Bơm hút chân không và phễu lọc. Máy ly tâm.
Tủ sấy. Tủ hút ẩm. Cân phân tích.
3.2.5. Thu hoạch và định lƣợng sinh khối
Thu hoạch và định lượng sinh khối khô phục vụ cho lập đường cong sinh trưởng của vi tảo theo thời gian:
- Lọc 2 lít huyền phù chứa sinh khối vi tảo bằng phễu lọc chân không, sử dụng 2 lớp giấy lọc để đảm bảo lọc được tất cả sinh khối. Giấy lọc đã được sấy đến khối lượng không đổi mo trước đó ở 60oC.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
33
- Sau khi lọc, sinh khối được sấy ở 60oC trong khoảng 10-15 giờ sao cho đạt khối lượng không đổi. Sau đó, mẫu được đặt trong bình hút ẩm 2 giờ rồi đem cân khối lượng khô m1 bằng cân phân tích.
- Sinh khối khô được tính theo công thức:
SKK= (m1 – mo)/2 (g/l)
Thu hoạch sinh khối phục vụ cho giai đoạn trích ly lipid thô:
- Các bình sinh khối vi tảo đến ngày thu hoạch được để cho lắng tự nhiên mà không sục khí để có thể tháo bỏ phần nước phía trên.
- Phần dịch sinh khối lắng dưới đáy bình được đem ly tâm trong ống ly tâm PE 50 ml với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ lớp nước bên trên ống ly tâm, phần sinh khối lắng phía dưới được sấy ở 60 0
C trong khoảng 10-15 h đến khối lượng không đổi.
- Nghiền sinh khối khô thành dạng bột bằng cối và chày sứ. Chia thành từng mẫu khối lượng 1 g trữ trong chai thủy tinh 100 ml phục vụ cho quá trình trích ly sau này.
3.2.6. Các phƣơng pháp trích ly lipid đƣợc sử dụng
Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hai phương pháp trích ly lipid thô từ vi tảo Nannochloropsis oculata. Đó là: phương pháp trích ly kết hợp với xử lý sóng siêu âm và trích ly kết hợp với xử lý vi sóng.
3.2.6.1. Trích ly có xử lý với sóng siêu âm
Trích ly có xử lý với sóng siêu âm được tiến hành với thiết bị Sonic & Materials, model VCX 500 (Nhật Bản), tần số 20 kHz, công suất có thể điều chỉnh từ 100 W đến 500 W. Quy trình trích ly được tiến hành như hình 3.4.
Mỗi 1 g mẫu được ngâm vào một lượng dung môi xác định trong bình thủy tinh 100 ml. Trong nghiên cứu này, ta tiến hành với hai loại dung môi đó là: n- hexane và hỗn hợp chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v). Trong đó nước chỉ được cho vào hỗn hợp trích ly khi đã xử lý mẫu xong.
Lắc đều hỗn hợp rồi đem đi xử lý trong thiết bị tạo sóng siêu âm. Lắp đặt hệ thống như hình 3.5. Điều chỉnh công suất của thiết bị ở mức 100 W để tạo ra sóng âm có biên độ áp suất trong khoảng 1-5 bar. Thiết bị tạo ra sóng âm theo chu kỳ, sau mỗi 5 giây hoạt động thì lại ngừng 5 giây sao cho tổng thời gian xử lý đạt yêu cầu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
34 Ngâm Sinh khối khô
Dung môi t=30 phút
Xử lý sóng siêu âm
Lọc pha chứa lipid
Bã 100 W Sấy T=60-70 0C Lipid thô Ngâm On 5 giây : Off 5 giây
Thời gian tùy vào nghiệm thức
Hình 3.4. Quy trình trích ly lipid có xử lý với sóng siêu âm
Ngâm cho thời gian tiếp xúc pha đạt yêu cầu của các thí nghiệm khảo sát sau khi đã xử lý xong.
Loại bỏ bã sinh khối:
o Đối với dung môi hexane: chỉ cần lọc hỗn hợp để thu dịch chiết.
o Đối với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol – nước: để yên cho tách pha thành hai lớp. Sau đó, loại bỏ pha phân cực phía trên, pha còn lại chứa chủ yếu là chloroform và lipid cùng với bã sinh khối được đem lọc để thu dịch chiết.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
35
Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị xử lý sóng siêu âm
(1) Đầu dò; (2) Bình thủy tinh có hệ thống giải nhiệt; (3) Bệ đỡ; (4 và 5) lần lượt là cửa vào và ra của nước giải nhiệt;
(6) Cửa tháo liệu; (7) Bộ xử lý và hiển thị.
Sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C cho đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn (khối lượng bình khôi đổi). Lipid thô được định lượng bằng cân phân tích.
Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức sau: lipid thô
SKK
% Lipid thô = m 100
m
Trong đó: mlipid thô – khối lượng lipid thu được sau khi sấy (g)
mSKK – khối lượng sinh khối khô đem trích ly (g)
3.2.6.2. Trích ly có xử lý với lò vi sóng
Trích ly kết hợp với xử lý lò vi sóng được tiến hành với lò vi sóng gia dụng Sharp model R-218H(S) (Nhật Bản) có công suất điều chỉnh được trong phạm vi 100 W đến 900 W. Quy trình trích ly như hình 3.6.
Mỗi 1 g mẫu được ngâm vào một lượng dung môi xác định trong bình thủy tinh 100 ml được bịt kín. Trong nghiên cứu này, tiến hành với hai loại dung môi đó là: n-hexane và hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v). Trong đó nước chỉ được cho vào hỗn hợp trích ly khi đã xử lý mẫu xong.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
36 Ngâm Sinh khối khô
Dung môi t=30 phút
Xử lý vi sóng
Lắc đều, để nguội
Lọc pha chứa lipid
Lặp cho tổng thời gian xử lý đạt yêu cầu Bã 900 W, 20 giây Sấy T=60-70 0C Lipid thô Ngâm Thời gian tùy vào
nghiệm thức
Hình 3.6. Quy trình trích ly lipid có xử lý với lò vi sóng
Lắc đều hỗn hợp rồi cho bình thủy tinh vào lò vi sóng xử lý với thời gian xác định ở công suất 900 W. Lưu ý, sau mỗi 20 giây lấy bình thủy tinh ra lắc đều, giải nhiệt cho đến khi nguội hẳn rồi mới đem xử lý tiếp. Thí nghiệm được lặp lại cho đến khi tổng thời gian xử lý mẫu trong lò vi sóng đạt yêu cầu.
Ngâm mẫu sau xử lý trong thời gian 24 h. Loại bỏ bã sinh khối:
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
37
o Đối với dung môi hexane: chỉ cần đen hỗn hợp lọc để thu dịch chiết.
o Đối với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol – nước (3:1:1 v/v/v): để yên cho tách pha thành hai lớp. Sau đó, loại bỏ pha phân cực phía trên, pha còn lại chứa chủ yếu là chloroform và lipid cùng với bã sinh khối được đem lọc để thu dịch chiết.
Sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C cho đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn (khối lượng bình không đổi). Lipid thô được định lượng bằng cân phân tích.
Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức sau: lipid thô
SKK
% Lipid thô = m 100
m
Trong đó: mlipid thô – khối lượng lipid thu được sau khi sấy (g)
mSKK – khối lượng sinh khối khô đem trích ly (g)
3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết lipid
Quá trình thí nghiệm nhằm mục đích tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly lipid từ sinh khối vi tảo N. oculata trong trường hợp sử dụng dung môi
n-henane và trong trường hợp sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform-methanol-nước. Trong đó các yếu tố được khảo sát khi sử dụng mỗi loại dung môi khác nhau gồm:
- Phương pháp xử lý. - Thời gian xử lý. - Thể tích dung môi. - Thời gian tiếp xúc pha.
Do đó, tiến hành thí nghiệm khảo sát các yếu tố trên theo trình tự được mô tả ở sơ đồ trong hình 3.7.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
38
Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến từng phương pháp xử lý
Chọn phương pháp xử lý và thời gian xử lý tối ưu đối với từng loại dung môi
Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thể tích
Chọn ra thể tích tối ưu
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha
Chọn ra thời gian ngâm thích hợp
Kết thúc quá trình khảo sát
Hình 3.7. Quy trình thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly lipid Dựa trên các thông số trích ly lipid từ vi tảo Scenedesmus sp., một loài tảo nước ngọt có hàm lượng lipid từ 6-10% do Ranjan, Patil & Moholkar 2010 đề nghị [39]. Tiến hành chọn lại các điều kiện ban đầu để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình trích ly lipid từ vi tảo N. oculata như sau:
- Đối với trường hợp sử dụng dung môi n-hexane:
o Thể tích thể tích dung môi sử dụng là 30 ml cho 1 g sinh khối khô.
