nghiên cứu thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm tại khu vực miền núi phía bắc và biện pháp xử lý

Biểu đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích sau khi xử lý bằng phương pháp vật lý .... Biểu đồ tỷ lệ giảm của hàm lượng aflatoxin trên các mẫu phân tích bằng phương pháp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYấN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐÀO THÙY DƯƠNG

Nghiên cứu thực trạng nhiễm độc tố

Aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm tại khu vực miền núi phía bắc

Số húa bởi Trung tõm Học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYấN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐÀO THÙY DƯƠNG

Nghiên cứu thực trạng nhiễm độc tố

Aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm tại khu vực miền núi phía bắc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Lương Thị Hồng Vân và TS Nguyễn Thị Hải Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Một số kết quả đã được tôi công bố đồng tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn Đào Thùy Dương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo NGƯT - PGS.TS Lương Thị Hồng Vân - Phó viện trưởng Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên và TS Nguyễn Thị Hải trưởng bộ môn hóa sinh - Viện khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã tận

tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng phân tích hóa học - Viện Khoa

học sự sống - Đại học Thái Nguyên Đặc biệt là ThS Nguyễn Thế Cường trưởng phòng phân tích hóa học, cùng các kĩ thuật viên Vũ Thị Ánh, Bế Văn Thịnh, Nguyễn Thị Duyên, Dương Thị Khuyên, Nguyễn Thương Tuấn,Thái Thị Ngọc Trâm đã tận tình

giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này, cho tôi những lời khuyên quý báu Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình

và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả luận văn Đào Thùy Dương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý n ghĩa của đề tài 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sinh học chính của nấm mốc 3

1.2 Đặc điểm của độc tố nấm mốc và chất aflatoxin 5

1.2.1 Độc tố nấm mốc 5

1.2.2 Đặc điểm của chất aflatoxin 6

1.2.3 Điều kiện sản sinh độc tố aflatoxin 8

1.2.4 Ảnh hưởng của aflatoxin đến nông sản thực phẩm 10

1.2.5 Aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới con người và vật nuôi 11

1.2.6 Quy định hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc 16

1.3 Các phương pháp phân tích hàm lượng aflatoxin 20

1.3.1 Phương pháp lý hóa 20

1.3.2 Phương pháp hóa sinh 22

1.4 Xử lý aflatoxin trong nông sản và phụ phẩm chế biến hiện nay 23

1.4.1 Phương pháp vật lý 23

1.4.2 Phương pháp hóa học 25

1.4.3 Phương pháp sinh học 26

1.5 Tình hình nghiên cứu aflatoxin trên thế giới và trong nước 28

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 28

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 32

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 33

2.3.1 Hóa chất 33

2.3.2 Thiết bị 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu 33

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 33

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu 33

2.4.3 Phương pháp xử lý hàm lượng aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm 34

2.4.4 Phương pháp phân tích hàm lượng aflatoxin 35

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả khảo sát thực trạng nhiễm aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm 40

3.1.1 Tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong các mẫu phân tích 40

3.1.2 Hàm lượng nhiễm aflatoxin trong các mẫu phân tích 42

3.2 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin sau khi xử lý bằng phương pháp vật lý và hóa học 44

3.2.1 Hàm lượng aflatoxin sau khi xử lý bằng phương pháp vật lý 44

3.2.2 Hàm lượng aflatoxin sau khi xử lý bằng phương pháp hóa học 48

3.3 So sánh hiệu quả của hai phương pháp xử lý hàm lượng aflatoxin trong nông sản thực phẩm 51

3.3.1 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 51

3.3.2 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B2 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 53

3.3.3 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin G1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ML : Maximum limit

PTN : Phòng thí nghiệm

QĐ-BYT : Quyết định Bộ Y tế

TLC : Thin layer chromatography

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Tích chất hóa lý của một số aflatoxin 8

Bảng 1.2 Khả năng gây ung thư do aflatoxin trên động vật thí nghiệm 14

Bảng 1.3 Qui định hàm lượng tối đa độc tô nấm mốc aflatoxin B1 và tổng hàm lượng các aflatoxin (B1+B2+G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb): 17

Bảng 1.4 Tiêu chuẩn cho phép hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm 17

Bảng 1.5 Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA 19

Bảng 1.6 Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của FDA 19

Bảng 1.7 Hàm lượng aflatoxin trong một số nguyên liệu làm thức ăn 31

Bảng 3.1 Tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố aflatoxin trong các mâu phân tích 40

Bảng 3.2 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích 42

Bảng 3.3 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu trước và sau khi xử lý bằng hương pháp vật lý 44

Bảng 3.4 Hiệu quả xử lý aflatoxin trên các mẫu phân tích bằng phương pháp vật lý 46

Bảng 3.5 Hàm lượng aflatoxin trên các mẫu trước và sau khi xử lý bằng phương pháp hóa học 48

