Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lỏng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN

THỰC PHẨM

Mã số: ĐH 2012-TN 10-05

Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN THỊ HẢI

THÁI NGUYÊN, NĂM 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin 2

1.3.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của các Aflatoxin 2

1.3.3 Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin trong tự nhiên 4

1.3.4 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với con người và động vật 5

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN 8

1.4.1 Phương pháp vật lý hoá học 8

1.4.1 Phương pháp hoá sinh học 9

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ NHIỄM AFLATOXIN Ở CÁC LOẠI NÔNG SẢN 10

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 10

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.6 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

1.6.1 Cách tiếp cận 14

1.6.2 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 14

1.6.3 Nội dung nghiên cứu 15

1.6.4 Phương pháp nghiên cứu 15

Phần 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

2.1 THẨM ĐỊNH QUY TRÍNH PHÂN TÍCH AFLATOXIN 20

2.1.1 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 20

2.1.2 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn 21

2.1.3 Xác định độ lặp của phương pháp 22

Kết luận: Phương pháp có độ lặp đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC 23

2.1.4 Đánh giá độ đúng của phương pháp 23

2.2 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH HOÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM 25

2.2.1 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu ngô 25

2.2.3 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu khô đỗ tương 29

2.2.4 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu cám gạo 31

2.2.5 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu gạo 32

Phần 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

5.1 KẾT LUẬN 34

5.2 KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của FDA 12 Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế VN 13 Bảng 1.3: Hàm lượng AF trong một số nguyên liệu làm thức ăn gia súc ở

Bảng 1.4: Quy định hàm lượng tối đa AFB1 và AF tổng số

(B1+B2+G1+G2) trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho vật nuôi 14 Bảng 1.5 Tiêu chí đánh giá RSD theo hàm lượng chất 19 Bảng 1.6 Tiêu chí đánh giá độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau 20 Bảng 2.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 24 Bảng 2.2 Hệ số thu hồi của quy trình thử nghiệm 25 Bảng 2.3 Bảng so sánh kết quả thử nghiệm tham chiếu liên phòng 26 Bảng 2.4 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô 27 Bảng 2.5 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc 29 Bảng 2.6 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu khô đỗ tương 31 Bảng 2.7 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu cám gạo 32 Bảng 2.8 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu gạo 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sắc đồ aflatoxin ở điểm xác định LOD 21

A.flavus Aspergillus flavus

A.nomius Aspergillus nomius

A.paraciticus Aspergillus paraciticus

ADN Acid Deoxyribo nucleic

AFB1 aflatoxin B1

AFB2 aflatoxin B2

AFG1 aflatoxin G1

AFG1 aflatoxin G1

ARN Acid ribonucleic

AOAC Association of Official Analytical Chemists

FDA Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ HPLC Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

HPTLC Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao

IARC Trung tâm nghiên cứu ung thư môi trường thế giới NN-PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

ppb parts per billion

QĐ-BYT Quyết định Bộ Y tế

rADTZ recombinant aflatoxin detoxifizym enzyme

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

UV tia tử ngoại

VCK Vật chất khô

WHO Tổ chức Y tế thế giới

Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay, lương thực - thực phẩm, đặc biệt là các nông sản của ngành nông nghiệp như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ, lạc… là nguồn năng lượng chính nuôi sống con người Bởi vậy, việc nâng cao chất lượng nông sản

là một vấn đề được các tổ chức Quốc tế nói chung và Việt Nam nói riêng đặc biệt quan tâm Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển Hiện nay, đã phát hiện được hàng trăm loài nấm mốc và độc tố nấm mốc có mặt trong thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn Trong đó, nguy hiểm nhất phải kể tới độc tố aflatoxin Độc tố này do nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra, có mặt nhiều ở ngô,

lạc và một vài loại hạt khác có chứa dầu Aflatoxin không chỉ là độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc trong trường hợp nhiễm hàm lượng lớn độc tố Aflatoxin cũng được chứng minh là chất độc gây ung thư, do đó rất nguy hiểm

đối với con người và vật nuôi (Bùi Thanh Hà, 2001)[11]

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời từ những năm 1967 - 1968 trên cơ

sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp này phân tích dựa trên nguyên tắc hóa lý (hấp thụ và nhả hấp thụ liên tục chất phân tích) và

sự hỗ trợ của các thiết bị dựa trên nguyên tắc quang điện để định lượng chất phân tích Trên thế giới, kỹ thuật phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi từ rất lâu Ở Việt Nam, hiện nay thiết bị này đã