o Thời gian xử lý với sóng siêu âm là 10 phút với công suất thiết bị là 100W. Đối với trường hợp vi sóng là 10 phút, 900 W.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
39
o Thời gian tiếp xúc pha sau khi xử lý là 24 giờ, có lắc đảo với tốc độ 150 vòng/phút.
- Đối với trường hợp sử dụng hỗn hợp chloroform-methanol-nước:
o Tỷ lệ thể tích chloroform:methanol:nước = 3:1:1, trong đó nước chỉ được cho vào sau khi đã tiến hành xử lý xong. Tổng thể tích hỗn hợp chloroform và methanol là 40 ml.
o Tổng thể tích hỗn hợp chloroform + methanol được sử dụng là 40 ml.
o Thời gian xử lý với sóng siêu âm là 10 phút với công suất thiết bị 100W. Đối với trường hợp vi sóng là 10 phút, 900W.
o Thời gian tiếp xúc pha sau khi xử lý là 24 giờ, có lắc đảo với tốc độ 150 vòng/phút.
Từ các quy trình cơ bản, tiến hành thay đổi các giá trị để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình chiết lipid thô từ vi tảo N. oculata bằng các thí nghiệm sau.
3.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu.
Tiến hành lắc các mẫu sinh khối khô khối lượng 1 g với dung môi trong 30 phút. Sau đó, xử lý trong thời gian lần lượt là 5, 10, 15, 20 phút theo quy trình ở hình 3.4 đối với phương pháp sóng siêu âm và theo quy trình ở hình 3.6 đối với phương pháp vi sóng. Các mẫu đối chứng không cần xử lý, chỉ cần ngâm trong hỗn hợp dung môi 24 giờ rồi đem lọc tách bã, bốc hơi dung môi đến khi khối lượng không thay đổi. Các thông số khác như thể tích dung môi, thời gian tiếp xúc pha được giữ cố định như đã đề cập ở mục 3.3 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý.
Đối với từng loại dung môi, chọn ra phương pháp xử lý với thời gian thích hợp. Cố định các yếu tố này để tiến hành khảo sát tiếp các yếu tố khác về sau.
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích dung môi.
Tiến hành lắc các mẫu sinh khối khô khối lượng 1 g với dung môi trong 30 phút trước khi xử lý:
- Thí nghiệm với n-hexane, thay đổi thể tích dung môi khảo sát ở các mức 10, 15, 20, 25, 30 ml.
- Thí nghiệm với hỗn hợp có tỷ lệ thể tích chloroform:methanol:nước = 3:1:1, tổng thể tích chloroform và methanol để khảo sát ở các mức 15, 20, 25, 30, 40 ml.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
40
Các yếu tố khác như phương pháp xử lý và thời gian xử lý cho từng loại dung môi được chọn ra sau loạt thí nghiệm ở mục 3.3.1.
3.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tiếp xúc pha.
Với phương pháp xử lý và thời gian xử lý mẫu thích hợp được chọn ở mục 3.3.1, thể tích dung môi thích hợp được chọn ở mục 3.3.2, ta tiến hành khảo sát lượng lipid thô thu được sau quá trình xử lý với thời gian ngâm lần lượt là 1, 5, 10, 15, 20, 24 giờ. Các mẫu đối chứng sau khi xử lý xong thì loại bã sinh khối ngay rồi đem sấy cho bay hơi dung môi. Cân và tính toán lượng lipid thô như đã mô tả trong mục 3.2.6.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
41
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Hình thái vi tảo Nannochloropsis oculata
Quan sát hình thái vi tảo N. oculata trên kính hiển vi, ta thấy vi tảo tồn tại ở dạng từng tế bào riêng rẽ hình cầu, kích thước lớn nhỏ khác nhau. Sự khác khác biệt về hình dáng và kích thước tùy thuộc theo mức độ sinh trưởng của tế bào. Về hình thái, tế bào có thành trong suốt, quan sát dưới kính hiển vi quang học có thể thấy được sắc tố diệp lục (hình 4.1). Quan sát kỹ hơn sẽ thấy không phải toàn bộ tế bào đều được bao phủ bởi sắc tố diệp lục, mà xen kẽ có những đốm nhỏ trong suốt li ti với kích cỡ khác nhau. Theo Silverberg (1976), lipid vi tảo tồn tại ở dạng các giọt có kích thước khoảng 30 nm trong tế bào chất [47]. Cho nên các đốm li ti này có khả năng là những giọt lipid được vi tảo dự trữ trong tế bào chất xen kẽ với các cơ quan dự trữ diệp lục, và kích thước các đốm lớn hay nhỏ là do mật độ các giọt lipid tập trung ít hay nhiều.
Hình 4.1. Tế bào N. oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 2
Hình 4.2. Hình thái N. oculata dưới vật kính ×100 ở ngày nuôi cấy thứ 11 Sau 2 ngày cấy giống, mật độ tế bào còn thưa thớt nên có thể quan sát thấy vi tảo tồn tại thành từng tế bào riêng lẻ như hình 4.1. Tuy nhiên, càng về sau thì mật độ tế bào càng cao nên các tế bào vi tảo có xu hướng kết dính với nhau thành từng cụm. Sau 11 ngày nuôi cấy, quan sát thấy có những cụm tế bào hình thành như trong hình 4.2. Việc các tế bào kết dính lại với nhau có thể được gây ra bởi các yếu tố như thành phần môi trường, hoặc là do sự tương tác giữa các thành phần điện tích trên màng tế bào. Trong đó yếu tố thành phần môi trường được cho là gây ra ảnh hưởng nhiều hơn cả. Theo Grima và các cộng sự (2003), các ion kim loại đa hóa trị như sắt, nhôm là những
Chương 4: Kết quả và bàn luận
42
tác nhân gây keo tụ có khả năng kết dính các chất lơ lửng trong môi trường [24]. Một số nghiên cứu sử dụng phèn để kết lắng vi tảo Scenedesmus và Chlorella của Golueke & Oswald (1965), hoặc nghiên cứu sử dụng FeCl3 với nồng độ 18 mg/l để kết lắng vi tảo Nannochloropsis oculata của Dinh [17, 23]. Do đó, muối sắt FeCl3 tồn tại trong dung dịch do bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường với nồng độ 1.8 mg/l như mục 3.1.2 đã đề cập là nguyên nhân gây ra hiện tượng các tế bào kết dính với nhau khi mật độ tăng cao.
Hiện tượng các tế bào kết dính lại với nhau rất có ý nghĩa trong quá trình thu hoạch sinh khối. Bởi vì khi kết dính với nhau thì sinh khối sẽ dễ dàng kết lắng hơn. Nhờ vậy, khi thu hoạch chỉ cần ngừng sục khí vài giờ để tạo điều kiện cho sinh khối kết lắng, loại bỏ phần dịch nổi và ly tâm phần dịch tảo cô đặc còn lại giúp giảm chi phí năng lượng hơn rất nhiều so với việc ly tâm toàn bộ phần dịch vi tảo ban đầu. Dựa vào tính chất kết lắng này, có thể nâng cao hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo bằng cách bổ sung các tác nhân keo tụ trong trường hợp không cần độ tinh sạch của sinh khối, vì khi kết lắng thì các hợp chất keo tạo thành bám vào và lắng theo sinh khối.
4.2. Các vấn đề khi thu hoạch sinh khối
Khi nuôi cấy trên môi trường F/2 cải tiến, vi tảo N. oculata có đồ thị sinh khối khô theo thời gian được biểu diễn ở hình 4.3.
Hình 4.3. Đồ thị sự phát triển sinh khối N. oculata theo thời gian 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 S inh khối khô (g/L)
Chương 4: Kết quả và bàn luận
43
Kết quả cho thấy trong môi trường F/2 cải tiến có nồng độ muối 40 g/l, vi tảo phát triển nhanh trong 9 ngày đầu nuôi cấy và chậm lại sau đó. Điều này được giải thích là do trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, hàm lượng chất dinh dưỡng dồi dào, kết hợp với chiếu sáng và sục khí liên tục nên vi tảo sinh trưởng rất mạnh. Lượng