4. ín ghĩa của đề tài
2.4.4. Phƣơng phỏp phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin
Phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin trong một số nụng sản và phụ phẩm chế biến đƣợc tiến hành theo TCVN 7596 - 2007 (ISO 16050 - 2003) [19] trờn mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
* Nguyờn lý của phương phỏp
Dựa vào sự phõn bố trờn pha động và pha tĩnh khỏc nhau, chỳng cú sự tƣơng tỏc khỏc nhau do đú mà tớnh chất khỏc nhau sẽ bị tỏch trong cột tỏch. Sau đú aflatoxin đƣợc phỏt hiện nhờ đầu dũ huỳnh quang, giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp là 0,3ng/g cho mỗi aflatoxin.
* Húa chất và thiết bị
- Húa chất: Cỏc loại húa chất dựng cho phƣơng phỏp phõn tớch trờn mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: chlorform, benzen, methanol, diclomethal, acetone, hexan…
+ Dung dịch chuẩn: đƣợc cung cấp dƣới dạng dung dịch chuẩn mix chứa aflatoxin B1,
G1: 0,3 ppb và aflatoxin B2, G2: 1 ppb trong ống xilanh kớn màu nõu, thể tớch 1ml.
Chuyển toàn bộ vào vial màu nõu. Bảo quản trong tủ lạnh ngăn đỏ dƣới 0oC và ỏnh
sỏng trực tiếp.
+ Thuốc thử: Dung mụi hỗn hợp của acetonitril: methanol với tỷ lệ 1:1 trộn thật đều rồi lọc qua bộ lọc.
+ Hỗn hợp dung dịch rửa tạp: dựng hexan và diclomethan với tỷ lệ 1:1, dựng khoảng 3ml cho mỗi lần rửa.
+ Hỗn hợp dung dịch rửa giải: dựng acetonitril và chlorform với tỷ lệ 90:10, dựng khoảng 6 - 10ml cho mỗi lần rửa.
- Thiết bị bao gồm: Mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detecter UV và RF, cột sắc ký pha đảo C18, mỏy rung siờu õm, mỏy lắc, bơm chõn khụng và bộ hỳt manifod, cột chiết pha rắn SPE silicagel.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ * Tớnh toỏn kết quả:
Căn cứ vào sự tƣơng quan giữa diện tớch pic và nồng độ, căn cứ vào diện tớch pic mẫu tớnh kết quả theo cụng thức sau:
X (μg/g) = VìKìCm/m
Trong đú:
V: Thể tớch dịch chiết cuối cựng chạy bằng mỏy HPLC (ml).
Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết mẫu tớnh theo chuẩn (ng/ml).
m: Khối lƣợng của mẫu phõn tớch (g).
X: Hàm lƣợng aflatoxin trong mẫu phõn tớch (ng/g). K: Hệ số pha loóng (tỷ lệ dịch lấy so với lƣợng chiết). - Cỏch tớnh kết quả:
Kết quả đƣợc mỏy phõn tớch tự động tớnh toỏn bằng phần mềm đƣợc lập trỡnh sẵn trong mỏy.
- Điều kiện để chấp nhận kết quả:
+ Tất cả cỏc yờu cầu về độ tƣơng thớch phải đỏp ứng đầy đủ.
+ Peak của aflatoxin phải đƣợc tỏch ra khỏi dung mụi và phải đƣợc rửa giải gần sỏt thời gian ra của paek chuẩn.
+ Tớnh toỏn hệ số tƣơng quan R phải ≥ 0,9990. - Kiểm soỏt chất lƣợng:
Phõn tớch lặp lại 2 lần song song khụng đƣợc lệch quỏ 10% so với giỏ trị trung bỡnh, nếu khụng phõn tớch lại để lấy kết quả lặp cao.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Lắc 30 phỳt, 140v/p Lắc, để yờn đến phõn lớp
Lọc lấy dịch lọc cho vào cụ quay Thu lớp dƣới cho vào cụ
quay
Nạp mẫu qua cột (2ml/phỳt)
Hoạt húa: 3ml Hexan,3 ml Diclomethal Rửa tạp: 3ml hexan, 3ml Diclomethal Rửa giải =10ml hỗn hợp Cloroform:aceton (90:10) Cụ cạn, hũa cặn bằng 1ml Methanol HPLC +100ml Cloroform Lắc 30 phỳt, 140v/p Lọc, lấy 40ml dịch lọc +40ml NaCl 1% +25ml Hexan Cụ cạn, hũa cặn = 10ml Diclomethal Lớp trờn 25ml, 25ml Clorofofm Làm sạch trờn cột
Mẫu rắn (Xay nhỏ, trộn đều) Cõn 10-20gam
Nhiều bộo Ít bộo
+ 100ml Methanol: H2O(85:15)
Quy trỡnh phõn tớch mẫu mmmm mõ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hỡnh 2.4. Sắc đồ aflatoxin của mẫu chuẩn
Hỡnh 2.5. Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở cỏc nồng độ 5; 10; 20 ppb
Tiến hành xõy dựng đƣờng cong ở những nồng độ khỏc nhau: 5; 10; 20 ppb để lập đƣờng chuẩn. Qua đú thấy rằng độ tuyến tớnh cỏc nồng độ khỏc nhau của aflatoxin R đều đạt 0,999 trở nờn. Kết quả này cho thấy sự ổn định của mỏy HPLC là rất cao.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN