Khảo sát một số phương pháp trích ly lipid thô từ sinh khối vi tảo nannochloropsis oculata

Bên cạnh đó, trích ly sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước 3:1:1 v/v/v kết hợp xử lý với năng lượng vi sóng trong 10 phút, thể tích hỗn hợp chloroform + methanol là 30 ml/g

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ 01/09/2010 đến 30/12/2010 Trong thời gian thực hiện nghiên cứu này, tôi

đã nhận được sự giúp đỡ và quan tâm từ nhiều người:

Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Đức Lượng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, cung cấp giống, và tận tình giúp đỡ trong công tác nghiên cứu

Kỹ sư Huỳnh Nguyễn Anh Khoa – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp tôi giải quyết một số vấn đề về kỹ thuật nuôi trồng vi tảo thu sinh khối và kỹ thuật chiết tách lipid

Toàn thể thầy cô cùng các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho tôi trong việc sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị để nghiên cứu Gia đình tôi vì đã ủng hộ về mặt tinh thần và hỗ trợ tài chính để tôi có thể hoàn thành nghiên cứu một cách tốt nhất

Các bạn lớp HC06BSH, cùng toàn thể các anh chị thuộc khóa cao học 2008 đã cùng tôi chia sẻ các hóa chất, dụng cụ, và động viên tinh thần lẫn nhau trong suốt thời gian nghiên cứu này

Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành nhất!

TÓM TẮT

Nannochloropsis oculata là loài vi tảo có khả năng tích lũy lipid với hàm lượng

cao thích hợp cho việc nuôi trồng ở quy mô lớn để cung cấp cho ngành công nghiệp

sản xuất biodiesel Nghiên cứu trích ly lipid từ sinh khối Nannochloropsis oculata với

dung môi hữu cơ có kết hợp xử lý sóng siêu âm và vi sóng cho thấy hiệu suất trích ly

tăng lên đáng kể Nghiên cứu tìm ra được rằng đối với dung môi n-hexane, quá trình

trích ly kết hợp với xử lý sóng siêu âm trong 15 phút, thể tích dung môi 20 ml/g sinh khối khô, thời gian tiếp xúc pha từ 20-24 giờ cho hiệu suất trích ly là cao nhất Bên cạnh đó, trích ly sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v) kết hợp xử lý với năng lượng vi sóng trong 10 phút, thể tích hỗn hợp chloroform + methanol là 30 ml/g sinh khối khô, thời gian tiếp xúc pha từ 15-24 giờ cho hiệu suất trích ly cao nhất

ABSTRACT

Nannochloropsis oculata, a green microalgal strain with ability of accumulating

high lipid content has potential for large scale production of biomass supply to biodiesel industry as a feedstock In this research, the extraction of total lipid from

Nannochloropsis oculata biomass with the combination of organic solvent and

ultrasound irradiation or microwave energy give higher lipid yields The optimal

procedure for using n-hexane as solvent involves the extraction of 1 g dry biomass

with 20 mL solvent for 15 minutes in a ultrasonic bath (average ouput of 100 W), which immediately follow the sample to immerse in solvent for 20÷24 hours The optimal procedure for using the mixture chloroform:methanol:water (3:1:1 v/v/v) as solvent involves the extraction of 1 g dry biomass with 30 mL solvent (mixture of chloroform and methanol) for 10 minutes in a microwave oven (average output of 900

W), which immediately follow the sample to immerse in solvent for 15÷24 hours

MỤC LỤC

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về lipid vi tảo 3

2.1.1 Lipid và vai trò của lipid trong tế bào 3

2.1.2 Sự hình thành lipid trong tế bào vi tảo 4

2.2 Nuôi trồng và thu nhận sinh khối vi tảo 8

2.2.1 Sơ lược về vi tảo 8

2.2.2 Lợi ích của việc sử dụng vi tảo trong sản xuất biodiesel 9

2.2.3 Tiến trình phát triển nuôi trồng vi tảo 10

2.2.4 Các kiểu nuôi trồng vi tảo thu nhận lipid 11

2.3 Nannochloropsis oculata và tiềm năng cho sản xuất biodiesel 12

2.3.1 Nguồn gốc – phân loại 12

2.3.2 Đặc điểm hình thái 13

2.3.3 Đặc điểm sinh lý 13

2.3.4 Đặc điểm sinh hóa 13

2.4 Các phương pháp trích ly lipid từ sinh khối 16

2.4.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 16

2.4.2 Lý thuyết trích ly với dung môi hữu cơ 22

2.5 Một số nghiên cứu có thu nhận và ứng dụng lipid vi tảo 26

2.5.1 Nghiên cứu sử dụng chất trợ lắng để thu sinh khối vi tảo 27

2.5.2 Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy lipid của vi tảo 27

2.5.3 Nghiên cứu chuyển hóa lipid vi tảo thành nhiên liệu biodiesel 28

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Nguyên vật liệu 29

3.1.1 Nguồn gốc và cách trữ giống 29

3.1.2 Môi trường nuôi cấy 29

3.2 Phương pháp nghiên cứu 30

3.2.1 Khảo sát hình thái 31

3.2.2 Nhân giống 31

3.2.3 Hệ thống nuôi cấy 31

3.2.4 Thiết bị phân tích 32

3.2.5 Thu hoạch và định lượng sinh khối 32

3.2.6 Các phương pháp trích ly lipid được sử dụng 33

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết lipid 37

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu 39

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi 39

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha 40

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

4.1 Hình thái vi tảo Nannochloropsis oculata 41

4.2 Các vấn đề khi thu hoạch sinh khối 42

4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu lên từng phương pháp trích ly 44

4.3.1 Sử dụng dung môi n-hexane 44

4.3.2 Sử dụng hỗn hợp chloroform-methanol-nước 46

4.4 Ảnh hưởng của thể tích dung môi trong quá trình trích ly 49

4.5 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha 52

4.6 So sánh hiệu quả trích ly của hai loại dung môi 54

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 62

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACAC : Acetyl-CoA carboxylase

ACP: Acyl Carrier Protein

ASP: Aquatic Species Program

ASTM: American Society for testing Materials EPA: Eicosapentaenoic acid

NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide NREL: National Renewable Energy Laboratory

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng và năng suất lipid của các loài vi tảo khác nhau 15Bảng 2.2 Tóm tắt các phương pháp pháp hóa học dùng để phá vỡ tế bào 21Bảng 2.3 Các tính chất của một số dung môi thường dùng nhất 23

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo triglyceride 3

Hình 2.2 Cấu tạo choline phospholipid 3

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của acetyl-CoA carboxylase hình thành malonyl-CoA 4

Hình 2.4 Con đường sinh tổng hợp acid béo 6

Hình 2.5 Con đường sinh tổng hợp triglyceride 7

Hình 2.6 Thành phần acid béo trong các nhóm lipid chính của loài Nannochloropsis sp 14

Hình 2.7 Các phương pháp phá vỡ tế bào 16

Hình 2.8 Cấu tạo thiết bị đồng hóa áp suất cao 17

Hình 2.9 Ảnh kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii sau khi qua các cấp đồng hóa 18

Hình 2.10 Hình kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii trong sữa gầy sau khi nghiền bi 19

Hình 2.11 Động học quá trinh trích ly lipid từ N oculata sử dụng phương pháp Folch kết hợp với sử dụng sóng siêu âm 24

Hình 2.12 Cấu trúc tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly với các phương pháp khác nhau 26

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 30

Hình 3.2 Hệ thống nuôi vi tảo quy mô bình 5 lít 31

Hình 3.3 Thiết bị hỗ trợ sục khí 32

Hình 3.4 Quy trình trích ly lipid có xử lý với sóng siêu âm 34

Hình 3.5 Sơ đồ thiết bị xử lý sóng siêu âm 35

Hình 3.6 Quy trình trích ly lipid có xử lý với lò vi sóng 36

Hình 3.7 Quy trình thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly lipid 38

Hình 4.1 Tế bào N oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 2 41

Hình 4.2 Hình thái N oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 11 41

Hình 4.3 Đồ thị sự phát triển sinh khối N oculata theo thời gian 42

Hình 4.4 Phễu chiết thu dịch tảo cô đặc 44

Hình 4.5 Sinh khối khô 44

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi n-hexane khi xử lý mẫu ở các thời gian khác nhau 45

Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi chloroform-methanol-nước sau khi xử lý mẫu với các thời gian khác nhau 47

Hình 4.8 Sự phụ thuộc của hàm lượng lipid thô vào thể tích dung môi khi xử lý với n-hexane trong điều kiện sử dụng sóng siêu âm 49

Hình 4.9 Sự phụ thuộc của hàm lượng lipid thô vào thể tích dung môi khi xử lý với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol trong điều kiện sóng siêu âm 51

Hình 4.10 Sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha lên hàm lượng lipid thô khi trích ly bằng n-hexane kết hợp với sóng siêu âm 52

Hình 4.11 Sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha lên hàm lượng lipid thô khi trích ly bằng tổ hợp dung môi kết hợp với năng lượng vi sóng 53