Bảng 3.6 Hiệu quả xử lý aflatoxin trên các mẫu phân tích bằng phương pháp hóa học 50

Bảng 3.7 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 51

Bảng 3.8 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B2 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 53

Bảng 3.9 So sánh hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin G1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [42], [43] 4

Hình 1.2 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus [41] 5

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Aflatoxin 7

Hình 2.1 Mẫu cám gạo 32

Hình 2.2 Mẫu khô đỗ tương 32

Hình 2.3 Mẫu ngô 32

Hình 2.4 Sắc đồ aflatoxin của mẫu chuẩn 38

Hình 2.5 Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở các nồng độ 5; 10; 20 ppb 38

Hình 2.6 Đường tuyến tính của các aflatoxin chuẩn 39

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố aflatoxin trong các mẫu phân tích 41

Hình 3.2 Biểu đồ về hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích 43

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích sau khi xử lý bằng phương pháp vật lý 45

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ giảm của hàm lượng aflatoxin trên các mẫu phân tích bằng phương pháp vật lý 47

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích sau khi xử lý bằng phương pháp hóa học 49

Hình 3.6 Biểu đồ tỷ lệ giảm của hàm lượng aflatoxin trên các mẫu phân tích bằng phương pháp hoá học 51

Hình 3.7 Biểu đồ hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 52

Hình 3.8 Biểu đồ hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin B2 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 3.9 Biểu đồ hiệu quả xử lý hàm lượng aflatoxin G1 sau khi xử lý bằng hai phương pháp vật lý và hóa học 55

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nông sản thực phẩm có chất lượng cao là những sản phẩm có hàm lượng, thành phần các chất dinh dưỡng nhiều và cân đối bên cạnh các tiêu chuẩn về màu sắc, mùi

vị, hình thức… Người tiêu dùng ngày nay càng chú ý hơn đến việc liệu các sản phẩm

đó có bị nhiễm nấm và độc tố của nấm mốc hay không vì chúng đã được chứng minh

là có thể gây hại cho người và gia súc Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật nuôi Có rất nhiều loại độc tố nấm mốc được phát hiện Trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất

Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất

của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…

Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi lượng Aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật Nghiêm trọng và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan Ngoài ra aflatoxin còn có khả năng phá hủy tế bào thận và các bộ phận khác, ức chế hệ miễn dịch, gây suy dinh dưỡng, chậm lớn [37] Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc trên lương thực, thực phẩm Sự nghiên cứu về aflatoxin được bắt đầu khi ở Anh nghề nuôi gia cầm bị tổn thất nặng nề và năm 1960, lúc đầu hơn 10000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là Aflatoxin [14]

Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho nông sản thực phẩm, do vậy công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm đã có những tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú ý

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Theo Lê Anh Phụng và cộng sự (cs) (2001) [13] thì từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cs đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc ở một số lương thực như: Đậu,

đỗ, lạc Năm 1996, Nguyễn Thuỳ Châu và cs đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm trong ngô như: aflatoxin, fumonixin, achotoxin A, deoxynivalenol và nivalenol…

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm có nguồn gốc ở một số địa phương thuộc khu vực phía Bắc và đánh giá hiệu quả của các biện pháp xử lý aflatoxin ở mức độ phòng thí nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thực trạng nhiễm aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm

- Dùng hai phương pháp vật lý sử dụng sấy khô và phương pháp hóa học sử dụng khí

NH3 để xử lý hàm lượng aflatoxin trong mẫu nông sản thực phẩm ở mức độ phòng thí nghiệm

- Đánh giá hiệu quả của việc xử lý các mẫu nông sản thực phẩm đã được xác định nhiễm độc tố aflatoxin bằng hai phương pháp nói trên

- So sánh hiệu quả của hai phương pháp vật lý và hóa học trong việc xử lý hàm lượng aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm

4 Ý n ghĩa của đề tài

Kết quả của đề tài, sẽ góp phần đề ra các biện pháp tốt cho việc xử lý aflatoxin trong nông sản thực phẩm, từ đó ứng dụng trong thực tế nhằm nâng cao công tác quản

lý vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe con người

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học chính của nấm mốc

Nấm mốc là cái tên chung dùng để chỉ các nhóm nấm không phải nấm men (nấm thường có cấu tạo đơn bào và sinh sản vô tính theo lối nảy chồi), cũng không phải các nấm lớn có tai (nấm có kích thước lớn, ta nhìn thấy bằng mắt thường được) Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống

dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, phân chuồng, nước, không khí…) Chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc bảo đảm vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, do chúng có khả năng phân giải các hợp chất như: cellulose, protein, lipid,kitin, pectin… Đặc biệt có 2

loại nấm mốc có khả năng sinh ra độc tố aflatoxin đó là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Rất dễ nhận biết loài Aspergillus flavus bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón cục của tán Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo Aspergillus hình

thành khuẩn lạc sau 24 giờ, khu vực trung tâm có màu vàng nhạt, rìa mép có màu trắng mịn Sau 48 giờ hình thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chín, màu vàng nhạt đã chuyển sang màu vàng lục Khuẩn lạc có kích thước 4 - 5cm, hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5 - 6 vòng tròn màu xanh lục trên

bề mặt, rất dễ phân biệt với nhiều loại nấm mốc khác [24]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 1.1 Hình ảnh nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [42], [43]

Bào tử của nấm Aspergillus flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong

đất, trong nước Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả Phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn [24] Đám bào tử khi chín có màu vàng lục hay màu xanh lục bám trên các mầm của hạt hoặc ở kẽ giữa hai phiến của hạt Các bào

tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu Dưới kính hiển vi ở bội số thấp (X16) có thể quan sát đặc điểm vi thể và phân biệt được cơ quan sinh sản của loài

nấm này Theo tác giả Phạm Hồng Sơn (2005) [15] thì nấm Aspergillus được mô tả

như sau: Đặc trưng của chi nấm này là từ khuẩn ty phát triển kéo dài thành cuống bào

tử đính (conidiophore), trên đầu hình thành túi đỉnh (vesicle: “đỉnh nang”), còn vùng gốc hình thành tế bào chân (foot cell: “túc tế bào”) Sau đó, ở bề mặt của đỉnh nang các tế bào hình thành tế bào đính (conidiogenous cells) thường gọi là thể bình (phialide) phát sinh bên cạnh nhau, trên đó các bào tử đính (hay “phân sinh tử”) phát

triển ở dạng chuỗi liên tiếp Phụ thuộc vào loài nấm Aspergillus khác nhau mà trên bề

mặt túi đỉnh trước hết hình thành một lớp tế bào đệm (metula) rồi sau đó mới có thể bình phát triển trên đó (hai tầng), hoặc thể bình phát triển không gian tiếp sau tế bào đệm (một tầng) Đầu cuống bào tử đính thường được gọi là đầu bào tử đính (conidia head) có hình thái đặc trưng loài

Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc, bọng tròn có kích thước từ 25 - 45 µm,

cuống bào tử đính mọc thẳng từ sợi xù xì có kích thước từ 400 - 1000 µm, rộng 5 – 15

µm Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có đường kính rộng từ 2 - 4 µm

Hình 1.2 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus [41]

Khi nuôi cấy nấm Aspergillus trên môi trường thạch nước cốt dừa (Cocorut

cream agar), sau 3 - 5 ngày soi đĩa cấy dưới đèn UV (λ= 365nm), nếu phát quang màu

xanh tím xung quanh khuẩn lạc thì khẳng định có sinh aflatoxin Nấm Aspergillus

thường được phân loại, đồng định hay giám biệt dựa vào khuẩn lạc, hình thức sinh bào

tử đính hay hình thái bào tử đính…

1.2 Đặc điểm của độc tố nấm mốc và chất aflatoxin

1.2.1 Độc tố nấm mốc

Độc tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc Trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loài nấm có thể đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm:

Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria và Claviceps

Trong các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện [6] Theo Van Egmond (1995) [26] thì

aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus thuộc họ nấm cúc, là loại

nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy nhân tạo Đây là loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới Hai loài nấm mốc này có thể phát triển trên nhiều loại cơ chất, các loại nông sản

là ngũ cốc (ngô, gạo, lúa mỳ…) các loại hạt có dầu, thậm chí có trên cả bột cá và thịt giàu protein Thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là những đối tượng thích hợp nhất cho sự phát triển và sản sinh độc tố

1.2.2 Đặc điểm của chất aflatoxin

Các aflatoxin thường nhiễm trên các loại nông sản thực phẩm Hiện nay người

ta đã tìm thấy khoảng 17 loại aflatoxin khác nhau: B1, B2, B2a, B3, G1, G2, G2a, M1, M2,

P1, Q1, R0, RB1, RB2, L, LH, LM Tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm

được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng Kí hiệu “B” là chữ viết tắt của Blue (màu xanh) dưới tia UV và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây) [37] Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc aflatoxin B1: nó có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một Bằng cách khử nối đôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2

Trong bốn loại aflatoxin thì aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Aflatoxin

Các aflatoxin là tinh thể trắng, rất bền ở nhiệt độ cao, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thường Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt khi hòa tan ở các dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

môi có độ phân cực cao Các aflatoxin đƣợc hòa tan trong các dung môi phân cực nhƣ chloroform và metanol đăc biệt tan nhiều trong dimethysunfoxit