được trang bị ở một số phòng thí nghiệm hóa sinh để phân tích các chất ở dạng vết

trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hóa dược, chăn nuôi thú y, trồng trọt, mỹ phẩm… Thiết bị HPLC đã được khai thác để xác định hàm lượng các chất như kháng sinh nhóm tetracylin, ractopamine HCl, axit amin, vitamin, … Việc phân tích xác định hàm lượng aflatoxin trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có thể cho kết quả chính xác, tiết kiệm dung môi và tiết kiệm thời gian phân tích

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu

sử dụng thiết bị sắc ký lóng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một

số loại nông sản thực phẩm” với mong muốn khai thác thêm ứng dụng của thiết

bị HPLC 1200 tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng sinh an toàn thực phẩm

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu ứng dụng thiết bị HPLC 1200 để định lượng aflatoxin trong nông sản thực phẩm góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng và vệ sinh an toàn

thực phẩm

1.3 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN

1.3.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thương rất nặng nề,

lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X”

(Turkey X disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961 người ta

đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus

flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1,

AFB2, AFG1, AFG2 Giữa 4 loại trên thì AFB1 chiếm nhiều nhất trong nông sản

và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004) [32]

Năm 1961, các công trình nghiên cứu đã công nhận Aflatoxin được tạo ra

bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động

vật (Chaver Sanchehez, 1994) [27] Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu

về độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử

và công thức cấu tạo của Aflatoxin

1.3.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của các Aflatoxin

Aflatoxin gồm 4 loại là (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), có công thức phân

tử là:

Theo Vitoria (2001) [35], Công thức cấu tạo của 4 loại aflatoxin như sau:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

Tính chất lý học của các loại aflatoxin:

- AFB1: Có điểm nóng chảy 268-269 oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

- AFB2: Có điểm nóng chảy 286-289 oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

- AFG1: Có điểm nóng chảy 244-246 oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

- AFG2: Có điểm nóng chảy 229-231 oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang (Hendricks, 2002) [30]

1.3.3 Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin trong tự nhiên

1.3.3.1 Sự hiện diện của Aflatoxin

Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Trong

điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu mọt hoặc các loài gậm nhấm đục

khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao nhất là ngô, đậu tương và hạt bông (Nguyễn Xuân Mai, 2005) [17]

Theo Stoloff (1989) [34] ở Ai Cập có 32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá

đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin từ 1-50 ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại

bột cá bị nhiễm từ 201-2.000 ppb

Ở Indonesia, người ta cũng đã điều tra phát hiện Aflatoxin ở đậu từ

40-4100 ppb và tỉ lệ đậu nhiễm nấm từ 60-80%, ở ngô là 5,3-291,11 ppb (Cotty, Bayman, 1993) [28]

Theo Gayatri (2000) [29], trong 3.320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động, thực vật ở Pakistan được kiểm nghiệm đều có chứa AFB1 với hàm lượng thấp nhất là 13 ppb và cao nhất là 78 ppb Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng AFB1 cao hơn mức khuyến cáo (20 ppb) của tổ chức FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ)

Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loại thực phẩm chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp Tuy nhiên, các nhà sản xuất cũng có những phương pháp thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố này Những sản phẩm từ sữa như sữa bột, phô mai, sữa chua đôi khi cũng phát hiện có aflatoxin

1.3.3.2 Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Aflatoxin

Theo Đậu Ngọc Hào (2003) [12], hầu hết các chủng A.parasiticus đều sinh

độc tố, sự sản sinh các aflatoxin do A.flavus phụ thuộc vào từng chủng, mặt khác

nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh Sự sinh sản của aflatoxin là kết quả

tác động qua lại giữa genotip của chúng và các điều kiện phát triển của nó Sự sản sinh aflatoxin trên các chủng A.flavus thì chỉ có 73% có khả năng sinh độc tố aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh aflatoxin ở mức độ cao nhất, aflatoxin B1 được tạo ra nhiều cả ở tự nhiên lẫn nuôi cấy