Hình 4.12 Dịch chiết với n-hexane 54

Hình 4.13 Dịch chiết với hỗn hợp chloroform + methanol 54

Nguồn sinh khối trên trái đất được xem là vô tận nếu được sử dụng một cách hợp

lý Điển hình là dầu thực vật, mỡ động vật đã được nghiên cứu chuyển hóa thành nhiên liệu biodiesel sử dụng được cho động cơ đốt trong Nhiên liệu biodiesel có nhiều ưu điểm so với nhiên liệu hóa thạch như: không độc hại, phân hủy được trong tự nhiên, có khả năng tái sinh, đạt được các chỉ tiêu về môi trường, và nhiều ưu điểm khác nữa khi ứng dụng cho động cơ đốt trong

Dầu mỡ động thực vật là nguồn nguyên liệu chính để chuyển hóa thành biodiesel Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này không thể đáp ứng cho nhu cầu năng lượng đang ngày một gia tăng hiện nay Nguyên nhân là dầu thực vật có giá thành cao và yêu cầu nhiều diện tích để canh tác cây trồng, còn mỡ động vật từ các quy trình thực phẩm có chất lượng kém ảnh hưởng đến thành phẩm Vì thế, việc tìm kiếm ra nguồn sinh khối giàu lipid, chu trình phát triển ngắn để sản xuất biodiesel đạt tiêu chuẩn đã thu hút được nhiều sự quan tâm Một số loài vi tảo đã đáp ứng được yêu cầu này với các ưu điểm như hiệu quả quang hợp cao, tốc độ sinh trưởng nhanh, tính chất nhiên liệu thành phẩm đạt tiêu chuẩn của ASTM của Hoa Kỳ [27]

Với tình hình các nước trên thế giới đang chuyển dần qua sử dụng các loại nhiên liệu sạch, việc tiến hành nghiên cứu và nuôi trồng vi tảo ở quy mô lớn là một hướng thu nhận lipid làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel rất có tiềm năng Điển hình là

Nannochloropsis oculata, một loài vi tảo với hàm lượng lipid 22.7-29.7 % sinh khối

khô [37]

Tuy nhiên, đối với trường hợp cụ thể là giống N oculata thì vẫn chưa được tiến hành

Từ thực trạng này, thấy rằng việc khảo sát các phương pháp trích ly lipid có trong sinh

khối vi tảo N oculata phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến sản xuất biodiesel là

rất cần thiết

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trong đề tài này, hướng nghiên cứu tập trung vào hai mục tiêu chính sau đây:

- Tìm ra phương pháp xử lý sinh khối thích hợp cho từng loại dung môi

- Tìm ra thể tích dung môi, thời gian tiếp xúc pha thích hợp cho từng phương pháp

- So sánh hiệu quả trích ly lipid giữa các phương pháp để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sản xuất biodiesel từ vi tảo sau này

1.3 Nội dung nghiên cứu

Với những mục tiêu như trên, tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

- Khảo sát lượng lipid thô thu được khi xử lý sinh khối với sóng siêu âm và vi sóng với thời gian khác nhau cho từng loại dung môi

- Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi lên lượng lipid thô trích ly được

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha giữa sinh khối với dung môi lên lượng lipid thô trích ly được

Chương 2: Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về lipid vi tảo

2.1.1 Lipid và vai trò của lipid trong tế bào

Lipid là tập hợp nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau có tính chất chung là không tan trong nước Trong tế bào tồn tại hai dạng chính, đó là các lipid dự trữ – trung tính và lipid màng – phân cực, các lipid còn lại tuy hiện diện rất ít nhưng lại có các hoạt tính sinh học cực kỳ quan trọng [3]

Triacylglycerol, hay còn gọi là triglyceride là lipid dự trữ có cấu tạo đơn giản nhất gồm 3 acid béo nối với glycerol thông qua liên kết ester (hình 2.1) Ở đa số các

tế bào eukaryote, triacylglycerol thường tích lũy ở những phase riêng biệt dạng giọt

mỡ hoặc dầu, đó chính là những nơi dự trữ năng lượng Đa số các chất béo trong tế bào là hỗn hợp của các triacylglycerol cấu tạo từ các acid béo có độ dài và độ bão hòa khác nhau Thành phần của các acid béo quyết định các tính chất của chất béo

đó Hơn nữa, do các acid béo có độ khử cao nên quá trình oxy hóa triacylglycerol giải phóng ra một lượng lớn năng lượng [3]

Hình 2.1 Cấu tạo

triglyceride [3] Hình 2.2 Cấu tạo choline phospholipid [3]

Mặt khác, các loại lipid cấu tạo nên màng tế bào bao gồm hai lớp có đầu ưa nước hướng ra ngoài và đuôi kị nước nằm cuộn bên trong giữa hai lớp ưa nước (hình 2.2) Màng lipid có nhiều loại là do sự đa dạng trong liên kết giữa đuôi kị nước và đầu ưa nước Có ba kiểu màng đó là màng sphinggolipid, màng glycerophospholipid, và màng sterol [3]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Để xác định các thành phần của lipid, cần phải tách chiết chúng từ tế bào với các loại dung môi hữu cơ Sau đó dùng các phương pháp khác nhau để phân tích chúng như sắc ký khí lỏng, sắc ký bản mỏng, phản ứng thủy giải enzyme, …

2.1.2 Sự hình thành lipid trong tế bào vi tảo

Thành phần của các loại dầu mỡ chủ yếu là các phân tử triglyceride Điển hình như lipid tách chiết từ thực vật có đến 90-98% là triglyceride, 1-5% acid béo tự do, còn lại phosphospholipid và các lipid khác [38, 53] Vì thế người ta chỉ quan tâm nhiều đến triglyceride để sản xuất các sản phẩm như dầu ăn hoặc nhiên liệu

Các loài quang tự dưỡng như thực vật, vi tảo có thể sử dụng nguồn carbon dioxide và ánh sáng mặt trời để tổng hợp nên lipid ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau [32] Còn ở cơ thể động vật, một lượng lớn triacylglycerol được tổng hợp và

dự trữ trong cơ thể từ các nguồn thức ăn khác nhau [3]

Tế bào vi tảo có khả năng sử dụng các nguồn carbon như CO2, glucose, muối acetate, … để tổng hợp nên các phân tử lipid Con đường hình thành triglyceride ở

vi tảo diễn ra theo ba bước:

Bước 1: phân tử acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) hình thành từ quá trình

quang hợp và chu trình Calvin diễn ra trong tế bào chất Đồng thời malonyl-CoA cũng được hình thành từ phản ứng giữa aceyl-CoA và ion bicarbonate với sự xúc tác của enzyme acetyl-CoA carboxylase

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACAC)

hình thành malonyl-CoA [3]

Hình 2.3 thể hiện cơ chế xúc tác của enzyem acetyl-CoA carboxylase Enzyme này chứa ba tiểu đơn vị có chức năng khác nhau: tiểu đơn vị thứ nhất là protein chứa biotin với hoạt tính biotincarboxylase có chức năng hoạt hóa và gắn CO2 vào

Chương 2: Tổng quan tài liệu

nguyên tử nitơ trong vòng biotin, protein thứ hai có hoạt tính transcarboxylase xúc tác quá trình chuyển CO2 gắn lên acetyl-CoA để tạo ra malonyl-CoA

Bước 2: kéo dài mạch và thêm các nối đôi vào mạch carbon của phân tử acid

béo

Về tổng thể, acid béo được tổng hợp và kéo dài thêm từng 2 nguyên tử carbon trong một chu trình gồm 4 phản ứng, kéo dài chuỗi carbon tới C16 hoặc C18 thì dừng lại và chuỗi carbon sẽ tách khỏi phức xúc tác

Quá trình tổng hợp acid béo sử dụng cofactor là NADPH và nhóm hoạt hóa là hai nhóm –SH khác nhau liên kết với enzyme cùng nằm trong phức enzyme tổng hợp acid béo (fatty acid synthase) Phức enzyme này có bảy tâm hoạt động nằm trên bảy sợi polypeptide khác nhau và trong suốt quá trình tổng hợp sản phẩm trung gian (chuỗi carbon đang kéo dài) luôn gắn vào một trong hai nhóm –SH nói trên

Bảy tâm hoạt động nói trên sẽ lần lượt xúc tác quá trình gắn thêm hai nguyên

tử carbon vào sợi acid béo đang tổng hợp và được di chuyển bởi protein mang nhóm acyl (acyl carrier protein – ACP) ACP chứa 4’phosphopantetheine dạng sợi làm “tay nối” giữ sợi acyl của acid béo đang hình thành trên bề mặt của phức enzyme và chuyển nó từ tâm hoạt động này sang tâm hoạt động kế tiếp nằm bên cạnh

Trong quá trình sinh tổng hợp acid béo, phân tử acetyl-CoA đóng vai trò là mồi Và quá trình kéo dài mạch carbon cần có sự kết hợp với malonyl-CoA Nhưng

cơ chất mà các enzyme tác động lên là acetyl-ACP và malonyl-ACP

Trước tiên, xảy ra phản ứng trùng ngưng acetyl-coA với nhóm –SH của enzyme acetyl-CoA-ACP acyl transferase, tiếp theo malonyl-CoA được chuyển lên nhóm –SH của ACP nhờ enzyme malonyl-CoA-ACP acyl transferase Sau đó, hai nhóm acetyl và malonyl được hoạt hóa để nối với nhau trong chu kỳ phản ứng sau:

