy vai trò quan telomere enzyme telomerase tồn tế bào nói riêng thể sinh vật nói chung Tạo hóa nhiên khơng vơ lý giữ lại telomere đầu mút nhiễm sắc thể phân bố enzyme telomerase số khơng phải tồn loại tế bào thể Sự ngắn lại telomere qua lần phân bào với thiếu vắng enzyme telomerase tế bào soma dẫn đến lão hóa, già chết sinh vật Tuy nhiên, điều khơng có hại Bởi lẽ, già tượng có tác dụng xúc tiến q trình tiến hóa xảy nhanh nhờ tăng tốc độ thay thế hệ, có ý nghĩa tăng nhanh vòng quay vật liệu di truyền sinh giới Ngoài ra, việc tìm hiểu nghiên cứu Telomere – 24 telomerase có ích cho hướng điều trị số bệnh di truyền đặc biệt bệnh ung thư ngày phổ biến II ĐỀ NGHỊ Từ nghiên cứu Telomere - telomerase, có nhiều vấn đề thú vị đặt cho nghiên cứu xoay quanh vấn đề ung thư lão hóa: Nếu Telomerase làm cho tế bào ung thư bất tử, liệu ngăn tế bào lão hóa hay khơng? Liệu kéo dài tuổi thọ cách tạo sẵn, phục hồi chiều dài Telomere Telomerase? Nếu điều xảy ra, liệu trục trặc khiến Telomerase gây nên ung thư? Telomere đóng vai trò quan trọng đến mức q trình lão hóa? Bởi vì:Một số lồi có tuổi thọ cao người lại có telomere ngắn so với nhiều loài khác (như chuột, có tuổi chừng vài năm) Vẫn chưa có biết câu trả lời cho vấn đề đoạn sớm Xa nữa, hy vọng nhờ nắm rõ chế, hiểu biết telomere giúp kiểm sốt ung thư nói riêng, bệnh tật có liên quan đến tuổi thọ nói chung Có thể ứng dụng công nghệ gen vào việc chữa trị cách hiệu thành công TÀI LIỆU THAM KHẢO Campbell - et al (2008), Biology, Trần Hải Anh, Nguyễn Bá, Thái Trần Bái, NXB Giáo dục Việt Nam Hồng Trọng Phán (2013), Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Xuân Huy (2018), Bài giảng công nghệ gen, NXB Đại học Huế Nosek, Tomáška (2008): Origin and Evolution of Telomeres USA https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2009/ 25 https://en.wikipedia.org/wiki/Telomere 26 ... Thơng qua đề tài giúp thân nắm vững kiến thức lý thuyết đầu mút nhiễm sắc thể - telomere, nghiên cứu rõ mối liên hệ telomere, enzyme telomerase, lão hóa ung thư ứng dụng cơng nghệ gen vào chữa... nhân chuẩn - Phạm vi nghiên cứu: Chỉ tập trung nghiên cứu Telomere, enzyme Telomerase tế bào số vấn đề liên quan đến ứng dụng cơng nghệ gen với q trình lão hóa, ung thư Phần II NỘI DUNG I Tổng... học năm 2009) 4.1 Hoạt động enzyme Telomerase chép đầu mút NST 15 Hình 14: Hoạt động enzyme Telomerase chép đầu mút NST - Telomerase vào, liên kết với đầu 3' ADN sử dụng đoạn ARN ngắn để làm khn