Giống Nannochloropsis oculata có nguồn gốc Việt Nam, lấy từ Ngân hàng giống thuộc Đại học quốc gia Hà Nội.
Giống được trữ trong môi trường F/2 ở điều kiện 4 0C, cấy chuyền sau mỗi 8 tuần.
3.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy
Quá trình nuôi vi tảo để thu nhận sinh khối sử dụng môi trường F/2 cải tiến, được pha từ các dung dịch khoáng và vitamin trữ sẵn với nồng độ và liều lượng như sau:
NaNO3 (75.0 g/L dH2O) 1.0 ml
NaH2PO4·H2O (5.0 g/L dH2O) 1.0 ml
Dung dịch F/2 Trace metal 1.0 ml
Dung dịch F/2 vitamin 0.5 m
Dung dịch muối (40g muối hột/L) đến 1.0 L Thành phần dung dịch F/2 Trace metal:
FeCl3·6H2O 3.15 g Na2EDTA·2H2O 4.36 g CuSO4·5H2O (9.8 g/L dH2O) 1.0 ml Na2MoO4·2H2O (6.3 g/L dH2O) 1.0 ml ZnSO4·7H2O (22.0 g/L dH2O) 1.0 ml CoCl2·6H2O (10.0 g/L dH2O) 1.0 ml MnCl2·4H2O (180.0 g/L dH2O) 1.0 ml Nước cất đến 1.0 L
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
30
Dung dịch vitamin F/2 được tiệt trùng bằng màng vi lọc có kích thước mao quản 0.2µm. Thành phần môi trường như sau:
Vitamin B12 (1.0 g/L dH2O) 1.0 ml Biotin (0.1 g/L dH2O) 10.0 ml Thiamine HCl 200.0 mg
Nước cất đến 1.0 L
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ tổng quát hình 3.1. Giống
Nannochloropsis oculata
Nhân giống
Nuôi trồng thu sinh khối
Ly tâm
Sấy tiếp xúc
Trích ly lipid
Lipid thô Lập đường cong sinh trưởng
Khảo sát hình thái
Thời điểm thu sinh khối
Quy mô bình 500 mL Quy mô bình 5 L T = 60 0C t = 10-15 giờ T = 5 0C t = 5 phút
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
31
3.2.1. Khảo sát hình thái
Tiến hành quan sát thường xuyên để xác định được trạng thái của dịch tảo trong quá trình nuôi cấy.
Cách thực hiện: dùng pipet tiệt trùng hút dịch tảo cho lên lame quan sát dưới kính hiển vi quang học (vật kính ×100).
3.2.2. Nhân giống
Pha môi trường nhân giống bao gồm các thành phần dung dịch NaNO3, NaH2PO4·H2O, dung dịch khoáng Trace Metal với lượng như trên. Đặc biệt môi trường nhân giống có bổ sung thêm muối NaHCO3 với liều lượng 0.4 g/L.
Hấp tiệt trùng dung dịch muối khoáng ở 121 0C trong 15 phút. Sau khi hấp tiệt trùng, cho thêm dung dịch vitamin F/2.
Tỉ lệ giống cho vào quá trình nuôi cấy chính: 10% v/v. Thời gian nhân giống là 9-11 ngày.
3.2.3. Hệ thống nuôi cấy
Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa PET (bình nước uống Aquafina) thể tích 5 lít (14 × 14 ×25 cm3) đã được bóc bỏ nhãn, đặt thẳng đứng như hình 3.2.
Hình 3.2. Hệ thống nuôi vi tảo quy mô bình 5 lít
Sử dụng máy nén khí của hãng Resun – Trung Quốc model ACO-012 (hình 3.3a) để sục khí. Lưu lượng khí được điều chỉnh bằng lưu lượng kế F85-15333 của
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
32
hãng Tokyo Keiso – Nhật Bản (hình 3.3b). Lưu lượng khí cung cấp vào bình nuôi được điều chỉnh lại sau mỗi lần lấy mẫu sao cho đảm bảo tốc độ sục khí là 1 vvm.