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Hình 2.4 Con đường sinh tổng hợp acid béo [27]

 Phản ứng trùng ngưng acetyl và malonyl tạo ra 3-Ketobutyryl-ACP, giải phóng CO2 được xúc tác bởi enzyme β-ketoacyl-ACP Condensing enzyme

 Phản ứng khử carbonyl ở vị trí C-3 do enzyme β-ketoacyl-ACP

reductase xúc tác tạo ra 3-hydroxybutyryl-ACP

 Phản ứng tách nước ở vị trí C-2 và C-3 của 3-hydroxybutyryl-ACP nhờ enzyme β-hydroxyacyl-ACP dehydrase tạo ra Trans-3-Butenoyl-ACP

 Phản ứng khử liên kết đôi của Trans-3-Butenoyl-ACP nhờ enzyme enoyl-ACP reductase tạo ra butyryl-ACP

Sau đó, gốc butyryl sẽ di chuyển từ tâm hoạt động này lên nhóm –SH của tâm hoạt động khác và sẵn sàng tham gia chu trình phản ứng mới Khi chuỗi carbon đạt 16C-18C thì phân tử acid palmitic hoặc stearic tách ra khỏi phức ACP Tùy theo từng loài mà sự tổng hợp acid béo có thể kết thúc sớm hoặc muộn hơn, nên thành phần các loại acid béo trong từng loài cũng khác nhau, thường là từ 8C-18C

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Bước 3: quá trình sinh tổng hợp triglyceride trong tế bào vi tảo

Cũng giống như các loài thực vật bậc cao và động vật, tế bào vi tảo có khả năng sinh tổng hợp triglyceride để dự trữ năng lượng Nhìn chung, L-α-phosphoglycerol và acetyl-CoA là hai chất chính trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride L-α-phosphoglycerol có nguồn gốc từ phosphodihydroxyacetone, sản phẩm của quá trình đường phân Các bước phản ứng được mô tả ở hình 2.5

Hình 2.5 Con đường sinh tổng hợp triglyceride [27]

- Một trong các nhóm hydroxyl của L-α-phosphoglycerol phản ứng với phân tử acetyl-CoA để hình thành acid lysophosphatidic và sau đó kết hợp với phân

tử acetyl-CoA khác để hình thành nên acid phosphatidic Hai phản ứng này được xúc tác bởi glycerol phosphate acyltrasferase

- Trong các bước tiếp theo, acid phosphatidic bị thủy phân bởi enzyme phosphatidic phosphatase để hình thành nên diglyceride

- Hợp chất diglyceride này sau đó kết hợp với phân tử acetyl-CoA thứ ba để kết thúc quá trình sinh tổng hợp ra triglyceride nhờ enzyme glyceryl diester transacylase

Chương 2: Tổng quan tài liệu

2.2 Nuôi trồng và thu nhận sinh khối vi tảo

2.2.1 Sơ lƣợc về vi tảo

Vi tảo là các loài vi sinh vật quang tự dưỡng prokaryote hoặc eukaryote có chu

kỳ sinh trưởng ngắn và có thể sống được trong những điều kiện khác nhau Vi tảo

có mặt ở khắp nơi, từ môi trường nước cho đến trên cạn Người ta ước tính có hơn 50,000 loài vi tảo tồn tại trên trái đất, nhưng chỉ có khoảng 30,000 loài được nghiên cứu và phân tích [42]

Trong những thập kỷ vừa qua, nhiều trung tâm nghiên cứu ở các nước trên thế giới đã nghiên cứu về vi tảo phục vụ cho con người với nhiều mục đích khác nhau Một số trung tâm điển hình có bộ sưu tập giống vi tảo lớn như [37]:

- Đại học Coimbra – Bồ Đào Nha có bộ sưu tập vi tảo nước ngọt lớn nhất thế giới, có hơn 4000 chủng và 1000 loài

- Đại học Goettingen – Đức có bộ sưu tập gồm 2213 chủng và 1273 loài Trong

đó có 77% là tảo lục, 8% là cyanobacteria

- Đại học Texas – Hoa Kỳ có bộ sưu tập tảo gồm 2300 chủng tảo nước ngọt

- Viện nghiên cứu môi trường quốc gia ở Ibaraki, Nhật Bản có bộ sưu tập gồm

2150 chủng với 700 loài tảo khác nhau

Qua đó cho thấy, vi tảo rất đa dạng về chủng loại Và con người đã sử dụng các loài vi tảo vào rất nhiều mục đích như dược phẩm, dinh dưỡng, hay năng lượng Trong đó, có ứng dụng lipid từ vi tảo phục vụ cho việc sản xuất biodiesel

Thông thường, các loại thực vật sống trên cạn không có hiệu quả quang hợp

tốt Người ta tính toán rằng cỏ Panicum virgatum, một loài cỏ có tốc độ phát triển

nhanh nhất chỉ có thể chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng tồn tại ở dạng sinh khối trong một năm là 1 W/m2, ít hơn 0.5% so với năng lượng mặt trời chiếu xuống những vùng ở vĩ độ giữa – từ 200-300 W/m2 [31] Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ ra rằng hiệu quả quang hợp của vi tảo có thể cao hơn nhiều với hiệu suất thu nhận năng lượng từ ánh sáng trong khoảng 10-20% hoặc có thể cao hơn

[41] Đặc biệt, khi so sánh cùng một đơn vị diện tích nuôi trồng thì sinh khối vi tảo

thu được có thể cao hơn 50 lần so với cỏ Panicum virgatum [33] Do có hiệu quả quang hợp cao như vậy nên vi tảo được xem là nguồn tài nguyên hứa hẹn để sản xuất ra nhiều sản phẩm ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, môi trường, năng lượng [51]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Quá trình quang hợp của vi sinh vật là quá trình tái sinh sử dụng năng lượng mặt trời để chuyển hóa thành một dạng năng lượng dự trữ mới dưới dạng các liên kết hóa học Ngoài ra, con người hoàn toàn có thể chủ động sản xuất sinh khối vi tảo với số lượng lớn Vì vậy, với khả năng thu hồi năng lượng mặt trời với năng suất cao như vậy thì sinh khối vi tảo có thể được xem là một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn để sản xuất nhiên liệu tái sinh [4]

2.2.2 Lợi ích của việc sử dụng vi tảo trong sản xuất biodiesel

Có nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng vi tảo có rất nhiều ưu điểm khi sử dụng

để sản xuất biodiesel so với những nguồn nguyên liệu khác Đó là:

- Tảo được xem là các cơ thể sống có khả năng thu nhận năng lượng mặt trời

để tạo ra các hợp chất hữu cơ rất hiệu quả [58]

- Tảo được xếp vào loài thực vật không có hệ mạch dẫn, thường tồn tại ở thể đơn bào nên toàn bộ sinh khối tảo có thể dễ dàng thu hoạch và sử dụng cho các mục đích khác nhau [58]

- Vi tảo dễ dàng nuôi cấy để sản xuất một số hợp chất đặc thù chọn lọc, có giá trị kinh tế với nồng độ cao như protein, carbohydrate, lipid và các sắc tố tùy theo các điều kiện nuôi cấy [58]

- Vi tảo thuộc vào nhóm vi sinh vật sinh sản theo kiểu phân đôi tế bào, chu kỳ sinh trưởng ngắn Do đó, rất dễ dàng thực hiện những nghiên cứu, cũng như nuôi trồng thu sinh khối vi tảo [58]

- Vi tảo có thể dễ dàng thích nghi với với các điều kiện khác nhau như nước mặn, nước lợ, nước ngọt Thậm chí một số loài còn thích nghi được với môi trường nước ô nhiễm Do đó, không cần phải tốn chi phí cho việc sử dụng nước sạch [37]

- Việc sản xuất sinh khối tảo có thể dễ dàng tiến hành ở các quy mô từ phòng thí nghiệm cho đến quy mô công nghiệp đòi hỏi đầu tư cao [58]

- Năng suất dầu trên mỗi đơn vị nuôi trồng vi tảo có thể cao vượt trội năng suất dầu của các loại thực vật chứa hàm lượng dầu nhiều nhất [43] Ở điều kiện phòng thí nghiệm, hàm lượng lipid lý tưởng của một số loài vi tảo có thể đạt tới 56-60% trên tổng sinh khối khô nhờ vào kỹ thuật di truyền hoặc kỹ thuật nuôi dị dưỡng [27]

- Việc nuôi thu sinh khối vi tảo không đòi hỏi nhiều diện tích như khi trồng các loại cây lấy dầu khác Do đó, việc nuôi trồng vi tảo không làm ảnh hưởng đến sản xuất các sản phẩm từ cây trồng nông nghiệp [27]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

