Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lỏng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin số loại nông sản thực phẩm Tổng quan Độc tố nấm (mycotoxin) nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, tạo trao đổi chất thứ cấp nấm mốc gây ngộ độc với động vật có vú, cá, gia cầm Cho đến nay, 300 loại độc tố nấm phát nghiên cứu Trong đó, loại độc tố nhiều loài nấm khác sản sinh loài nấm đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố Điều đáng ý có 20 loại mycotoxin có thực phẩm mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm tạo năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria Claviceps Trong số mycotoxin aflatoxin độc tố phát sớm nghiên cứu đầy đủ phương diện (Bùi Xuân Đồng cs, 2009) Van Egmond (2005) cho biết aflatoxin sinh từ nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus, thuộc họ nấm cúc Loài nấm phổ biến, tìm thấy khắp địa cầu, đặc biệt nước nhiệt đới Aflatoxin tích luỹ thể người gia súc, nguồn nguy gây ung thư cao (nhất ung thư gan) tổn thương thận Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin ngũ cốc (ngô, kê, gạo, lúa mì), vài loại hạt có chứa dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông) Thức ăn chăn nuôi nguyên liệu chế biến thức ăn đối tượng thích hợp cho phát triển sản sinh độc tố aflatoxin Độc tính aflatoxin cao gấp 10 lần axit hydroxyanic (HCN) gấp 68 lần Arsen (As) Những nghiên cứu động vật cho thấy vật chết bị ngộ độc aflatoxin với liều 0,294mg/kg (Châu Vĩnh Thi, 2009) Trong đó, aflatoxin B1 loại độc tố độc phổ biến Aflatoxin B phân tử mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng hấp thu sau ăn Khi đến ruột non, aflatoxin B nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, hấp thu ruột non tá tràng nhiều Niêm mạc ống tiêu hóa có khả chuyển dạng sinh học aflatoxin B nhờ gắn kết với protein đường để giải độc aflatoxin B1 cho gan Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin tập trung vào gan nhiều (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin thể), thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách Nhiễm độc aflatoxin gây loạt triệu chứng cấp tính mãn tính Nhiễm độc cấp tính thường biểu động vật thí nghiệm chết với triệu chứng thường gặp hoại tử nhu mô gan, chảy máu gan viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mạn tính thường có biểu ăn ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu hoại tử nhu mô Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với ba kiểu gây ung thư, gây quái thai gây đột biến * Tình hình nghiên cứu thực trạng nhiễm aflatoxin nông sản thực phẩm Trong lịch sử xảy nhiều vụ ngộ độc thức ăn độc tố nấm mốc gây tử vong cho hàng loạt người gia súc Những nghiên cứu nấm mốc phát triển chục năm gần nhờ làm cho hiểu biết aflatoxin ngày sáng tỏ Theo FAO có khoảng 25% lượng ngũ cốc giới có chứa độc tố từ nấm mốc Ở châu Á, tỷ lệ cao yếu tố khí hậu, phương thức thu hoạch, chế biến bảo quản Như Thái Lan, nhóm nghiên cứu Shank (1997) cho biết mẫu lương thực, thực phẩm bị mốc 50-60% số mẫu có aflatoxin Ở Indonesia đậu có tỉ lệ nhiễm aflatoxin từ 60 - 80%, hàm lượng aflatoxin dao động từ 40 - 4100ppb, ngô từ 5,3 - 291,11ppb (Sudjadi, 1999) Ai Cập có 32% số ngũ cốc 6% số loại bột cá bị nhiễm aflatoxin với hàm lượng - 50ppb; 8% số ngũ cốc 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201 - 2.000ppb (Diab, 2000) Theo EC (Tổ chức Y tế bảo vệ người tiêu dùng Châu Âu), tiêu chuẩn tối đa cho phép aflatoxin đậu phộng 15 ppb (8 ppb cho B 1), loại hạt khác khô để chế biến tiếp 10 ppb (5 ppb cho B1) Đối với ngũ cốc, khô loại hạt dùng để ăn cho người, tiêu chuẩn nghiêm ngặt quy định mức ppb (2 ppb cho B 1) Ở Việt Nam, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm điều kiện thích hợp cho độc tố nấm mốc phát triển Hiện công trình nghiên cứu vấn đề chưa nhiều song đạt số kết đáng khích lệ, kết nghiên cứu Viện Vệ sinh dịch tễ nghiên cứu 29.381 mẫu lương thực thực phẩm thấy có 30 loại nấm mốc khác nhau, nấm Aspergillus chiếm tỉ lệ cao từ 5,2 đến 80,39%, bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau, số có 11 chủng có khả sinh độc tố Viện Dinh dưỡng Quốc gia thông báo có 7/55 số mẫu lạc nhiễm aflatoxin B1, chiếm tỷ lệ 13%; 2/6 mẫu xì