Bảng 1.1.Tích chất hóa lý của một số aflatoxin [8]

phân tử

Trọng lƣợng phân tử

Nhiệt độ nóng chảy

1.2.3 Điều kiện sản sinh độc tố aflatoxin

Hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố, sự sản sinh các aflatoxin do Aspergillus flavus phụ thuộc vào từng chủng, mặt khác nó còn phụ thuộc

vào điều kiện xung quanh [24] Schroeder và Ashworth nói rằng: sự sinh sản của aflatoxin là kết quả tác động qua lại giữa genotip của chúng và các điều kiện phát triển

của nó Sự sản sinh aflatoxin trên các chủng Aspergillus flavus thì chỉ có 73% có khả

năng sinh độc tố aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh aflatoxin ở mức độ cao nhất, aflatoxin B1 đƣợc tạo ra nhiều cả ở tự nhiên lẫn nuôi cấy [7]

Theo Bùi Xuân Đồng và cs (1999) [6] sự sản sinh độc tố aflatoxin ngoài phụ thuộc và các chủng sinh độc tố còn phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất và điều kiện môi

trường Aspergillus flavus phát triển nhanh khi độ ẩm không khí cao 86 - 97%, hàm

lượng nước trong hạt 22 - 26% và nhiệt độ môi trường 25 - 320

C Theo Nabil Sad (2004) [33] thì điều kiện dự trữ thức ăn và nguyên liệu thức ăn không thích hợp như: Khi nhiệt độ môi trường trên 270C, độ ẩm môi trường lớn hơn 62% và độ ẩm trong thức ăn lớn hơn 14% là có thể xuất hiện độc tố aflatoxin Đặc biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng lương thực thực phẩm Độ ẩm không khí cao 86 - 97%, hàm lượng nước trong hạt 22 - 26% và nhiệt độ môi trường 27 - 280C, độc tố aflatoxin sinh ra nhanh và nhiều nhất

Nói chung aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến aflatoxin G1, sau đó là aflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp [24]

* Cơ chất và môi trường trong việc hình thành aflatoxin

Các chủng nấm mốc phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm từ lạc được ghi nhận sinh độc tố nhiều hơn Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh

mì, các thực phẩm bột sống hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố Ngược lại, gần một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh aflatoxin [24] Sản lượng aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: Khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nó giảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này tương ứng với sự phân hủy các aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc mạnh các bình nuôi cấy [24] Nhìn chung, sự sản xuất aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

thông thường, bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Aspergillus flavus, nó tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ, tức là khoảng ngày thứ 6

rồi giảm sút [24] Lý do của sự giảm lượng aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy

và điều kiện tư nhiên Những biến thiên về nhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45 - 500C cho thấy không thuận lợi cho việc sản sinh aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 250C [24] Hàm lượng nước trong cơ chất có vai trò quan trong việc hình thành aflatoxin, ở 32oC trên lạc có hàm lượng nước trong khoảng

15 và 30% aflatoxin hình thành sau 2 ngày [24], còn để aflatoxin hình thành sau 2

ngày trên gạo cần lượng nước là 24 - 26%; ngô là 19 - 24% [16]

Như vậy trong điều kiện nhiệt đới, aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng nếu nhiệt độ khá ấm [24]

Sự hình thành aflatoxin cũng bị ảnh hưởng rất ít với giá trị pH Giá trị pH thích

hợp để Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin ở giữa 4 - 5 Hàm lượng khí cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của Aspergillus flavus do đó giảm

lượng aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí quyển hàm lượng aflatoxin cũng giảm [24]

1.2.4 Ảnh hưởng của aflatoxin đến nông sản thực phẩm

Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàn tuyệt đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn từ lúc cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển Và theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bị nhiễm độc tố

vi nấm [37] Hầu hết nấm mốc có thể phát triển trên nhiều đối tượng vật chất khác nhau, từ các chất vô cơ nghèo dinh dưỡng đến các loại chất hữu cơ giàu chất dinh dưỡng như lương thực, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Sự nhiễm aflatoxin thường xảy ra nhất ở đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt khác như gạo, lúa mì, đậu nành, hạt bông vải… Aflatoxin phát triển trên lương thực, thực phẩm làm biến đổi màu sắc, mùi vị, làm giảm chất lượng, đặc biệt các chất dinh dưỡng như

glucoza, protein, axit amin, gluxit, lipit, vitamin và các chất khoáng Trong quá trình phát triển aflatoxin các men phân giải chất dinh dưỡng như lipaza, amilaza, proteaza được bài tiết ra môi trường Chính sự phân giải lipid do các men phân giải là nguyên nhân gây ra biến đổi mùi vị của thực phẩm, làm giảm chất lượng dầu và tăng chỉ số axít gây mùi thối ở những thực phẩm khi bị nhiễm độc tố aflatoxin [5]

Như vậy aflatoxin đã ảnh hưởng rất lớn đến lương thực, thực phẩm không chỉ làm biến đổi màu sắc, mùi vị mà quan trong nhất là làm giảm giá trị dinh dưỡng, gây độc cho con người và vật nuôi Cho nên, làm giảm chất lượng và giá thành của lương thực, thực phẩm

1.2.5 Aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới con người và vật nuôi

Trong số các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện Độc tính của aflatoxin cao gấp 10 lần axit hydroxyanic (HCN) và gấp 68 lần Arsen (As) Những nghiên cứu trên động vật cho thấy con vật có thể chết do bị ngộ độc aflatoxin chỉ với liều 0,294 mg/kg [25]

Theo Wheater (1985) [39] khi các loài bị nhiễm độc tố sẽ làm tổn thương mô gan

và thận gây ra những biến đổi trong tế bào như:

+ Nhân tế bào bị teo, thường thấy chủ yếu ở mô gan

+ Tế bào bị phù và xuất hiện các không bào trong tế bào chất, hiện tượng này thường thấy xuất hiện trong tế bào mô thận

+ Tích lũy mỡ trong tế bào chất

+ Hoại tử, xuất hiện ở cả mô gan và mô thận

* Tác động lên tế bào

Ở mức độ tế bào việc cho uống aflatoxin với liều khác nhau đã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym acid deoxyribo nucleic (ADN) và acid ribonucleic (ARN) polymeraza ở gan, các đáp ứng tương tự đã được quan sát ở việc nuôi cấy các tế bào người và động vật Quá trình sinh tổng hợp protein cũng bị hỏng, đặc biệt trong điều kiện khi mà quá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trình sinh tổng hợp chịu ảnh hưởng mạnh bằng sự biến đổi quá trình sinh tổng hợp ARN thông tin

Theo Đậu Ngọc Hào (1992) [9] tác động sinh hóa của các aflatoxin ở tế bào trải qua 5 giai đoạn kế tiếp nhau:

- Giai đoạn 1: Tác động qua lại với ADN và ức chế các polimeraza chịu trách nhiệm tổng hợp ADN và ARN

- Giai đoạn 2: Đình chỉ sự tổng hợp ADN Khi aflatoxin phản ứng với ADN sẽ tạo ra các nhóm chức quinon và amin, từ đó phân tử có thể xen vào vòng xoắn kép của ADN

ở chỗ mà bình thường vòng xoắn mang guanin, dẫn đến việc ADN không còn khả năng nhân đôi

- Giai đoạn 3: Tiêu giảm sự tổng hợp ARN và ADN dẫn đến ức chế hoạt động của ARN của chất tế bào, ARN của nhân cũng bị rối loạn

- Giai đoạn 4: Biến đổi hình thái hạt nhân Các aflatoxin gây ức chế các hoạt tính enzym, dẫn đến sự rối loạn mô hạt nhân

- Giai đoạn 5: Tiêu giảm sự tổng hợp protein Đây là hậu quả cuối cùng và cũng là nguy hiểm nhất gây ra ung thư biểu mô tế bào gan

Như vậy aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp ở các loài động vật và con người Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật

ăn thức ăn có aflatoxin Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người

* Độc tính của aflatoxin trên động vật thí nghiệm

Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mãn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây

ung thư, gây quái thai và gây đột biến Theo Menbez Albores (2009) [32] thì aflatoxin B1 gây ức chế sự hô hấp của tế bào tim và thận của thỏ làm giảm cường độ hô hấp của

tế bào tim 35-50% và làm giảm cường độ hô hấp của tế bào thận 28-35%

Theo Carnaghan (1967) [30] đã nghiên cứu về khả năng gây ung thư gan của aflatoxin trên động vật thí nghiệm như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bảng 1.2 Khả năng gây ung thư do aflatoxin trên động vật thí nghiệm

Tuần suất (%)

* Độc tính của aflatoxin trên gia súc, gia cầm

Trong điều kiện bảo quản không tốt là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người Tuy nhiên mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm lượng chất độc ăn phải Khi các gia súc, gia cầm ăn phải thức ăn nhiễm aflatoxin tạo nên các triệu chứng kéo dài như tốc độ tăng trưởng chậm, tiêu tốn thức ăn, khả năng chống bệnh giảm Aflatoxin làm giảm tính ngon miệng, làm mất mùi thức ăn Cho lên làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng, ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và quá trình

sử dụng dinh dưỡng của gia súc

Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn và chậm lớn, gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết Khi kiểm tra vi thể thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho bị thâm nhiễm Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan Nếu nhiễm aflatoxin trong thời kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai [20] Riêng ở các trại gà giống, độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm Nếu gà nhiễm bệnh với

thì sẽ có triệu chứng: bỏ ăn, giảm tăng trọng, hiệu quả chuyển hóa thức ăn thấp, sản lượng trứng giảm, khả năng phát dục của gà mái và gà chống giảm, tỷ lệ chết cao Khi gà bị nhiễm độc thể cấp tính, bệnh tích chủ yếu là gan vàng và sưng Trường hợp mãn tính gan biến thành màu xám hay vàng xám và trở nên xơ cứng Những xét nghiệm vi thể ở gan cho thấy: thùy gan bị tổn thương lan tràn kèm theo chảy máu, tế bào gan thoái hóa không bào, thoái hóa hạt và thoái hóa mỡ Theo kết quả nghiên cứu của Đậu Ngọc Hào (1995) [10] những biến đổi bệnh lý ở gà bị nhiễm aflatoxin tập trung chủ yếu trên gan, thận và túi fabricius như: tế bào gan bị thoái hóa nặng dạng hạt hoặc không bào, thận bị viêm, tế bào thận bị thoái hóa hạt, túi fabricius bị viêm, xuất hiện một số nang nước nhỏ ở lớp biểu mô