- Nuôi trồng vi tảo là một hướng tích cực về môi trường, giúp giảm thiểu hàm lượng CO2 trong môi trường vì vi tảo có khả năng quang hợp rất cao Trung bình để tạo ra 1 kg sinh khối khô cần đến 1.8 kg CO2 Ngoài ra, còn giúp hạn chế được việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ so với sản xuất lipid từ cây trồng [43]

- Các phụ phẩm của quá trình trích ly dầu từ vi tảo có thể được dùng làm thức

ăn cho gia súc, phân bón, hoặc lên men để tạo các sản phẩm ethanol hay methane [43]

- Đặc biệt, biodiesel từ dầu vi tảo có các thuộc tính tương tự với biodiesel theo tiêu chuẩn American Society for Testing Materials (ASTM), và thậm chí nó còn an toàn hơn vì có nhiệt độ phát cháy cao [27]

Từ các ưu điểm trên cho thấy vi tảo là một đối tượng có tiềm năng vô cùng lớn cho việc sản xuất biodiesel Cùng với đó, những tiến bộ kỹ thuật ngày nay cho thấy rằng trong tương lai việc sản xuất biodiesel từ vi tảo hoàn toàn có thể được thực hiện trên quy mô công nghiệp

2.2.3 Tiến trình phát triển nuôi trồng vi tảo

Nuôi trồng vi tảo thuộc về lĩnh vực công nghệ sinh học Nuôi trồng tảo đơn bào đã được bắt đầu từ rất sớm

- Năm 1890, tảo đơn bào Chlorella vulgaris đã được nuôi cấy trong phòng thí

nghiệm bởi Beijerinck [9]

- Năm 1960, hệ thống nuôi trồng vi tảo quy mô lớn đầu tiên xuất hiện ở Nhật

Bản bởi Nihon Chlorella cũng với đối tượng là vi tảo Chlorella [55]

- Đầu thập niên 1970, công ty Sosa Texcoco S.A đã tiến hành công trình nuôi trồng và thu hoạch tảo Sprirulina [18]

- Những năm 1970 cũng là thời kỳ khủng hoảng dầu mỏ đầu tiên của nhân loại

Và người ta đã bắt đầu quan tâm đến các loại nhiên liệu tái sinh Trung tâm nghiên cứu năng năng lượng tái sinh quốc gia của Hoa Kỳ – NREL đã đưa ra chương trình nghiên cứu các sinh vật thủy sinh – chương trình ASP để tạo ra những nguồn năng lượng tái sinh, trong đó có cả sản xuất biodiesel từ vi tảo kéo dài từ năm 1978 đến năm 1996 Dự án đã được tiến hành trong trong các

hồ rộng 1000 m2 ngoài trời ở Roswell, New Mexico từ năm 1987 đến năm

1990 Kết quả cho thấy việc sản xuất biodiesel giá thành thấp từ vi tảo có nhiều triển vọng, nhưng cần phải đào sâu nghiên cứu và phát triển về chất lượng giống, cũng như các phương pháp nuôi trồng để đạt được hiệu quả cao

Chương 2: Tổng quan tài liệu

nhất Tuy nhiên vào năm 1995, Bộ năng lượng Hoa Kỳ đã cắt giảm ngân sách

hỗ trợ cho dự án này, cho nên các thí nghiệm không thể tiến xa hơn nữa [46]

- Năm 1977, Dai Nippon Ink và Chemical Inc đưa ra phân xưởng nuôi trồng tảo Sprirulina đặt tại Thái Lan, và sản phẩm này đã được thương mại hóa [9]

- Năm 1980, có tất cả 46 phân xưởng ở châu Á nuôi trồng tảo quy mô lớn với sản lượng đạt 1 tấn/tháng [29]

- Năm 1996, trên thị trường Nhật Bản có gần 2 tấn tảo Chlorella [30]

Ngày nay, vi tảo đã nhận được nhiều sự quan tâm để đạt đến mục tiêu sản xuất

ra một lượng lớn nhiên liệu từ các kỹ thuật hiện đại và rẻ tiền nhất Tuy nhiên, cho đến nay nguồn nhiên liệu này vẫn chưa có tính cạnh tranh cao so với nguồn nhiên liệu hóa thạch nếu không được sự hỗ trợ từ phía chính phủ Xét về mặt lâu dài, dầu

mỏ đang dần cạn kiệt, nên đầu tư nghiên cứu phát triển loại nhiên liệu mới này đang nhận được khá nhiều sự quan tâm từ khắp mọi nơi Có nhiều công ty tham gia vào thị trường nhỏ này, kinh doanh các quy trình sản xuất, hay các thiết bị chuyên dụng như photo-bioreactor và các thiết bị khác để nuôi trồng vi tảo phục vụ cho sản xuất biodiesel và các ứng dụng khác Điển hình là 33 công ty lớn được đề cập đến trong khảo sát của Torrey đã và đang nghiên cứu phát triển nguồn năng lượng từ vi tảo

[54]

2.2.4 Các kiểu nuôi trồng vi tảo thu nhận lipid

Nhìn chung, vi tảo có thể dễ dàng thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau để tồn tại hoặc để tăng hiệu quả sử dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn Đặc tính thích nghi có được là nhờ sự thay đổi các tính chất sinh lý, hóa sinh trong tế bào, hoặc sự bài tiết ra môi trường các hợp chất thứ cấp để ức chế nhân tố cạnh tranh khác [4]

Vi tảo có rất nhiều kiểu trao đổi chất khác nhau như tự dưỡng, dị dưỡng, tạp dưỡng, quang dị dưỡng Tùy theo từng loài tảo, cũng như điều kiện sinh trưởng khác nhau mà vi tảo có các kiểu trao đổi chất khác nhau [15]:

- Quang tự dưỡng: chỉ sử dụng một nguồn năng lượng duy nhất lá ánh sáng để chuyển hóa thành năng lượng dưới dạng các liên kết hóa học thông qua quá trình quang hợp

- Dị dưỡng: chỉ sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm nguồn carbon cũng như cung cấp năng lượng cho các quá trình trao đổi chất

Chương 2: Tổng quan tài liệu

- Tạp dưỡng: quá trình quang hợp được xem là nhân tố chính trong tế bào, bên cạnh đó chúng vẫn cần sử dụng các hợp chất hữu cơ Điều này có nghĩa là vi tảo có khả năng sống theo kiểu tự dưỡng hoặc dị dưỡng tùy theo nồng độ các chất hữu cơ trong môi trường cũng như cường độ ánh sáng chiếu vào

- Quang dị dưỡng: vi tảo cần có ánh sáng để có thể thực hiện quá trình đồng hóa các hợp chất hữu cơ

Như đã nói, thay đổi các điều kiện nuôi trồng có thể điều chỉnh được hàm lượng các hợp chất, điển hình là lipid theo mong muốn Do đó, tùy theo yêu cầu sản phẩm mà chọn điều kiện nuôi trồng sao cho thích hợp để đạt được hiệu quả như ý muốn

Tuy nhiên, xét về mục tiêu tạo ra các dạng năng lượng tái sinh thì kiểu nuôi vi tảo theo hình thức quang tự dưỡng là có hiệu quả hơn hết Xét cân bằng năng lượng trong quá trình trao đổi chất quang tự dưỡng, toàn bộ năng lượng dự trữ trong sản phẩm có được là từ năng lượng mặt trời, vì vậy sẽ giảm một phần đáng kể chi phí nguyên liệu cho quá trình sản xuất lipid

2.3 Nannochloropsis oculata và tiềm năng cho sản xuất biodiesel

2.3.1 Nguồn gốc – phân loại

Vi tảo Nannochloropsis oculata thuộc ngành Heterokontophyta, lớp Eustigmatophyceae, bộ Eustigmatales, họ Monodopsidaceae, chi Nannochloropsis

Và thuật ngữ Nannocholoropsis là từ viết tắt của Nannochloridopsis [26]

Sự phân loại Nannochloropsis đã từng mắc phải nhiều nhầm lẫn Đây là loài

tảo có kích thước rất nhỏ (nhỏ hơn 5 μm), màu hơi xanh Cho nên, việc phân loại ban đầu các loài tảo có đặc điểm như vậy là dựa trên ba nhóm chính đó là Chlorophyceae, Tribophyceae và Eustigmatophyceae Việc quan sát các loài tảo này chỉ dựa vào kính hiển vi quang học thì không đủ để phân loại và có thể gây ra nhiều nhầm lẫn Hầu hết các tảo có đặc điểm chung như tảo đơn bào, có lớp lục lạp tại vách tế bào, vách tế bào trong suốt không có chất nhầy bao quanh, và chỉ sinh sản

theo kiểu chia đôi thành hai phần bằng nhau đều được liệt vào Nannochloris

Naumann thuộc Chlorophyceae [26]

Nannochloropsis oculata được Droop phát hiện vào năm 1955 ở các hồ nước

lợ giữa những rặng đá Sau đó, Droop đã xếp loài tảo này vào chi Nannochloris

Nhưng năm 1975, Antia đã phát hiện ra những điểm không tương thích với sự phân loại của Droop dựa trên thành phần các hợp chất trong lục lạp và cấu trúc tế bào

Chương 2: Tổng quan tài liệu

trong chi Nannochloris, qua đó N coccoides được xếp vào lớp Chlorophyceae trong khi N oculata được xếp vào Eustigmatophyceae Vì thế, Nannochloropsis là một

chi mới bao gồm các loài rất nhỏ thuộc lớp Eustigmatophyceae, trong đó phổ biến

nhất là loài Nannochloropsis oculata [6]

2.3.2 Đặc điểm hình thái

Nannochloropsis oculata là loài tảo đơn bào, tự nổi trong môi trường lỏng,

không tạo giao tử chuyển động để sinh sản hữu tính Tế bào có dạng hình cầu với đường kính khoảng 2-4 μm [26]

Nannochloropsis oculata có thành tế bào mỏng, trong suốt, hình dạng không

xác định mang một lớp đơn các sắc tố diệp lục màu vàng xanh – sắc tố đặc trưng của nhóm Eustigmatophyceae Ngoài ra, tế bào không có lớp màng nhầy bên ngoài

[26]

2.3.3 Đặc điểm sinh lý

Nannochloropsis sp là một chi thuộc dạng phiêu sinh vật tự dưỡng, trong tế

bào có các hợp chất chlorophyll [26]

Nannochloropsis oculata thuộc vào thể đơn bội, sinh sản vô tính theo kiểu

phân đôi Là loài vi tảo sống tối ưu trong môi trường nước mặn, tuy nhiên đôi khi cũng hiện diện trong môi trường nước ngọt hay nước lợ và sự thay đổi về hình thái

là không đáng kể mấy [19]

Nannochloropsis oculata có khả năng sống trong một dải nhiệt độ khá rộng

Thích nghi tốt trong điều kiện môi trường có nhiệt độ thấp, thậm chí là ở gần 00C Điều kiện sinh trưởng tốt nhất ở khoảng 210C, mức độ chiếu sáng 52 μmol photon/m2.s, pH 8.4, mức độ sục khí 14.7 vvh [19, 52]

2.3.4 Đặc điểm sinh hóa

Loài Nannochloropsis được nhận dạng dựa và hai đặc điểm Đặc điểm thứ nhất đó là không chứa hợp chất chlorophyll b, đây là đặc điểm chung của lớp

Eustimatophyceae [59] Cách nhận dạng thứ hai chính là dựa vào thành phần các sắc tố xanthophyll [57]

Nhìn chung, tế bào tảo Nannochloropsis sp có các thành phần sau:

- Các sắc tố bao gồm hai nhóm chính là chlorophyll a và carotenoid Các hợp

chất carotenoid chủ yếu là xanthophyll như violaxanthin và vaucheraxanthin Ngoài ra còn có sự hiện diện các sắc tố khác với hàm lượng rất ít như zeaxanthin và anteraxanthin [5, 28]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

- Các hợp chất polysaccharide chủ yếu là đường glucose [10]

- Thành phần protein có các amino acid chính là aspartate, glutamate, proline Trái lại các amino acid như methionine, tryptophan, cystine, histidine, và hydroxyproline hiện diện với lượng rất thấp [10]

- Lipid: các acid béo chủ yếu có trong Nannochloropsis sp là C14:0, C16:0,

C16:1, C20:4 và C20:5 Ngoài ra cũng có sự hiện diện của một số acid béo phụ khác như C18:0, C18:1, C18:2 và C18:4 Các acid béo này tồn tại ở ba dạng lipid trong tế bào vi tảo, đó là galactolipid, phospholipid và lipid trung tính [50] Thành phần các acid béo trong các hợp chất này được mô tả ở hình 2.6

 Galactolipid của Nannochloropsis sp giàu các acid béo C20:5 và

C20:4, kết hợp với C16:0 và C16:1, một lượng nhỏ C14:0

 Lipid trung tính của Nannochloropsis sp chủ yếu là các

triacylglycerol, gồm các acid béo C16:0 và C16:1, một ít acid béo C14:0 và C18:0

 Phospholipid của Nannochloropsis sp giàu C16:1, một lượng đáng kể

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Khi điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, Nannochloropsis sp có khuynh hướng đầu

tiên sẽ chuyển hóa nguồn carbon thành protein Tuy nhiên, dưới các điều kiện thay đổi khác nhau làm cho tế bào vi tảo bị kích ứng, sẽ có nhiều carbon được chuyển hóa thành các hợp chất lipid và carbohydrate Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

sẽ tác động lên thành phần lipid và các acid béo có trong tế bào vi tảo [50]

Đồ thị 2.6 chứng tỏ Nannochloropsis sp là loài vi tảo quang tự dưỡng phù hợp cho việc sản xuất acid eicosapentaenoic (C20:5ω3; EPA) Vì vậy, Nannochloropsis

sp được xem là nguồn sản xuất EPA quan trọng cho con người [12] Ngoài ra, tỷ lệ acid palmitoleic (C16:1) cũng khá cao Dưới các điều kiện môi trường khác nhau, tỷ

lệ các thành phần lipid và acid béo trong tế bào vi tảo có thể thay đổi [50] Nghĩa là

ta hoàn toàn có khả năng điều khiển được quá trình sản xuất lipid trong tế bào

Nannochloropsis sp theo ý muốn ứng với các thành phần môi trường và điều kiện

nuôi cấy khác nhau

Bảng 2.1 Hàm lượng và năng suất lipid của các loài vi tảo khác nhau [37]

Các loài vi tảo nước mặn

và nước ngọt

Hàm lượng lipid (% sinh khối khô)

Sinh khối khô (g/L/ngày)

Năng suất lipid (mg/L/ngày)

Chương 2: Tổng quan tài liệu

khô chỉ trong khoảng 22.7-29.7%, thấp hơn một số loài như Chlorella emersonii, Chlorella sp., Nannochloris sp., Neochloris oleoabundans… Nhưng do Nannochloropsis oculata có lượng sinh khối trong ngày lớn, nên năng suất lipid của

loài này có giá trị cao đáng kể, từ 84.0 đến 142.0 mg lipid/L/ngày

Kết hợp tất cả các yếu tố trên, ta có thể thấy rằng Nannochloropsis oculata hội

đủ các điều kiện để đưa vào sản xuất lipid với quy mô lớn phục vụ cho quá trình điều chế nhiên liệu biodiesel

2.4 Các phương pháp trích ly lipid từ sinh khối

2.4.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào

Vi sinh vật có rất nhiều ứng dụng trong đời sống do chúng có khả năng sản xuất ra nhiều loại hợp chất, điển hình là kháng sinh, enzyme, lipid, protein, … Thông thường các hợp chất thu nhận từ vi sinh vật là các hợp chất ngoại bào Các hợp chất này được tế bào vi sinh vật tạo ra và giải phóng vào môi trường Tuy nhiên, một lượng lớn các hợp chất khác tồn tại bên trong tế bào và chỉ có thể được thu nhận bằng các phương pháp đặc biệt [13]

Phương pháp phá vỡ tế bào

- Tự phân

Hình 2.7 Các phương pháp phá vỡ tế bào [13] Các phương pháp phá vỡ tế bào vi tảo thu nhận lipid đóng một vai trò quan trọng quá trình sản xuất biodiesel nói riêng cũng như trong các ngành công nghiệp nói chung Phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học như đồng hóa áp suất cao hay

Chương 2: Tổng quan tài liệu

nghiền hiện được tiến hành nhiều ở quy mô công nghiệp do có hiệu quả phá vỡ tế bào cao Tuy nhiên, một số phương pháp khác có tiềm năng cũng đang được chú ý phát triển như dùng enzyme, sóng siêu âm, nhiệt phân, … để mang lại hiệu quả phá

vỡ tế bào cao hơn nữa

Về cơ bản người ta chia các phương pháp phá vỡ tế bào ra làm hai loại, đó là các phương pháp cơ học và các phương pháp phi cơ học (Hình 2.7)

2.4.1.1 Các phương pháp cơ học

Nguyên lý của phương pháp này chính là dùng áp lực bên ngoài để phá vỡ thành tế bào nhờ các cơ chế xâm thực khí, ứng suất cắt, trượt, sự va đập, hoặc là tác động tương hỗ của các yếu tố này [45] Sau đây là một vài phương pháp phá

vỡ cấu trúc tế bào tiêu biểu thường được sử dụng

Đồng hóa áp suất cao: tế bào được phá vỡ bằng cách cho dịch tế bào đi

qua thiết bị tạo áp suất cao nhờ các điều chỉnh lưu lượng dòng chảy khi đi qua các van Các thông số quyết định hiệu quả của quá trình chính là áp suất, số cấp đồng hóa, kiểu van và nhiệt độ dịch tế bào [22]

Thiết bị đồng hóa được sử dụng nhiều nhất là thiết bị đồng hóa áp suất cao Manton-Gaulin APV (Hình 2.8) Về cơ bản, thiết bị này gồm có một bơm tạo áp lực đẩy dòng chất lỏng vào trung tâm của van đế và đi qua van này Nhờ đó, có thể điều chỉnh được áp suất của quá trình bằng cách điều chỉnh lưu lượng dòng chảy Dòng chất lỏng đi qua các van và va vào các vòng đập trong thiết bị Áp suất dùng để đồng hóa các tế bào vi sinh vật nằm trong khoảng 55-200 Mpa [22]

Hình 2.8 Cấu tạo thiết bị đồng hóa áp suất cao [13]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Áp suất cửa ra được điều khiển bởi vô lăng A thông qua lò xo B Vị trí của van C được bố trí gần van D Trong suốt quá trình xả, dòng chất lỏng đi qua khe hẹp của van D Do thay đổi áp suất đột ngột nên dòng chất lỏng va vào vòng đập

E Tại đây các tế bào bị phá vỡ và được hút ra khỏi van chặn

Đồng hóa một cấp chủ yếu phá hủy tế bào thành những mảnh lớn Sau những cấp tiếp theo, các mảnh tế bào lớn bị phá hủy thành những mảnh nhỏ hơn

[7] Hình 2.9 (b, c, d) mô tả ảnh kính hiển vi điện tử của vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii sau khi qua các cấp đồng hóa 1, 2, 3 của thiết bị đồng hóa áp suất

cao Qua đó cho thấy các tế bào bị phá vỡ dần so với tế bào chưa xử lý (Hình 2.9a)

Hình 2.9 Ảnh kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus

delbrueckii sau khi qua các cấp đồng hóa [22]

Trở ngại chính của phương pháp này chính là sự phân hủy những thành phần nhạy cảm với nhiệt nên cần phải có hệ thống giải nhiệt bên ngoài

Sóng siêu âm: sóng siêu âm là một phương pháp dùng để phá vỡ tế bào tồn

tại ở dạng dịch huyền phù Sóng được sử dụng thường có năng lượng cao với tần

số lớn hơn 15-20 kHz mà con người không thể nghe thấy được để làm bất hoạt cũng như phá vỡ cấu trúc của các tế bào [22]

Cơ chế của quá trình phá vỡ tế bào có liên quan đến hiện tượng xâm thực khí Ứng suất cắt của các dòng chảy xoáy tạo ra bởi quá trình nổ của các bóng

Chương 2: Tổng quan tài liệu

khí xâm thực Các dòng chảy xoáy lớn hơn kích thước tế bào có xu hướng làm cho các tế bào chuyển động hơn là phá vỡ chúng, còn các dòng chảy xoáy nhỏ hơn kích thước tế bào có xu hướng tạo ra ứng suất phá vỡ tế bào nhiều hơn Vì thế, các tế bào có kích thước lớn thường dễ dàng bị phá vỡ hơn [22]

Hầu hết năng lượng sóng siêu âm hấp phụ vào dịch tế bào ở dạng nhiệt năng Và nhiệt độ tăng cao có thể làm biến tính enzyme và các hợp chất khác Do

đó, cần phải điểu khiển tốt nhiệt độ của quá trình xử lý [13]

Nghiền bi: có thể sử dụng để phá vỡ tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm

cũng như là quy mô công nghiệp Đây là phương pháp đơn giản nhất để phá vỡ cấu trúc của các tế bào vi sinh vật Cấu tạo chính của thiết bị nghiền bi bao gồm một buồng hình trụ có thể quay quanh trục, bên trong có hệ thống đảo trộn làm cho các hạt bi có thể va chạm với nhau làm phá vỡ cấu trúc của vật liệu nghiền

[13] Hình 2.10 mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii sau khi được xử lý bằng

thiết bị nghiền bi

Hình 2.10 Hình kính hiển vi điện tử mô tả tế bào Lactobacillus delbrueckii

trong sữa gầy sau khi nghiền bi [22]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phá vỡ tế bào là:

- Kích thước của bi nghiền: bi nghiền có đường kính càng nhỏ thì hiệu quả phá

vỡ tế bào càng cao Các sản phẩm nằm trong tế bào chất thường cần bi nghiền

có đường kính nhỏ và các sản phẩm thuộc màng hay trong ty thể cần bi có đường kính lớn hơn (0.55 – 0.85 mm) Các loài vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, vi tảo cần bi nghiền có đường kính lớn (0.25 – 0.75 mm) trong khi đó các tế bào vi khuẩn cần bi nghiền có đường kính nhỏ hơn (0.1 – 0.15

Chương 2: Tổng quan tài liệu

mm) Trong công nghiệp bi nghiền có đường kính 0.4÷0.6 mm thường được

sử dụng do thuận lợi trong việc tách bi ra khỏi sản phẩm sau này [22]

- Số lượng bi nghiền trong thiết bị: hiệu suất phá vỡ tế bào càng tăng khi thể tích bi nghiền tăng do sự tiếp xúc giữa các bi nghiền tăng Độ nạp đầy của bi nghiền hiệu quả nhất trong khoảng từ 70-90% thể tích buồng chứa Nếu độ nạp đầy của bi nghiền cao hơn 90% thì hiệu quả của quá trình phá vỡ tế bào bão hòa do sự đảo trộn kém hiệu quả [13, 22]

- Vận tốc cánh đảo trộn càng tăng thì hiệu quả phá vỡ càng cao nhưng kéo theo

là sự gia tăng nhiệt độ và tiêu tốn nhiều năng lượng [13]

- Mật độ tế bào trong nguyên liệu: tỷ lệ tế bào trong nguyên liệu cần thiết để tối

ưu quá trình nghiền nằm trong khoảng 30-60% khối lượng [22]

2.4.1.2 Các phương pháp phi cơ học

Phương pháp vật lý: bao gồm các phương pháp giảm áp, shock thẩm thấu,

nhiệt phân, và vi sóng

- Phương pháp giảm áp: nguyên tắc phá vỡ tế bào của phương pháp này là tế bào được trộn với các loại khí ở trạng thái tới hạn hay siêu tới hạn Khi đó các khí siêu tới hạn sẽ thấm qua màng vào trong tế bào Khi áp suất bên ngoài giảm thì các chất lỏng siêu tới hạn trở thành khí thoát ra ngoài và phá vỡ tế bào Ưu điểm phương pháp là tác động phá vỡ nhẹ nhàng do đó tạo ra những mảnh vỡ có kích thước lớn dễ dàng được tách ra Điểm bất lợi của phương pháp là hiệu quả thấp, phụ thuộc rất lớn vào áp suất vận hành, thời gian tiếp xúc giữa tế bào và lỏng siêu tới hạn [39]

- Phương pháp shock thẩm thấu: tế bào được đưa vào môi trường ưu trương có nồng độ chất tan cao (như dung dịch sucrose 1 M), sau đó pha loãng dung dịch một cách đột ngột Quá trình này gây ra hiện tượng tăng áp suất nội làm phá vỡ tế bào Phương pháp này gây tác động nhẹ nhàng đến tế bào và bị ảnh hưởng bởi khả năng sống sống sót của tế bào vi sinh vật Nhược điểm là khó

áp dụng cho qui mô công nghiệp do chi phí cao [39]

- Phương pháp nhiệt phân: màng tế bào của vi sinh vật có khả năng bị phá hủy dưới tác động của nhiệt độ trong khoảng thời gian nhất định và giải phóng các chất bên trong tế bào chất Ưu điểm của phương pháp này là có khả năng phát triển trên qui mô công nghiệp do trang thiết bị đơn giản hơn so với các phương pháp khác Nhựơc điểm là chỉ áp dụng cho những sản phẩm ít nhạy

Chương 2: Tổng quan tài liệu

cảm với nhiệt độ và có khả năng xuất hiện hiện tượng tăng độ nhớt do nuớc bốc hơi gây khó khăn cho hoạt động hệ thống [39]

- Phương pháp vi sóng (microwave): vi sóng là một dạng kết hợp của điện trường và từ trường, hay còn gọi là dạng năng lượng điện từ Tần số của sóng này nằm trong khoảng 300 đến 300,000 MHz, tạo ra bức xạ làm đảo các cực của đám mây electron Vi sóng chỉ làm đứt các liên kết hydro nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của các phân tử Năng lượng từ vi sóng có thể dễ dàng được điều khiển với lò vi sóng thông thường Do đó, ta có thể thực hiện việc đun nóng và hạ nhiệt một cách dễ dàng để tạo ra sự sốc nhiệt làm cho cơ chất có thể dễ dàng hòa tan vào dung môi [35]

Phương pháp hóa học:

Bảng 2.2 Tóm tắt các phương pháp pháp hóa học dùng để phá vỡ tế bào [22]

Sử dụng các chất

phá màng tế bào

Urea, Guanidine, Ethanol

Phá vỡ màng tế bào bằng cách phá liên kết nội phân

tử của protein màng và lớp peptidoglican

Hiệu quả không cao

Sử dụng các chất

tẩy

Triton X, Sodium dodecyl sulphate (SDS), sodium lauryl sarcosinate (Sarcosyl)

Tạo các hạt micell chứa lipid của màng

Chủ yếu để thu protein màng; có thể ảnh hưởng tới lipid trong tế bào

vi tảo

Sử dụng các dung

môi

Toluene, Chloroform, Acetone

Hòa tan các thành phần kị nước trong màng và trong tế bào

Độc hại, đắt tiền, hiệu quả thấp và phụ thuộc nhiều vào loại tế bào

Phương pháp enzyme:

Tế bào vi tảo không có vách cellulose như tế bào thực vật nên trong quá trình sử dụng enzyme phá vỡ tế bào ta chỉ cần các tổ hợp enzyme có khả năng phân hủy màng tế bào vi tảo Ưu điểm của phương pháp này là việc phá hủy tế

Chương 2: Tổng quan tài liệu

bào nhẹ nhàng và mang tính đặc hiệu, tạo ra các mảnh tế bào lớn thuận lợi cho quá trình ly tâm tách bã về sau Tuy nhiên giá cả cao của các loại enyme là trở ngại lớn nhất cho việc áp dụng phương pháp này vào quy mô lớn [39]

Đã có nhiều thí nghiệm đã được tiến hành nhằm mục đích nâng cao hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách sử dụng enzyme cố định trên giá thể chất vô cơ như NaY Zeolite [11] Hiện nay, lysozyme thường được sử dụng để phân giải lớp peptidoglycan vì chúng có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic Enzyme này được sử dụng nhiều vì giá thành tương đối rẻ do được điều chế từ lòng trắng trứng [22] Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2009) đã nghiên cứu phá vở tế bào

Spirulina platensis bằng viscozyme và lysozyme Kết quả cho thấy viscozyme

cho hiệu quả cao hơn vì đây là hỗn hợp nhiều loại enzyme có khả năng phân giải nhiều thành phần khác nhau của màng tế bào trong khi lysozyme chỉ có tác dụng phân giải peptidoglycan [2]

2.4.2 Lý thuyết trích ly với dung môi hữu cơ

Lipid là các hợp chất có hoạt tính sinh học Chúng liên kết với các phân tử carbohydrate và protein để hình thành nên glycolipid và lipoprotein Ngoài ra, các phân tử khác như các phân tử dung môi cũng có thể liên kết với lipid Lợi dụng tính chất này, ta có thể dùng các loại dung môi để tách lipid ra khỏi liên kết với màng tế bào, lipoprotein, cũng như là glycolipid [48]

Trích ly lipid từ sinh khối vi tảo là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất biodiesel Có nhiều phương pháp trích ly bằng nhiều dung môi hữu cơ khác nhau có thể được sử dụng để trích ly lipid Việc lựa chọn phương pháp cụ thể để trích ly tùy thuộc vào các yếu tố như loại sinh khối, hàm lượng lipid trong sinh khối, và lượng sinh khối cần trích ly Trong tế bào vi tảo, lipid tồn tại ở dạng các giọt nhỏ với kích thước trong khoảng 30 nm [47] Vì thế, người ta cho rằng có hai

cơ chế cơ bản để tách chiết lipid [40], đó là:

- Khuếch tán lipid qua thành tế bào do sinh khối có thể tồn tại ở dạng huyền phù và các loại dung môi có thể hòa tan một cách chọn lọc lipid

- Phá vỡ thành tế bào làm cho các chất trong tế bào thoát ra ngoài và hòa tan vào dung môi

Tùy theo từng phương pháp cụ thể mà lipid có thể thoát ra ngoài theo hai cơ chế trên với mức độ khác nhau Có thể nhận thấy rằng cơ chế khuếch tán có hiệu quả kém hơn, điển hình là thời gian trích ly dài và hiệu suất thu được cũng thấp

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Điều này là do quá trình khuếch tán của phân tử lipid qua thành tế bào diễn ra rất chậm Mặc khác, cơ chế giải phóng lipid bằng cách phá vỡ tế bào diễn ra rất nhanh bởi vì các giọt lipid có thể hòa tan ngay vào pha lỏng [40]

Có nhiều yếu tố tác động lên quá trình trích ly bằng các loại dung môi Sau đây là một vài yếu tố điển:

2.4.2.1 Ảnh hưởng của dung môi:

Trong nhiều trường hợp, bản chất của dung môi hữu cơ gây ảnh hưởng đáng kể lên quá trình chiết Qua một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã thấy được ảnh hưởng của bản chất dung môi lên quá trình chiết Điều này được giải thích dựa trên độ tan và thể tích phân tử của dung môi Do đó, thông qua sự ảnh hưởng này, ta có thể chọn loại dung môi để tăng độ chọn lọc khi chiết Đặc biệt, việc dùng các hỗn hợp dung môi có thể tạo ra hiệu quả trích ly cao do dung môi này có các tính chất tổ hợp mà các dung môi riêng lẻ không có được [1]

Trong thực tiễn, các dung môi được sử dụng phải có nhiệt độ sôi không quá thấp so với nhiệt độ môi trường vì sự tốc độ bay hơi nhanh gây khó khăn cho việc giữ thể tích pha cố định Vì thế, các dung môi thường được chọn có nhiệt độ sôi cao hơn nhiệt độ phòng (bảng 2.3) [1]

Hơn nữa, cần phải lưu ý đến sự phân hủy của dung môi khi làm việc gây ra các hiệu ứng phụ ảnh hưởng xấu đến quá trình trích ly Ví dụ như các ete đơn giản có xu hướng tích lũy peroxide, còn chloroform khi tồn tại trong môi trường kiềm thì tạo ra acid formic [1]

Bảng 2.3 Các tính chất của một số dung môi thường dùng nhất [1]

môi

Moment lưỡng cực, D

Nhiệt độ sôi, 0

C

Trọng lượng riêng

2.4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha

Việc nghiên cứu động học của quá trình chiết có ý nghĩa rất lớn trong lý thuyết cũng như trong thực tiễn ứng dụng Trong đó, yếu tố thời gian tiếp xúc pha giữa cơ chất với dung môi có ảnh hưởng rất lớn Điều này là do trong các hệ

Chương 2: Tổng quan tài liệu

chiết thì cân bằng pha không được thiết lập ngay mà phải có đủ thời gian để dung môi hòa tan cơ chất, thiết lập trạng thái cân bằng [1]

Thời gian cần thiết để thiết lập cân bằng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong

đó quan trọng nhất là đặc tính của dung môi Tùy từng loại dung môi, chất cần chiết và điều kiện cụ thể mà thời gian để hệ thiết lập cân bằng có thể là vài giờ, thậm chí có khi còn lên đến vài ngày [1]

Một nghiên cứu về động học của quá trình chiết lipid bằng phương pháp Folch kết hợp với xử lý sóng siêu âm, sử dụng tổ hợp dung môi chloroform:methanol (2:1 v/v) với thể tích gấp 20 lần thể tích mẫu trích ly được thực hiện bởi Converti và các cộng sự [16] Kết quả cho thấy rằng 80% lipid được hòa tan vào hỗn hợp chloroform/methanol trong 90 phút đầu của quá trình trích ly trong cả hai trường hợp sử dụng sinh khối khô và sinh khối ướt Tuy nhiên, thời gian cần thiết để quá trình trích ly thiết lập cân bằng là 6 giờ (hình 2.11)

Hình 2.11 Động học quá trinh trích ly lipid từ N oculata sử dụng phương pháp Folch

kết hợp với sử dụng sóng siêu âm () Sinh khối ướt; () Sinh khối khô [16]

2.4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Việc đánh giá một cách chính xác ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá chiết vẫn chưa được xác định rõ ràng Tuy nhiên, các khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết các hợp chất khác nhau cho thấy rằng với sự gia tăng nhiệt độ thì hiệu suất của quá trình kém dần Điều này được lý giải là ở nhiệt độ cao hơn, các quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn làm cho cơ chất thoát ra ít hơn [1]

Chương 2: Tổng quan tài liệu

2.4.2.4 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly

Việc lựa chọn phương pháp cụ thể để trích ly tùy thuộc vào các yếu tố như loại sinh khối, hàm lượng lipid trong sinh khối, và lượng sinh khối cần trích ly Các phương pháp này có thể chỉ đơn thuần sử dụng dung môi để khuếch tán lipid

ra, hoặc là kết hợp với các phương pháp phá vỡ tế bào để tăng hiệu suất của quá trình Một số phương pháp điển hình sử dụng dung môi hữu cơ để trích ly lipid:

- Phương pháp Soxhlet sử dụng dung môi n-hexane: dựa vào tính hòa tan của

lipid trong dung môi hữu cơ để khuếch tán lipid ra khỏi nguyên liệu khô Do

đó, phương pháp này không gây ra sự phá vỡ tế bào [36]

- Phương pháp Bligh và Dyer: huyền phù tế bào được trộn với hỗn hợp chloroform và methanol Sự trích ly bao gồm hai quá trình diễn ra đồng thời,

đó là quá trình khuếch tán lipid ra khỏi tế bào và quá trình phân tách hỗn hợp các chất sau khi trích ly bằng cách cho thêm nước vào hỗn hợp [8]

- Phương pháp trích ly kết hợp với sóng siêu âm phá vỡ tế bào: sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào Cơ chế của quá trình phá vỡ là do có sự xuất hiện của các bóng khí nhỏ trong pha lỏng Do cơ chất cần trích ly – lipid có tính chất kỵ nước nên phương pháp này cần sử dụng dung môi hữu cơ để trích ly

Sự trích ly bao gồm cả hai quá trình là phá vỡ tế bào và khuếch tán lipid theo dung môi [40]

- Phương pháp trích ly kết hợp với vi sóng: năng lượng vi sóng ảnh hưởng chủ yếu đến các phân tử trong sinh khối vì chúng có hằng số điện môi cao, và hầu như không ảnh hưởng đến các phân tử dung môi không phân cực bởi vì chúng

có hằng số điện môi thấp Vi sóng làm cho các phân tử trong sinh khối bị ion hóa và chuyển động hỗn độn Chính điều này làm cho dung môi dễ dàng thấm vào và hòa tan lipid [35]

Ranjan và các cộng sự (2010) đã có một nghiên cứu trích ly lipid thô từ sinh

khối vi tảo Scenedesmus sp bằng nhiều phương pháp khác nhau [40] Kết quả quan sát các tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly được thể hiện ở hình 2.12 Tùy theo từng phương pháp và dung môi mà sinh khối vi tảo có những dấu hiệu đặc trưng như sau:

- Sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Soxhlet (hình 2.12b) không có dấu hiệu của sự phá vỡ tế bào Tuy nhiên, kích thước tế bào bị giảm đi so với kích thước ban đầu (hình 2.12a), tế bào vi tảo bị teo tóp sau khi trích ly

Chương 2: Tổng quan tài liệu

(e)Hình 2.12 Cấu trúc tế bào vi tảo trước và sau khi trích ly với các phương

pháp khác nhau [40]

Chú thích: (a) sinh khối vi tảo lúc đầu; (b) sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Soxhlet; (c) sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Bligh & Dyer; (d) sinh khối sau khi trích ly bằng n-hexane kết hợp sóng siêu âm; (e) sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Bligh & Dyer kết hợp sóng siêu âm

- Sinh khối sau khi trích ly bằng phương pháp Bligh & Dyer cho thấy tế bào có dấu hiệu bị phá vỡ và các mảnh tế bào bị teo tóp hẳn đi (hình 2.12c) Nguyên nhân của quá trình phá vỡ là do methanol có khả năng hòa tan màng tế bào

- Sinh khối sau xử lý với sóng siêu âm (hình 2.12d cho trường hợp sử dụng dung môi n-hexane và hình 2.12e cho trường hợp sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform-methanol): cho thấy cả hai trường hợp sinh khối bị phá vỡ thành nhiều mảnh nhỏ rất mịn, teo tóp

2.5 Một số nghiên cứu có thu nhận và ứng dụng lipid vi tảo

Chương 2: Tổng quan tài liệu

2.5.1 Nghiên cứu sử dụng chất trợ lắng để thu sinh khối vi tảo

Việc tiêu tốn nhiều năng lượng cho khâu thu hoạch sinh khối vi tảo là trở ngại chính trong việc ứng dụng nguồn nguyên liệu này cho ngành công nghiệp sản xuất biodiesel Các phương pháp thu hoạch sinh khối thường được sử dụng trước đây là

ly tâm, lọc tiêu tốn rất nhiêu năng lượng nên giá thành nguyên liệu sinh khối cao Các phương pháp kết lắng bằng hóa chất như ion Zn2+

, Al3+, Fe3+ tuy có hiệu suất cao và được ứng dụng nhiều trong công nghiệp nhưng lại không phải là phương pháp có lợi về kinh tế do không thể tái sử dụng được môi trường vì các ion kim loại vẫn còn tồn tại trong đó [49]

Gần đây, người ta tìm ra một phương pháp ứng dụng các loại tảo có khả năng kết lắng cao để thu hoạch các loại tảo có khả năng kết lắng kém Một nghiên cứu của Salim và các cộng sự (2010) sử dụng ba chủng vi tảo có khả năng tự kết lắng

Ankistrodesmus falcatus, Tetraselmis suecica, Scenedesmus obliquus ứng dụng

trong các nghiên cứu sau [44]:

- Vi tảo A falcatus và S obliquus được sử dụng để kết lắng Chlorella vulgaris

- Vi tảo T suecica được sử dụng để kết lắng vi tảo Neochloris oleoabundans

Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung các loài vi tảo này có thể làm tăng nhanh

quá trình kết lắng của vi tảo C vulgaris và N oleoabundans Do đó, hiệu suất thu

hồi sinh khối cũng được cải thiện rõ rệt Khả năng kết lắng này được Salim giải thích là do các polysaccharide ngoại bào của các vi tảo được bổ sung có khả năng liên kết với bề mặt của các đối tượng vi tảo cần kết lắng để tạo phức hợp có tốc độ lắng nhanh

2.5.2 Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy lipid của vi tảo

Nhằm sản xuất lipid vi tảo có khả năng chuyển hóa thành nhiên liệu biodiesel với năng suất cao, Chiu và các cộng sự (2009) tiến hành nghiên cứu sục khí CO2 để

đánh giá khả năng tích lũy lipid của Nannochloropsis oculata trong quá trình nuôi

cấy theo mẻ [14] Kết quả cho thấy rằng sự tích lũy lipid trong pha logarith đến pha

cân bằng của N oculata tăng đáng kể từ 30.8% lên 50.4% sinh khối khô khi sục khí

CO2 vào môi trường với nồng độ 2%

Nghiên cứu tuyển chọn giống có khả năng sinh tổng hợp lipid để ứng dụng trong hệ thống nuôi cấy ngoài trời đã được Rodolfi và các cộng sự (2009) tiến hành:

30 chủng vi tảo được đem phân tích khả năng sinh tổng hợp lipid Trong số đó,

Nannochloropsis sp F&M-M24 có khả năng tích lũy lipid mạnh khi nuôi cấy trong

Chương 2: Tổng quan tài liệu

điều kiện thiếu nguồn nitơ Chủng này sau đó được nuôi cấy trong thiết bị photobioreactor 20 L để nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng cũng như nguồn dinh dưỡng (nitơ hoặc phospho) lên sự tích lũy lipid Kết quả cho thấy rằng hàm lượng lipid tăng từ 117 mg/L/ngày trong điều kiện môi trường có đầy đủ dinh dưỡng (sinh khối khô thu được trung bình là 0.36 g/L/ngày, tương ứng với hàm lượng lipid là 32%) lên 204 mg/L/ngày (sinh khối khô thu được trung bình là 0.30 g/L/ngày, tương ứng với 60% lipid) trong điều kiện môi trường nghèo nitơ [43]

Khảo sát này cho thấy rằng chủng Nannochloropsis sp F&M-M24 hoàn toàn có

khả năng nuôi trồng với quy mô lớn để thu nhận sinh khối cho trích ly lipid với các mục đích khác nhau

2.5.3 Nghiên cứu chuyển hóa lipid vi tảo thành nhiên liệu biodiesel

Dầu lipid có thể được chuyển hóa thành nhiên liệu biodiesel – methyl ester của các acid béo mạch dài bằng nhiều chất xúc tác khác nhau như xúc tác kiềm, xúc tác acid, hay xúc tác enzyme Thậm chí cũng có thể chuyển hóa bằng phương pháp không sử dụng chất xúc tác, đó là phương pháp sử dụng methanol ở điều kiện siêu tới hạn Các phương pháp này đều có ưu nhược điểm riêng khi xét trên tốc độ phản ứng, hiệu suất chuyển hóa, khả năng tái sử dụng xúc tác, cũng như giá thành của thiết bị khi áp dụng ở quy mô công nghiệp [56]

Có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra chất xúc tác thích hợp cho phản ứng chuyển hóa dầu vi tảo thành nhiên liệu sử dụng được Trong đó có nghiên cứu của Udum và các cộng sự (2009) áp dụng trên đối tượng vi tảo

Nannochloropsis oculata Nghiên cứu này dùng methanol để thực hiện phản ứng

transester hóa, kế hợp với sử dụng hỗn hợp xúc tác CaO/Al2O3 và hỗn hợp xúc tác MgO/Al2O3 Kết quả cho thấy rằng hiệu suất chuyển hóa cao hơn nhiều lần so với trường hợp sử dụng CaO hoặc MgO riêng lẻ Hiệu suất chuyển hóa tối ưu đạt được

là 97.5% khi sử dụng hỗn hợp xúc tác 80% khối lượng CaO/Al2O3 với tỷ lệ methanol/lipid là 30 [56]

Việc sử dụng các chất xúc tác dạng rắn có rất nhiều ưu điểm như hiệu suất chuyển hóa cao, dễ dàng tách hỗn hợp xúc tác ra sau khi phản ứng kết thúc Do đó,

sử dụng xúc tác dang rắn có hiệu quả kinh tế cao khi so sánh với các loại xúc tác khác [37] Nghiên cứu của Udum cho thấy rằng dầu lipid từ vi tảo Nannochloropsis oculata hoàn toàn có khả năng ứng dụng để sản xuất nhiên liệu biodiesel trên quy

mô công nghiệp