Khảo sát một số phương pháp trích ly lipid thô từ sinh khối vi tảo nannochloropsis oculata

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRÍCH LY LIPID THÔ TỪ SINH KHỐI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA SVTH: NGUYỄN ANH KHOA MSSV: 60604190 CBDH: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG Tp. Hồ Chí Minh, 01/2011 ii LỜI CẢM ƠN Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ 01/09/2010 đến 30/12/2010. Trong thời gian thực hiện nghiên cứu này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và quan tâm từ nhiều người: Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Đức Lượng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, cung cấp giống, và tận tình giúp đỡ trong công tác nghiên cứu. Kỹ sư Huỳnh Nguyễn Anh Khoa – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp tôi giải quyết một số vấn đề về kỹ thuật nuôi trồng vi tảo thu sinh khối và kỹ thuật chiết tách lipid. Toàn thể thầy cô cùng các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho tôi trong việc sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị để nghiên cứu. Gia đình tôi vì đã ủng hộ về mặt tinh thần và hỗ trợ tài chính để tôi có thể hoàn thành nghiên cứu một cách tốt nhất. Các bạn lớp HC06BSH, cùng toàn thể các anh chị thuộc khóa cao học 2008 đã cùng tôi chia sẻ các hóa chất, dụng cụ, và động viên tinh thần lẫn nhau trong suốt thời gian nghiên cứu này. Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành nhất! iii TÓM TẮT Nannochloropsis oculata là loài vi tảo có khả năng tích lũy lipid với hàm lượng cao thích hợp cho việc nuôi trồng ở quy mô lớn để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất biodiesel. Nghiên cứu trích ly lipid từ sinh khối Nannochloropsis oculata với dung môi hữu cơ có kết hợp xử lý sóng siêu âm và vi sóng cho thấy hiệu suất trích ly tăng lên đáng kể. Nghiên cứu tìm ra được rằng đối với dung môi n-hexane, quá trình trích ly kết hợp với xử lý sóng siêu âm trong 15 phút, thể tích dung môi 20 ml/g sinh khối khô, thời gian tiếp xúc pha từ 20-24 giờ cho hiệu suất trích ly là cao nhất. Bên cạnh đó, trích ly sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v) kết hợp xử lý với năng lượng vi sóng trong 10 phút, thể tích hỗn hợp chloroform + methanol là 30 ml/g sinh khối khô, thời gian tiếp xúc pha từ 15-24 giờ cho hiệu suất trích ly cao nhất. ABSTRACT Nannochloropsis oculata, a green microalgal strain with ability of accumulating high lipid content has potential for large scale production of biomass supply to biodiesel industry as a feedstock. In this research, the extraction of total lipid from Nannochloropsis oculata biomass with the combination of organic solvent and ultrasound irradiation or microwave energy give higher lipid yields. The optimal procedure for using n-hexane as solvent involves the extraction of 1 g dry biomass with 20 mL solvent for 15 minutes in a ultrasonic bath (average ouput of 100 W), which immediately follow the sample to immerse in solvent for 20÷24 hours. The optimal procedure for using the mixture chloroform:methanol:water (3:1:1 v/v/v) as solvent involves the extraction of 1 g dry biomass with 30 mL solvent (mixture of chloroform and methanol) for 10 minutes in a microwave oven (average output of 900 W), which immediately follow the sample to immerse in solvent for 15÷24 hours. iv MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về lipid vi tảo 3 2.1.1. Lipid và vai trò của lipid trong tế bào 3 2.1.2. Sự hình thành lipid trong tế bào vi tảo 4 2.2. Nuôi trồng và thu nhận sinh khối vi tảo 8 2.2.1. Sơ lược về vi tảo 8 2.2.2. Lợi ích của việc sử dụng vi tảo trong sản xuất biodiesel 9 2.2.3. Tiến trình phát triển nuôi trồng vi tảo 10 2.2.4. Các kiểu nuôi trồng vi tảo thu nhận lipid 11 2.3. Nannochloropsis oculata và tiềm năng cho sản xuất biodiesel 12 2.3.1. Nguồn gốc – phân loại 12 2.3.2. Đặc điểm hình thái 13 2.3.3. Đặc điểm sinh lý 13 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa 13 2.4. Các phương pháp trích ly lipid từ sinh khối 16 2.4.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào 16 2.4.2. Lý thuyết trích ly với dung môi hữu cơ 22 2.5. Một số nghiên cứu có thu nhận và ứng dụng lipid vi tảo 26 2.5.1. Nghiên cứu sử dụng chất trợ lắng để thu sinh khối vi tảo 27 2.5.2. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy lipid của vi tảo 27 2.5.3. Nghiên cứu chuyển hóa lipid vi tảo thành nhiên liệu biodiesel 28 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 v 3.1. Nguyên vật liệu 29 3.1.1. Nguồn gốc và cách trữ giống 29 3.1.2. Môi trường nuôi cấy 29 3.2. Phương pháp nghiên cứu 30 3.2.1. Khảo sát hình thái 31 3.2.2. Nhân giống 31 3.2.3. Hệ thống nuôi cấy 31 3.2.4. Thiết bị phân tích 32 3.2.5. Thu hoạch và định lượng sinh khối 32 3.2.6. Các phương pháp trích ly lipid được sử dụng 33 3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết lipid 37 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu. 39 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi. 39 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha. 40 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 4.1. Hình thái vi tảo Nannochloropsis oculata 41 4.2. Các vấn đề khi thu hoạch sinh khối 42 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu lên từng phương pháp trích ly 44 4.3.1. Sử dụng dung môi n-hexane 44 4.3.2. Sử dụng hỗn hợp chloroform-methanol-nước 46 4.4. Ảnh hưởng của thể tích dung môi trong quá trình trích ly 49 4.5. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha 52 4.6. So sánh hiệu quả trích ly của hai loại dung môi 54 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 62 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT ACAC : Acetyl-CoA carboxylase ACP: Acyl Carrier Protein. ASP: Aquatic Species Program ASTM: American Society for testing Materials. EPA: Eicosapentaenoic acid DHA: Docosahexaenoic acid NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide. NREL: National Renewable Energy Laboratory. vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng và năng suất lipid của các loài vi tảo khác nhau 15 Bảng 2.2. Tóm tắt các phương pháp pháp hóa học dùng để phá vỡ tế bào 21 Bảng 2.3. Các tính chất của một số dung môi thường dùng nhất 23 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu tạo triglyceride 3 Hình 2.2. Cấu tạo choline phospholipid 3 Hình 2.3. Cơ chế xúc tác của acetyl-CoA carboxylase hình thành malonyl-CoA 4 Hình 2.4. Con đường sinh tổng hợp acid béo 6 Hình 2.5. Con đường sinh tổng hợp triglyceride 7 Hình 2.6. Thành phần acid béo trong các nhóm lipid chính của loài Nannochloropsis sp. 14 Hình 2.7. Các phương pháp phá vỡ tế bào 16 Hình 2.8. Cấu tạo thiết bị đồng hóa áp suất cao 17 Hình 2.9. Ảnh kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii sau khi qua các cấp đồng hóa 18 Hình 2.10. Hình kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii trong sữa gầy sau khi nghiền bi 19 Hình 2.11. Động học quá trinh trích ly lipid từ N. oculata sử dụng phương pháp Folch kết hợp với sử dụng sóng siêu âm 24 Hình 2.12. Cấu trúc tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly với các phương pháp khác nhau 26 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 30 Hình 3.2. Hệ thống nuôi vi tảo quy mô bình 5 lít 31 Hình 3.3. Thiết bị hỗ trợ sục khí 32 Hình 3.4. Quy trình trích ly lipid có xử lý với sóng siêu âm 34 Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị xử lý sóng siêu âm 35 Hình 3.6. Quy trình trích ly lipid có xử lý với lò vi sóng 36 Hình 3.7. Quy trình thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly lipid 38 Hình 4.1. Tế bào N. oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 2 41 ix Hình 4.2. Hình thái N. oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 11 41 Hình 4.3. Đồ thị sự phát triển sinh khối N. oculata theo thời gian 42 Hình 4.4. Phễu chiết thu dịch tảo cô đặc 44 Hình 4.5. Sinh khối khô 44 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi n-hexane khi xử lý mẫu ở các thời gian khác nhau 45 Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi chloroform- methanol-nước sau khi xử lý mẫu với các thời gian khác nhau 47 Hình 4.8. Sự phụ thuộc của hàm lượng lipid thô vào thể tích dung môi khi xử lý với n- hexane trong điều kiện sử dụng sóng siêu âm 49 Hình 4.9. Sự phụ thuộc của hàm lượng lipid thô vào thể tích dung môi khi xử lý với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol trong điều kiện sóng siêu âm 51 Hình 4.10. Sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha lên hàm lượng lipid thô khi trích ly bằng n-hexane kết hợp với sóng siêu âm 52 Hình 4.11. Sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha lên hàm lượng lipid thô khi trích ly bằng tổ hợp dung môi kết hợp với năng lượng vi sóng 53 Hình 4.12. Dịch chiết với n-hexane 54 Hình 4.13. Dịch chiết với hỗn hợp chloroform + methanol 54 Chương 1: Mở đầu 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nhân loại đã đạt được nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật vượt bậc để phục vụ cho cuộc sống, dẫn đến việc phát triển quá mức của các ngành công nghiệp. Đồng thời, sự bùng nổ dân số đã khiến cho nhu cầu về năng lượng ngày càng cao. Các nguồn năng lượng hóa thạch như dầu mỏ, than đá, khí đốt phục vụ cho công nghiệp và dân dụng đang dần cạn kiệt. Hơn nữa, sử dụng các nguồn năng lượng này gây ra những hậu quả nghiêm trọng như làm ô nhiễm môi trường sống, và đặc biệt là làm gia tăng hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, việc tìm ra một nguồn năng lượng mới có nhiều ưu điểm hơn để thay thế cho nguồn năng lượng hóa thạch là hết sức cần thiết. Nguồn sinh khối trên trái đất được xem là vô tận nếu được sử dụng một cách hợp lý. Điển hình là dầu thực vật, mỡ động vật đã được nghiên cứu chuyển hóa thành nhiên liệu biodiesel sử dụng được cho động cơ đốt trong. Nhiên liệu biodiesel có nhiều ưu điểm so với nhiên liệu hóa thạch như: không độc hại, phân hủy được trong tự nhiên, có khả năng tái sinh, đạt được các chỉ tiêu về môi trường, và nhiều ưu điểm khác nữa khi ứng dụng cho động cơ đốt trong. Dầu mỡ động thực vật là nguồn nguyên liệu chính để chuyển hóa thành biodiesel. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này không thể đáp ứng cho nhu cầu năng lượng đang ngày một gia tăng hiện nay. Nguyên nhân là dầu thực vật có giá thành cao và yêu cầu nhiều diện tích để canh tác cây trồng, còn mỡ động vật từ các quy trình thực phẩm có chất lượng kém ảnh hưởng đến thành phẩm. Vì thế, việc tìm kiếm ra nguồn sinh khối giàu lipid, chu trình phát triển ngắn để sản xuất biodiesel đạt tiêu chuẩn đã thu hút được nhiều sự quan tâm. Một số loài vi tảo đã đáp ứng được yêu cầu này với các ưu điểm như hiệu quả quang hợp cao, tốc độ sinh trưởng nhanh, tính chất nhiên liệu thành phẩm đạt tiêu chuẩn của ASTM của Hoa Kỳ [27]. Với tình hình các nước trên thế giới đang chuyển dần qua sử dụng các loại nhiên liệu sạch, việc tiến hành nghiên cứu và nuôi trồng vi tảo ở quy mô lớn là một hướng thu nhận lipid làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel rất có tiềm năng. Điển hình là Nannochloropsis oculata, một loài vi tảo với hàm lượng lipid 22.7-29.7 % sinh khối khô [37]. [...]... như là glycolipid [48] Trích ly lipid từ sinh khối vi tảo là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất biodiesel Có nhiều phương pháp trích ly bằng nhiều dung môi hữu cơ khác nhau có thể được sử dụng để trích ly lipid Vi c lựa chọn phương pháp cụ thể để trích ly tùy thuộc vào các yếu tố như loại sinh khối, hàm lượng lipid trong sinh khối, và lượng sinh khối cần trích ly Trong tế bào vi tảo, lipid. .. trình sản xuất lipid từ vi tảo, khâu chiết xuất lipid từ sinh khối giữ vai trò không kém phần quan trọng so với khâu nuôi trồng Mỗi loại sinh khối khác nhau sẽ phù hợp với một phương pháp trích ly lipid khác nhau Vi c tìm ra phương pháp trích ly thích hợp sẽ đóng góp vào vi c làm tăng hiệu quả sản xuất lipid từ vi tảo Trước đây đã có nhiều công trình nghiên cứu trích ly lipid từ sinh khối vi tảo Tuy nhiên,... vào và hòa tan lipid [35] Ranjan và các cộng sự (2010) đã có một nghiên cứu