Theo Bùi Xuân Đồng (2004) [9] sự sản sinh độc tố aflatoxin ngoài phụ thuộc và các chủng sinh độc tố còn phụ thuộc rất nhiều và cơ chất và điều kiện môi trường, A.flavus phát triển rất nhanh khi độ ẩm không khí cao (86 - 79%) và bên cạnh đó bản chất của cơ chất và hàm lượng nước đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành aflatoxin Nhân tố nhiệt độ môi trường cũng là yếu tố quyết định rất lớn tới sự hình thành và sản sinh độc tố nấm mốc aflatoxin, đối với lạc thì nhiệt độ tốt nhất cho A.flavus sản sinh aflatoxin là 25oC trong 7 - 9 ngày, trong khi đó thì gạo cần nhiệt độ 28oC Tác giả Nguyễn Thùy Châu (2009) [4] cho biết nhiệt độ từ 24oC

đến 28oC là nhiệt độ tối ưu cho sự sản sinh aflatoxin B1, còn aflatoxin G1 sản sinh ở nhiệt độ 30oC Theo kết quả nghiên cứu của Phan Thị Kim và cs (2003) [16] trong

điều kiện thông thoáng và nhiệt độ trung bình là 27,4oC, độ ẩm không khí trung bình 79,3% và độ ẩm trung bình trong bắp thấp (11,8%) có thể dự trữ hạt trong 2 tháng

mà aflatoxin tổng số vẫn ở mức cho phép Còn trong điều kiện độ ẩm không khí từ 72% - 89% và độ ẩm của hạt >13,5%, thì hàm lượng aflatoxin sẽ tăng rất nhanh và

đạt ở mức cao

1.3.4 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với con người và động vật

Theo Nguyễn Phùng Tiến (1982) [20], Aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120oC phải đun

30 phút mới mất tác dụng độc) Do vậy, nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên, nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử

độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng

thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1

Aflatoxin B1 (AFB1) là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng

được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn Khi đến ruột non, AFB1 sẽ được

nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng là nhiều nhất Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyển dạng sinh học AFB1 nhờ sự gắn kết với protein - đây là con đường chính để giải độc AFB1 cho gan Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô

mỡ, tụy, lách Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa [8]

- Độc tính trên động vật thí nghiệm: Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mãn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng

ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mạn tính

tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến (Nguyễn Hữu Nam, 1999) [19]

- Độc tính của aflatoxin trên người: Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan

và hoại tử nhu mô gan Bên cạnh các nghiên cứu về vai trò của virut viêm gan, ký sinh trùng, dinh dưỡng, các chất độc đối với ung thư gan, các nhà khoa học cũng

đang tập trung nghiên cứu về vai trò của aflatoxin với căn bệnh phổ biến này (Lê

Thị Ngọc Diệp, 2006) [8]

Theo Sagado Transido (2011) [33], trên người một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của AFB1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu nhau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với AFB1 Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm AFB1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 - một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính

Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn:

- Tác động qua lại với AND và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN

- Ngừng tổng hợp AND

- Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin

- Biến đổi hình thái nhân tế bào

- Giảm tổng hợp protein

Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan

Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật

và con người Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên phát Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người

Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát [6]

* Cơ chế tác động của độc tố aflatoxin lên tế bào

Đã có nhiều công trình nghiên cứu làm sáng tỏ phương thức tác động sinh hóa của aflatoxin lên các thành phần cấu tạo của tế bào và nhất là axit nucleic và lên chuyển hóa protein Như tác giả Đậu Ngọc Hào (1992) [19] tác động sinh hóa của các aflatoxin ở tế bào trải qua 5 giai đoạn kế tiếp nhau:

- Giai đoạn 1: Tác đông qua lại với ADN và ức chế các polimeraza chịu

trách nhiệm tổng hợp ADN và ARN

- Giai đoạn 2: Đình chỉ sự tổng hợp ADN Khi aflatoxin phản ứng với ADN

sẽ tạo ra các nhóm chức quinon và amin, từ đó phân tử có thể xen vào vòng xoắn kép của ADN ở chỗ mà bình thường vòng xoắn mang guanin, dẫn đến việc ADN không còn khả năng nhân đôi

- Giai đoạn 3: Tiêu giảm sự tổng hợp ARN và ADN dẫn đến ức chế hoạt

động của ARN của chất tế bào, ARN của nhân cũng bị rối loạn

- Giai đoạn 4: Biến đổi hình thái hạt nhận Các aflatoxin gây ức chế các hoạt

tính enzym, dẫn đến sự rối loạn mô hạt nhân

- Giai đoạn 5: Tiêu giảm sự tổng hợp protein Đây là hậu quả cuối cùng và

cũng là nguy hiểm nhất gây ra ung thư biểu mô tế bào gan

Như vậy, aflatoxin là chất gây ung thư rất mạnh, dẫn đến hình thành các khối u với sự sai khác của tế bảo ở gan là chủ yếu sau đó đến thận và lách Trong một khối u có sự góp mặt đủ loại tế bào Bên cạnh đó độc tố aflatoxin có ý nghĩa lớn với việc nghiên cứu các đặc tính của tế bào ung thư Đó là do giai đoạn xâm nhập của quá trình ung thư là ngắn và cần một liều lượng nhỏ đã bắt đầu ung thư