Triệu chứng của vịt nhiễm độc thường bỏ ăn, tiếng kêu không bình thường, da chân và đùi biến thành màu tím, rối loạn vận động, co giật, ưỡn lưng, có thể dẫn đến chết Biến đổi cơ quan nội tạng chủ yếu sảy ra ở gan: gan xuất huyết, sưng to, rắn; mật, thận sưng và xuất huyết; tá tràng sưng chứa nhiều dịch rỉ viêm Trong trường hợp mãn tính, gan co lại, rắn chắc và xuất hiện các hạt, túi mật sưng to, chảy máu ở lách Các biến đổi vi thể chủ yếu là thoái hóa nguyên sinh chất dạng không bào, nhân tế bào

bị phá hủy, ống mật giãn ra, xuất hiện các sợi viêm, biểu mô ống thận bị tổn thương, thoái hóa tế bào ống lượn, cầu thận teo lại [9]

* Độc tính của aflatoxin trên người

Nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy: Các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biến ung thư gan ở những vùng đó Bệnh gây ra do độc tố nấm mốc trên người hay gặp ở các đối tượng có đời sống thấp, thức ăn cơ bản là ngũ cốc và các thức ăn thực vật giàu chất béo không được xử lý bảo quản tốt Mặt khác điều kiện khí hậu nóng ẩm, tình trạng vệ sinh kém cũng là yếu tố thuận lợi cho nấm mốc phát triển sinh độc tố và gây bệnh

Theo Sagado Transido (2011) [34], trên người một loạt các nghiên cứu cho thấy

tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu nhau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1 Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 - một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính

Kết quả nghiên cứu của Vũ Hướng Văn (2007) [22] đã chỉ ra rằng: aflatoxin ngoài việc gây ngộ độc cấp tính còn là nguyên nhân gây xơ gan và ưng thư gan Bệnh

do nhiễm aflatoxin gọi là aflatoxicosis ở thể cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan

Các tổn thương do aflatoxin (với liều lượng 3 - 4 mg/kg) về nhiều mặt, giống với các tổn thương và những chất gây ung thư gan quen thuộc khác gây nên Ngoài sự tăng sinh các tế bào nhu mô lớn, chứng xơ hóa do các tác động của các aflatoxin cũng giống chứng xơ hóa mà người ta đã thấy ở các ung thư khác [24]

1.2.6 Quy định hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc

Những quy định của Việt Nam

Qui định do Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ký ngày 31/10/2001, Số 104/2001/QĐ/BNN như sau [1]:

Bảng 1.3 Qui định hàm lƣợng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B 1 và tổng hàm

hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb):

(ppb)

Aflatoxin tổng (ppb)

Đặc biệt đối với vịt con, trong thức ăn không đƣợc chứa aflatoxin B1 Với vật nuôi còn nhỏ ở độ tuỗi từ 1 - 28 ngày rất mẫn cảm với aflatoxin, do đó hàm lƣợng tối

đa độc tố aflatoxin B1 trong thức ăn hỗn hợp phải nhỏ hơn 20 ppb

Bảng 1.4 Tiêu chuẩn cho phép hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm

phép (ppb)

Đối với aflatoxin B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung 15

(Ban hành theo quyết định số 46/2007/QĐ - BYT của Bộ Y tế, ngày 19 tháng

12 năm 2007) [2]

Những quy định của thế giới

Quy định của Hoa Kỳ: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) đã đƣa

ra mức khuyến cáo về hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khoẻ động vật

Bảng 1.5 Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA [35]

Quốc gia

Giới hạn aflatoxin tối

đa cho phép

Loại thức ăn

tất cả các giai đoạn khác nhau

các hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2

100 ppb Các loại nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Trung

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng thành

và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích khác không được công bố; đối với thức ăn chăn nuôi ngoại trừ ngô và bột từ

hạt bông

100 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi (bò, lợn) hoặc

gia cầm đã trưởng thành

200 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound trở lên

300 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ vỗ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm

1.3 Các phương pháp phân tích hàm lượng aflatoxin

1.3.1 Phương pháp lý hóa

Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính xác

và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học, hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm

* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC )

Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960

Pha tĩnh là một lớp mỏng có tính hấp phụ, thường là silicagel, được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa)