trích ly lipid thô từ sinh khối vi tảo Scenedesmus sp bằng nhiều phương pháp khác nhau [40] Kết quả quan sát các tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly được thể hiện ở hình 2.12 Tùy theo từng phương pháp và dung môi mà sinh khối vi tảo có những dấu hiệu đặc trưng như sau: - Sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Soxhlet... (hình 2.12a), tế bào vi tảo bị teo tóp sau khi trích ly 25 Chương 2: Tổng quan tài liệu (a) (b) (c) (d) (e) Hình 2.12 Cấu trúc tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly với các phương pháp khác nhau [40] Chú thích: (a) sinh khối vi tảo lúc đầu; (b) sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Soxhlet; (c) sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Bligh & Dyer; (d) sinh khối sau khi trích ly bằng n-hexane... phƣơng pháp trích ly Vi c lựa chọn phương pháp cụ thể để trích ly tùy thuộc vào các yếu tố như loại sinh khối, hàm lượng lipid trong sinh khối, và lượng sinh khối cần trích ly Các phương pháp này có thể chỉ đơn thuần sử dụng dung môi để khuếch tán lipid ra, hoặc là kết hợp với các phương pháp phá vỡ tế bào để tăng hiệu suất của quá trình Một số phương pháp điển hình sử dụng dung môi hữu cơ để trích ly lipid: ... thích hợp cho từng phương pháp - 1.3 So sánh hiệu quả trích ly lipid giữa các phương pháp để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sản xuất biodiesel từ vi tảo sau này Nội dung nghiên cứu Với những mục tiêu như trên, tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Khảo sát lượng lipid thô thu được khi xử lý sinh khối với sóng siêu âm và vi sóng với thời gian khác nhau cho từng loại dung môi Khảo sát ảnh hưởng... 80% lipid được hòa tan vào hỗn hợp chloroform/methanol trong 90 phút đầu của quá trình trích ly trong cả hai trường hợp sử dụng sinh khối khô và sinh khối ướt Tuy nhiên, thời gian cần thiết để quá trình trích ly thiết lập cân bằng là 6 giờ (hình 2.11) Hình 2.11 Động học quá trinh trích ly lipid từ N oculata sử dụng phương pháp Folch kết hợp với sử dụng sóng siêu âm () Sinh khối ướt; () Sinh khối. .. thể là giống N oculata thì vẫn chưa được tiến hành Từ thực trạng này, thấy rằng vi c khảo sát các phương pháp trích ly lipid có trong sinh khối vi tảo N oculata phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến sản xuất biodiesel là rất cần thiết 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trong đề tài này, hướng nghiên cứu tập trung vào hai mục tiêu chính sau đây: - Tìm ra phương pháp xử lý sinh khối thích hợp cho từng loại dung... trường hợp sinh khối bị phá vỡ thành nhiều mảnh nhỏ rất mịn, teo tóp 2.5 Một số nghiên cứu có thu nhận và ứng dụng lipid vi tảo 26 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.5.1 Nghiên cứu sử dụng chất trợ lắng để thu sinh khối vi tảo Vi c tiêu tốn nhiều năng lượng cho khâu thu hoạch sinh khối vi tảo là trở ngại chính trong vi c ứng dụng nguồn nguyên liệu này cho ngành công nghiệp sản xuất biodiesel Các phương pháp. .. từng loại dung môi Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi lên lượng lipid thô trích ly được Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha giữa sinh khối với dung môi lên lượng lipid thô trích ly được 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về lipid vi tảo 2.1.1 Lipid và vai trò của lipid trong tế bào Lipid là tập hợp nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau có tính chất chung . môi. - Khảo s t ảnh hưởng của thể t ch dung môi lên lượng lipid thô trích ly được. - Khảo s t ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha giữa sinh khối với dung môi lên lượng lipid thô trích ly được t t. Người ta t nh toán rằng cỏ Panicum virgatum, m t loài cỏ có t c độ ph t triển nhanh nh t chỉ có thể chuyển hóa năng lượng m t trời thành năng lượng t n t i ở dạng sinh khối trong m t. 3.2.6. Các phương pháp trích ly lipid được sử dụng 33 3.3. Khảo s t các yếu t ảnh hưởng đến quá trình chi t lipid 37 3.3.1. Khảo s t ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu. 39 3.3.2. Khảo s t ảnh hưởng