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN

1.4.1 Phương pháp vật lý hoá học

Phương pháp này dựa trên nguyên lý các aflatoxin dễ dàng tách khỏi mẫu phân tích bằng các dung môi hữu cơ phân cực mạnh như cloroform, methanol, ethanol, benzen,…

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Phương pháp này được sử dụng rộng

rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 Dung môi

sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroforin:methnol và Chloroform:aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin Phương pháp này có thế xác định được lượng từ 3-4.10-4µg nhưng thiếu sự chính xác vì sai số rất cao (30-122%)

- Phương pháp sắc khí lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC): Phương pháp này

có tính thuyết phục cao hơn TLC ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một

cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 µl so với 5-10µl mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg aflatoxin ở lạc

- Phương pháp sắc khí lỏng cao áp (HPLC): Hệ thống phân tích HPLC là hệ

thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định lượng aflatoxin Phương pháp sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia cực tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: H20 Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhồi silicagel 0,5µl và pha động sử dụng bezen : acetonitril : acid formic

Sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các aflatoxin B1,

B2, G1, G2 nồng độ 5pg Đây là phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất

- Phương pháp sắc kí cột: Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh

aflatoxin có trong mẫu, phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và 20cm chiều dài Dung dịch chiết tách được làm sạch bằng dung môi và hòa tan trong một lượng nhỏ benzen hay chloroform Cột được nhồi silicagel như một chất hấp thụ và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (uv) để xác

định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của afatoxin

1.4.2 Phương pháp hoá sinh học

Phương pháp hoá sinh học miễn dịch mang đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu Do sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau để xác

định aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng

- Phương pháp ELISA trực tiếp: Dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ Phương pháp này chiếm thời gian và sai số lớn trong cùng một mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách

- Phương pháp ELISA gián tiếp: Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thể thứ cấp vì vậy khả năng sai số cao và chiếm nhiều thời gian

- Phương pháp kháng thể đơn dòng: Trong phân tích ELISA Đây là một phương pháp phức tạp, khó thực hiện

- Phương pháp sử dụng kit ELISA thương phẩm: Các kit ELISA được sử dụng đơn giản, nhanh chóng và thích hợp ở lượng aflatoxin 20 ppb Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là giá bán kít còn cao chỉ phù hợp cho kiểm tra sản phẩm xuất nhập khẩu và các chương trình giám sát aflatoxin

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ NHIỄM AFLATOXIN Ở CÁC LOẠI NÔNG SẢN

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Mycotoxin đã được phát hiện ra rất sớm ngay từ đầu thập niên 60 Từ khi phát hiện ra Aflatoxin thì khoảng 15 năm sau, người ta đã phát hiện thêm 7 loại mycotoxin khác có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và năng suất của gia súc gia cầm Ngày nay con số này mỗi ngày một tăng thêm lên đến trên 300 loại độc tố mycotoxin Sự nhiễm độc tố nấm trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Trong

điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu bọ hoặc các loài gậm nhấm đục

khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin Đôi khi sữa, trứng, thịt cũng bị phát hiện có aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức

ăn bị nhiễm aflatoxin Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao

nhất là bắp, đậu phộng và hạt bông (Nabil Saad, 2004) [32]

Liên quan đến ảnh hưởng của AFB1 đến các chỉ tiêu sinh lý của động vật,

có rất ít công trình nghiên cứu về lĩnh vực này Các công trình nghiên cứu chủ

yếu được thực hiện trên các loài động vật như thỏ, ngựa Theo Menbez Albores (2009) [31] thì AFB1 gây ức chế sự hô hấp của tế bào tim và thận của thỏ làm giảm cường độ hô hấp của tế bào tim 35-50% và làm giảm cường độ hô hấp của tế bào thận 28-35% Một nghiên cứu khác trên ngựa cho kết quả ở hàm lượng thấp của độc tố nấm cũng có thể là suy giảm chức năng của các cơ quan như ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn, khả năng sinh sản và cường độ hô hấp và tuổi thọ

Theo Wheater et al (1985) [36] khi các loài động vật bị nhiễm độc tố sẽ làm tổn thương mô gan và thận gây ra những biến đổi bên trong tế bào như: Nhân

tế bào bị teo (cell atrophy), hiện tượng này thường xảy ra đối với tế bào mô gan;

Tế bào bị phù (hydropic degeneration) và xuất hiện các không bào trong tế bào chất (cytoplasmic vacuolation), hiện tượng này hay xảy ra ở tế bào mô thận; Tích lũy mỡ trong tế bào chất (fatty change), quá trình chuyển hóa mỡ không bình thường dẫn đến tích lũy mỡ trong tế bào chất Trên tiêu bản lát cắt trong tế bào

mô gan xuất hiện những vùng không ăn màu khi nhuộm hai màu đó là các vùng tích lũy mỡ; Hoại tử (cell nerosis), hiện tượng này xuất hiện cả trong mô gan và thận

Một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của AFB1 đối với cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) như của Gayatri (2000) [29] cho thấy, cá rô phi cho

ăn 10 tuần với thức ăn có hàm lượng 0,1 mg AFB1/kg thức ăn có tăng trọng thấp

hơn nghiệm thức đối chứng (không có AFB1) và khi cá cho ăn thức ăn có hàm lượng 0,2 mg AFB1/kg thức ăn có tỉ lệ chết 16,7% Tuy nhiên, theo Chavez- Sanchez (1994) [27] thức ăn có hàm lượng 1,88 mg AFB1/kg làm giảm sự tăng trọng của cá nhưng hàm lượng AFB1 đến 30 mg/kg thức ăn vẫn không làm chết

cá rô phi vằn có khối lượng ban đầu 0,5g sau 50 ngày thí nghiệm Một nghiên cứu khác của Stoloff (1989) cho thấy khi cá rô phi được cho ăn 0,25 mg AFB1/kg thức ăn, tăng trưởng của cá khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (không có AFB1), nhưng ở hàm lượng cao hơn (2,5 mgAFB1/kg) tăng trưởng của cá bị giảm rõ và với hàm lượng 100 mg AFB1/kg, 60% cá bị chết sau

khuyến cáo của tổ chức FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ) - Mức khuyến các của tổ chức FDA là 20 ppb

Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loại thực phẩm chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp Tuy nhiên, các nhà sản xuất cũng có những phương pháp thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố này Những sản phẩm từ sữa như sữa bột, phô mai, sữa chua đôi khi cũng phát hiện có aflatoxin

Theo quy ước của FAO và WHO, AFB1 trong thức ăn phải dưới 0,03mg/kg thức ăn Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khoẻ vật nuôi

Bảng 1.1 Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của FDA

20

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng

thành và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích khác không được công bố; đối với thức ăn chăn nuôi ngoại trừ ngô và bột từ hạt bông

100 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi (bò, lợn)

hoặc gia cầm đã trưởng thành

200 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound

trở lên

300 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ

vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm

(Nguồn: Hendricks, 2002), [30]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo tác giả Nguyễn Thùy Châu và cs (2011) [3], ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng phương pháp thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành trồng Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi trường thích hợp cho nấm phát triển Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ

có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố

trong thức ăn Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và

Penicillium Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin, rubratoxin và citrinin Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra

màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con

Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam

5 Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung

15 Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung

0,5 Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa

(Nguồn: Bộ y tế, 2007), [2]

Bảng 1.3: Hàm lượng AF trong một số nguyên liệu làm thức ăn gia súc ở VN

(Nguyễn Thùy Châu,1996) [5]

Theo Đậu Ngọc Hào (1992) [15], riêng ở các trại gà giống, độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, làm giảm tỷ lệ ấp nở Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu phộng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phọng 1.200 ppb

trung bình (ppb)

Hàm lượng AF tối đa (ppb)

(tối đa 5.000 ppb), trong bắp 205ppb (tối đa 600 ppb) Các nguyên liệu còn lại như hạt đậu nành và bánh dầu đậu nành công nghiệp, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50ppb Riêng trong thức ăn hỗn hợp với kết quả kiểm tra 28 mẫu từ các nơi gửi về (nơi có vấn đề về thức ăn) thì mức aflatoxin trung bình là 105ppb (cao nhất là 500 ppb)

Bảng 1.4: Quy định hàm lượng tối đa AFB 1 và AF tổng số (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho vật nuôi

- Sử dụng phương pháp gián tiếp để thu thập mẫu trong cộng đồng dân cư tại một số tỉnh trung du và miền núi

1.6.2 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành trên các loại nông sản như ngô, lạc, khô đỗ, gạo, cám dùng làm thức ăn chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên và một số tỉnh lân cận

- Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Phân tích hoá học - Viện Khoa hoc Sự sống - Đại học Thái Nguyên

1.6.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng aflatoxin trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 1.200 tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên

+ Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

+ Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp

+ Đánh giá độ lặp của phương pháp

+ Đánh giá độ đúng của phương pháp qua hệ số thu hồi và kiểm tra liên phòng

- Áp dụng quy trình để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một số sản phẩm nông sản thực phẩm trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên và một số tỉnh lân cận

1.6.4 Phương pháp nghiên cứu

1.6.4.1 Phương pháp phân tích

- Lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497: 2002) [22]

- Xử lý mẫu theo TCVN 6952:2001 (ISO 6498:2002) [25]

- Xác định hàm lượng vật chất khô theo TCVN 4326: 2007 (ISO 6497: 1999) [23]

- Xác định hàm lượng aflatoxin theo TCVN 7596: 2007 (ISO 16050: 2003) [21]

- Kiểm tra độ chính xác của phương pháp đo theo TCVN 6910 : 2001 [24]

1.6.4.2 Nguyên lý của phương pháp

Mẫu được chiết bằng Cloroform Dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE - Silicagel hoặc cột nhồi Silicagel Dịch rửa giải được cô quay đến cạn và

được hoà cặn bằng dung môi pha động Aflatoxin được tách bởi hệ thống sắc ký

lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18 và định lượng bằng detecter UV và

RF

1.6.4.3 Thiết bị, vật tư và hóa chất

- Thiết bị - vật tư: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV và RF, cột sắc ký pha đảo C18, 150mm x 4,6 mm x 5um, máy rung siêu âm, máy lắc, bơm chân không và bộ lọc hút manifod, cột chiết pha rắn SPE silica (500mg, 3ml)

- Hoá chất: Các loại hóa chất dùng cho máy HPLC như: Methanol, Acetonitril, Cloroform, Diclomethal, …

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc aflatoxin mix (sigma) Trong dung dịch chuẩn có nồng độ cụ thể của mỗi aflatoxin Từ dung dịch chuẩn gốc pha ra các dung dịch có nồng độ khác nhau để chạy máy

Các bước tiến hành: áp dụng theo TCVN 7596: 2007 (ISO 16050: 2003)

Điều kiện chạy máy: Cột sắc ký pha đảo C18: 150 mm x 4,6 mm x 5µm; Pha

động: H2O : ACN : MeOH = 55 : 22,5 : 22,5; Nhiệt độ buồng cột 40oC; Detector PAD đo ở bước sóng 360 nm; Detector RF đo ở Ex = 365 nm và Em 450 nm; Thể tích bơm mẫu: 50 µl; Tốc độ dòng pha động: 1ml/phút

Lưu ý khi chạy máy: Nên bơm chuẩn có nồng độ lớn nhất, nếu peak ra không

bị mất đầu (cắt đầu) thì có thể tiếp tục chạy, nếu bị cắt đầu thì vẫn chạy chuẩn đó

nhưng giảm lượng dung dịch bơm vào máy phân tích Thời gian xuất hiện peak của

mẫu thực không được cách thời gian xuất hiện peak của mẫu chuẩn quá 30 giây

Tính toán kết quả: Tính toán kết quả cho mẫu thực dựa trên đường chuẩn

Nồng độ (ppb) của aflatoxin được tính theo công thức sau:

X (ppb) = V x K x C m /P

Trong đó:

V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy HPLC (ml),

Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/ml), P: Khối lượng của mẫu phân tích (g),

X: Hàm lượng aflatoxin trong mẫu phân tích (ppb),

K: Hệ số pha loãng (tỷ lệ dịch lấy so với lượng chiết)

1.6.4.3 Thẩm định phương pháp

1.6.4.3.1 Xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection – LOD)

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng) [7]

Cách xác định LOD: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Cách này chỉ

áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp sắc ký, điện di Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu: S/N = Signal to noise ratio

Trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đường nền Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của píc tại nửa chiều cao

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu

đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

1.6.4.3.2 Xác định giới hạn định lượng (Limit of quantitation - LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn Có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp

Thông thường xác định LOQ dựa trên LOD: LOQ = 3,33 x LOD

1.6.4.3.3 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn (linearity and Calibration curve)