dầu nhiễm, chiếm tỷ lệ 33% Bộ Y tế Việt Nam đưa giới hạn tối đa cho phép hàm lượng aflatoxin lương thực, thực phẩm nhằm đảm bảo sức khỏe cho vật nuôi người sau: Aflatoxin B1 thực phẩm nói chung giới hạn cho phép tối đa 5ppb; aflatoxin B2, G1, G2 15 ppb Tính cấp thiết Hiện nay, lương thực - thực phẩm, đặc biệt nông sản ngành nông nghiệp thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ, lạc… nguồn lượng nuôi sống loài người Bởi vậy, việc nâng cao chất lượng nông sản vấn đề tổ chức Quốc tế nói chung Việt Nam nói riêng đặc biệt quan tâm Nước ta nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, thuận lợi cho nấm mốc phát triển Hiện nay, phát hàng trăm loài nấm mốc độc tố nấm mốc có mặt thức ăn nguyên liệu làm thức ăn Trong đó, nguy hiểm phải kể tới độc tố aflatoxin Độc tố nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus sản sinh ra, có mặt nhiều ngô, lạc vài loại hạt khác có chứa dầu Aflatoxin không độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà gây chết gia súc trường hợp nhiễm hàm lượng lớn độc tố Aflatoxin chứng minh chất độc gây ung thư, nguy hiểm người vật nuôi (Nguyễn Thị Cẩm Vi, 2010) Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao đời từ năm 1967 - 1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp phân tích dựa nguyên tắc hóa lý (hấp thụ nhả hấp thụ liên tục chất phân tích) hỗ trợ thiết bị dựa nguyên tắc quang điện để định lượng chất phân tích Trên giới, kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng rộng rãi từ lâu Ở Việt Nam, thiết bị trang bị hầu khắp phòng thí nghiệm hóa sinh để phân tích chất dạng vết nhiều lĩnh vực khác hóa dược, chăn nuôi thú y, trồng trọt, mỹ phẩm … Thiết bị HPLC khai thác để xác định hàm lượng chất kháng sinh nhóm tetracylin, ractopamine HCl, axit amin, vitamin, Việc phân tích xác định hàm lượng aflatoxin thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 1200 cho kết xác, tiết kiệm dung môi tiết kiệm thời gian phân tích Từ lý đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lóng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin số loại nông sản thực phẩm” với mong muốn khai thác thêm ứng dụng thiết bị HPLC góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Mục tiêu Nghiên cứu ứng dụng thiết bị HPLC 1200 để định lượng aflatoxin nông sản thực phẩm góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Nội dung Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng aflatoxin thiết bị sắc ký lỏng HPLC 1200 Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên Đánh giá hệ số thu hồi quy trình đạt tiêu chuẩn theo TCVN 6910 -1: 2001 So sánh thử nghiệm tham chiếu qua kiểm tra liên phòng Ứng dụng quy trình để phân tích hàm lượng aflatoxin nông sản thực phẩm Tải file Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lỏng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin số loại nông sản thực phẩm PP nghiên cứu Các phương pháp phân tích hàm lượng aflatoxin nông sản thực phẩm: - Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC): Phương pháp sử dụng lần vào năm 1960 Người ta sử dụng mỏng tráng silica gel để xác định aflatoxin Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy mỏng chloroform: methanol choloroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi làm tăng khả hòa tan aflatoxin Nhược điểm phương pháp phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh mẫu thực mẫu chuẩn có sai lệch kết từ 20 - 30% - Phương pháp đo mật độ huỳnh quang máy Fluorodensitometer: Có nhiều tiến hơn, xác so với nhìn mắt thường Tuy nhiên, có nhiều phòng thí nghiệm đại sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp vết mỏng dễ nhiều sử dụng qua máy Densitometer Hội Hóa học phân tích (O.A.O.C) lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC Phương pháp mở rộng thành chương trình phân tích mẫu Tổ chức nghiên cứu ung thư giới (Internetional Agency for Reseach on Cancer) Các kết chương trình phân tích chứng nhận xác phương pháp phân tích TLC - Sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (High ferformane thin layer chromatography - HPTLC): Do khiếm khuyết phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn khâu chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao khía cạnh sau: đưa mẫu lên mỏng cách tự động, cải thiện đồng lớp hấp phụ, chạy mỏng dung môi có kiểm soát Quá trình đưa mẫu vào mỏng tự động hóa, vết định vị trí đo lường độ huỳnh quang vết máy densitometers - Phương pháp sắc kí cột (Column chromatography methods):: Nhằm xác định nhanh hàm lượng aflatoxin Phương pháp đơn giản, tốn xác định định tính Kĩ thuật nhồi cột mini cột sắc kí thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng - 6mm chiều rộng 20cm chiều dài Dung dịch chiết tách làm dung môi, dung môi hòa tan lượng nhỏ benzen hay chloroform Cột nhồi silicagel chất hấp thụ quan sát ánh sáng tử ngoại (UV) để xác định màu huỳnh quang xanh có mặt aflatoxin - Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods): Phương pháp mang tính đặc hiệu cao, dựa nguyên lý kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu Hai phương pháp dùng là: Aflatoxin đánh dấu phóng xạ (radio - labeled aflatoxin) aflatoxin gắn men Do tiến kỹ thuật miễn dịch năm qua, phát triển nhiều hệ thống ELISA khác để xác định aflatoxin kháng thể đơn - đa dòng Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp ELISA gián tiếp ELISA trực tiếp: Dựa nguyên lý kháng thể đặc hiệu phủ đĩa chuẩn độ Dung dịch tách từ mẫu hay aflatoxin chuẩn ủ hay tách thành hai bước Sau rửa dung dịch thích hợp Lượng men gắn vào đĩa xác định dung dịch đặc biệt Phản ứng màu đo quang phổ so sánh mắt thường với đĩa tiêu chuẩn ELISA gián tiếp: Trong phương pháp aflatoxin gắn vào protein phủ đĩa chuẩn độ (microtiter) Mẫu tách hay aflatoxin chuẩn đưa vào đĩa, kháng thể thứ cấp Lượng kháng thể gắn vào đĩa xác định thêm IgG kháng thể gắn với photphataza kiềm phản ứng màu xảy với Pnitrophenyl photphat Lượng độc tố xác định cách so sánh với đường độc tố chuẩn Toàn trình chiếm khoảng So sánh với phương pháp ELISA trực tiếp, phương pháp ELISA gián tiếp trải qua nhiều bước cần kháng thể thứ cấp, khả sai số cao chiếm nhiều thời gian - Phương sắc ký lỏng HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng lĩnh vực quan trọng đại hoá học Nó ứng dụng rộng rãi hầu hết ngành khoa học công nghiệp liên quan tới hoá học: Phân tích định tính định lượng, điều chế chất tinh khiết, xác định số hoá lý, nghiên cứu trình động học xúc tác; Trong luyện kim, địa chất, điện, than, dầu mỏ, y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường… Chính thế, hàng năm giới công bố tới vài ba nghìn công trình liên quan tới sắc ký Đối với nước ta, phương pháp sắc ký xâm nhập hàng chục năm áp dụng rộng rãi Phương pháp sử dụng hai pha pha động pha tĩnh, dựa hấp thụ tia tím (UV) xác định cường độ huỳnh quang Các chất có chất khác bị tách theo thời gian khác cột tách Mẫu phân tích tách Chloroform nước, ly tâm chất tách làm qua silicagel, pha tĩnh thường sử dụng cột nhồi silicagel micromet pha động sử dụng bezen: Acetonitril: axitformic Sau aflatoxin phát nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát phương pháp 0,3 ppb cho aflatoxin Hiệu KTXH - Hiệu giáo dục đào tạo: Đại học Thái Nguyên có số lượng sinh viên đứng thứ ba nước quy mô đào tạo Mỗi năm đào tạo hàng ngàn sinh viên trường phục vụ phát triển kinh tế tỉnh trung du miền núi nói riêng nước nói chung Đề tài nghiên cứu triển khai góp phần đào tạo đội ngũ tri thức trẻ gắn lý thuyết với thực nghiệm Các nhà nghiên cứu khoa học, giảng viên sinh viên có môi trường tốt để áp dụng tiến kỹ thuật vào thực tiễn sản xuất, nâng cao kinh nghiệm thực tế qua nâng cao chất lượng đào tạo Nhà trường nói riêng toàn Đại học nói chung - Hiệu kinh tế - xã hội: Vệ sinh an toàn thực phẩm đóng vai trò quan trọng chiến lược bảo vệ sức khoẻ người Chương trình vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia tiến hành thông qua hoạt động phòng thí nghiệm, kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Đề tài triển khai góp phần thực chương trình Quốc gia Đồng thời kết nghiên cứu đề tài thông báo kịp thời thực phẩm có nguy ô nhiễm độc tố nấm mốc cao để có biện pháp can thiệp đề phòng ngộ độc thực phẩm bảo vệ sức khoẻ cộng đồng ĐV sử dụng - Các phòng phân tích Hoá sinh - Các Phòng Nông nghiệp, Sở Nông Nghiệp Phát triển nông thôn - Các trang trại chăn nuôi, Công ty sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi - Các sở đào tạo, nghiên cứu tỉnh