Pha động là dung môi chứa chất cần khảo sát được cho chạy qua lớp mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản

Dịch chiết được chấm lên bản mỏng thành các đốm với thể tích thường là 2, 5,

10 µl; đốm chuẩn cũng được nhỏ lên cùng bản mỏng Sau đó, bản mỏng được cho vào dung môi khai triển để các đơn chất trong hỗn hợp có thể tách rời nhau khi di chuyển bằng lực mao quản

Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroform: methnol và choloroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin

Hệ dung môi gồm nước: aceton: chloroform (1.5:12:88 ) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất [36] Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại (uv) 365mm Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây Và có độ dài Rf được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3 - 4.10-4

micromet (0.3 - 0.4mg)

* Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high performance thin layer chromatography - HPTLC)

Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC

có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát

Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess

Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1microlits so với 5 - 10 l mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm) Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03microgam) aflatoxin B1 ở lạc

Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất

* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography - HPLC)

HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác

Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

- Sắc ký lỏng pha thường: Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

- Sắc ký lỏng pha đảo: Ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều nhất

1.3.2 Phương pháp hóa sinh

Phương pháp hóa miễn dịch mang tích đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp

kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu

* Phương pháp thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay [RIA])

Trong RIA sự tạo thành phức kháng nguyên kháng thể được xác định bằng kháng nguyên đánh dấu phóng xạ trong phản ứng cạnh tranh với kháng nguyên Cơ

chế của miễn dịch phóng xạ được mô phỏng: Cho một thể tích dung dịch thử chứa một

lượng xác định kháng nguyên đánh dấu phóng xạ và một lượng kháng nguyên không đánh dấu (aflatoxin cần xác định) được cho tiếp xúc với một lượng cố định kháng thể Phản ứng cạnh tranh giữa những kháng nguyên đánh dấu và không đánh dấu gắn vào kháng thể sẽ xảy ra, sau một thời gian đạt được cân bằng, vẫn còn một vài kháng nguyên tự do Tỉ lệ liên kết tương đối của kháng nguyên đánh dấu và không đánh dấu với kháng thể tùy thuộc vào tỉ lệ nồng độ tương đối của kháng nguyên đánh dấu và không đánh dấu; tỉ lệ này càng thấp, độ phóng xạ của phức kháng nguyên - kháng thể càng thấp Sau khi tách ly phức kháng nguyên - kháng thể và những phần tử tự do, độ phóng xạ của phức được đo bằng máy đếm nhấp nháy lỏng từ đó người ta tính được lượng aflatoxin trong dung dịch mẫu đo, thường dựa trên đường cong chuẩn

Hiện nay chỉ có một vài thử nghiệm RIA trong nghiên cứu độc tố vi nấm, việc

áp dụng RIA đòi hỏi các phòng thí nghiệm phải làm việc với chất phóng xạ tuy ở nồng

độ thấp, và thời gian bảo quản các đồng vị phóng xạ có giới hạn, vấn đề thải bỏ chất phóng xạ, thêm vào đó cần phải có máy đếm nhấp nháy đắt tiền

* Phương pháp thử nghiệm miễn dịch men

Đây là phương pháp dựa trên sự liên kết thuận nghịch giữa kháng nguyên và kháng thể, sự tạo thành phức kháng nguyên - kháng thể được định lượng gián tiếp bằng cách dùng kháng nguyên đánh dấu men trong phân tử cạnh tranh gọi là kỹ thuật ELISA Bao gồm ELISA trực tiếp và gián tiếp

- Phương pháp Elisa trực tiếp

Phương pháp ELISA trực tiếp dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ Dung dịch tách từ mẫu hay aflatoxin chuẩn được ủ cùng nhau Sau đó được rửa bằng dung dịch thích hợp Lượng men được gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh

bằng mắt thường với các đĩa tiêu chuẩn

- Phương pháp Elisa gián tiếp

Trong phương pháp này các aflatoxin được gắn vào các protein phủ các đĩa chuẩn độ Mẫu tách hay aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm IgG kháng thể gắn với photphataza kiềm và phản ứng màu xảy ra với P - nitrophenyl photphat Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với lượng độc tố chuẩn

1.4 Xử lý aflatoxin trong nông sản và phụ phẩm chế biến hiện nay

Các nông sản và phụ phẩm chế biến bị nhiễm độc tố aflatoxin có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và động vật Vì vậy các nhà khoa học đã tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm Phương pháp giải quyết tốt nhất là kiềm chế aflatoxin và phòng ngừa Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được, và nếu phòng ngừa thất bại thì phải xem tới các biện pháp xử lý Các kỹ thuật dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng

khác nhau bao gồm phòng trừ bằng phương pháp vật lý, hóa học và sinh học

1.4.1 Phương pháp vật lý

* Xử lý aflatoxin bằng không khí nóng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Phương pháp này đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Lee (1969); Waltking (1977); Elkady (1981); Frank (1974), dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu chứa aflatoxin để giảm thiểu hàm lượng aflatoxin Phương pháp này đem lại hiệu quả đáng

kể Ví dụ ở trên lạc nếu sức nóng 130oC trong vòng 5 phút có thể làm giảm aflatoxin

từ 2000 ppb xuống còn 1000 ppb Nếu thổi với nhiệt độ là 100 - 145oC lượng aflatoxin B1 giảm từ 877 ppb xuống còn 452 ppb với ngô hạt [8]

* Xử lý aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao

Aflatoxin rất bền vững với nhiệt Độ ẩm là yếu tố giúp cho nhiệt độ làm giảm aflatoxin Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao với áp lực hơi nước đem lại hiệu quả khả quan hơn Nhiều thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp đun nấu thông thường (nhiệt độ = 1000C), song kết quả cho thấy không làm giảm được lượng aflatoxin có trong mẫu phân tích Khi đun sôi nguyên liệu nấu bia ở 1000C vẫn tìm thấy 90% lương aflatoxin so với lượng độc tố ban đầu Nguyên liệu bị nhiễm aflatoxin cho vào nồi hấp (điiều chỉnh nhiệt độ và áp suất), hấp ướt ở nhiệt độ 1200C, thời gian

từ 3 - 5 giờ Phương pháp này được Coomes (1996), Elkady (1981) và một số tác giả khác thực hiện

* Phương pháp chiếu xạ

Phương pháp vật lý được sử dụng nhiều ở Liên Xô từ nhiều năm về trước để

bảo quản nông sản Phương pháp chiếu xạ sử dụng các tia gama (γ) tiến hành ở liều

1; 5; 10 và 15 Mrad (Mega rad), tia cực tím (UV light) ở bước sóng 365nm để làm giảm hàm lượng aflatoxin trong nguyên liệu tuy nhiên phương pháp này không mang lại ý nghĩa kinh tế [8]

Ngoài ra, theo các nhà khoa học Ấn Độ cũng khẳng định, dưới tác động của ánh sáng mặt trời aflatoxin B1 cũng giảm được từ 83% xuống 50%

1.4.2 Phương pháp hóa học

Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên; cụ thể như chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin Đáng tiếc, nhiều hoá chất khảo sát đã không thoả mãn tất cả những tiêu chuẩn trên Mặc dù chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có những tác dụng phụ không mong muốn Theo Bùi Xuân Đồng (1999) [6] có tới vài chục chất hóa học có khả năng phá hủy độc

tố aflatoxin, song hai chất có triển vọng nhất vì đem lại hiệu quả cao và rẻ tiền là xút, amoniac Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy rằng dùng xút (NaOH) với lượng 2%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

so với lượng khô dầu và khô dầu phải thật ẩm (chứa 30% nước) thì độc tố được làm sạch Đối với amoniac có khả năng phá hủy tới 99% aflatoxin ở lạc và khô dầu lạc mà lại không làm ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm Nghiên cứu của EI Batan (1986) [40] cũng chỉ ra rằng amoniac có tác dụng khử độc tố aflatoxin trong ngô, kết quả ban đầu lượng aflatoxin giảm tử 100 ppb xuống còn 10 ppb

Đậu Ngọc Hào (2003) [8] cho biết, có thể sử dụng hỗn hợp NaOCl và H2O2 để phân hủy aflatoxin Thí nghiệm được thực hiện trên ngô khi sử lý bằng dung dịch 3%

H2O2 trong 1 giờ ở 65oC lượng aflatoxin B1 giảm từ 379 ppb xuống còn 20 ppb Nhiều tác giả cũng cho rằng có thể loại bỏ aflatoxin B1 hoàn toàn bằng hỗn hợp 2% NaOCl và 12% H2O2 ở điều kiện bình thường

Biện pháp phòng trừ nấm mốc bằng các chủng đối kháng căn cứ vào những đặc điểm

di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiết enzym có tác dụng thuỷ phân…) tính cạnh tranh sinh thái (nguồn dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm…)

Một phương hướng mới trong việc chống nhiễm aflatoxin dựa vào tính cạnh tranh là sử dụng loài vi sinh vật sinh sống trong vùng rễ cây lạc hoặc vùng đất xung

quanh củ lạc để cạnh tranh và ức chế sự phát triển của Aspergillus flavus

Nguyễn Thùy Châu (2009) [4] đã nghiên cứu và sản xuất một số chế phẩm vi sinh để phòng chống nấm sinh độc tố và độc tố nấm mốc aflatoxin trên ngô, lạc ở giai đoạn ngoài đồng và hạn chế sự nhiễm trong thời gian bảo quản Từ 2 chủng

aflatoxin Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin của chủng Aspergillus flavus DA1 và DA2 là 72% và 85% Chế phẩm này được thử nghiệm tại phòng Dược lý - Viện Kiểm nghiệm