(a) (b)
Hình 3.3. Thiết bị hỗ trợ sục khí
Chiếu sáng các bình nuôi theo hướng từ trên xuống bằng 8 đèn huỳnh quang 1,2 m của hãng Philip (công suất tiêu thụ mỗi đèn là 36 W). Các mặt bên của hệ thống nuôi cấy có đặt giấy phản quang để cải thiện cường độ chiếu sáng. Khoảng cách từ đèn đến mặt trên của bình nuôi là 40 cm, cường độ ánh sáng đo được trên bề mặt bình là 4500-6500 lux bằng thiết bị đo cường độ ánh sáng Light meter – Model 840022 của hãng Sper Scientific Ltd.
3.2.4. Thiết bị phân tích
Bơm hút chân không và phễu lọc. Máy ly tâm.
Tủ sấy. Tủ hút ẩm. Cân phân tích.
3.2.5. Thu hoạch và định lƣợng sinh khối
Thu hoạch và định lượng sinh khối khô phục vụ cho lập đường cong sinh trưởng của vi tảo theo thời gian:
- Lọc 2 lít huyền phù chứa sinh khối vi tảo bằng phễu lọc chân không, sử dụng 2 lớp giấy lọc để đảm bảo lọc được tất cả sinh khối. Giấy lọc đã được sấy đến khối lượng không đổi mo trước đó ở 60oC.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
33
- Sau khi lọc, sinh khối được sấy ở 60oC trong khoảng 10-15 giờ sao cho đạt khối lượng không đổi. Sau đó, mẫu được đặt trong bình hút ẩm 2 giờ rồi đem cân khối lượng khô m1 bằng cân phân tích.
- Sinh khối khô được tính theo công thức:
SKK= (m1 – mo)/2 (g/l)
Thu hoạch sinh khối phục vụ cho giai đoạn trích ly lipid thô:
- Các bình sinh khối vi tảo đến ngày thu hoạch được để cho lắng tự nhiên mà không sục khí để có thể tháo bỏ phần nước phía trên.
- Phần dịch sinh khối lắng dưới đáy bình được đem ly tâm trong ống ly tâm PE 50 ml với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ lớp nước bên trên ống ly tâm, phần sinh khối lắng phía dưới được sấy ở 60 0
C trong khoảng 10-15 h đến khối lượng không đổi.
- Nghiền sinh khối khô thành dạng bột bằng cối và chày sứ. Chia thành từng mẫu khối lượng 1 g trữ trong chai thủy tinh 100 ml phục vụ cho quá trình trích ly sau này.
3.2.6. Các phƣơng pháp trích ly lipid đƣợc sử dụng
Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hai phương pháp trích ly lipid thô từ vi tảo Nannochloropsis oculata. Đó là: phương pháp trích ly kết hợp với xử lý sóng siêu âm và trích ly kết hợp với xử lý vi sóng.
3.2.6.1. Trích ly có xử lý với sóng siêu âm
Trích ly có xử lý với sóng siêu âm được tiến hành với thiết bị Sonic & Materials, model VCX 500 (Nhật Bản), tần số 20 kHz, công suất có thể điều chỉnh từ 100 W đến 500 W. Quy trình trích ly được tiến hành như hình 3.4.
Mỗi 1 g mẫu được ngâm vào một lượng dung môi xác định trong bình thủy tinh 100 ml. Trong nghiên cứu này, ta tiến hành với hai loại dung môi đó là: n- hexane và hỗn hợp chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v). Trong đó nước chỉ được cho vào hỗn hợp trích ly khi đã xử lý mẫu xong.
Lắc đều hỗn hợp rồi đem đi xử lý trong thiết bị tạo sóng siêu âm. Lắp đặt hệ thống như hình 3.5. Điều chỉnh công suất của thiết bị ở mức 100 W để tạo ra sóng âm có biên độ áp suất trong khoảng 1-5 bar. Thiết bị tạo ra sóng âm theo chu kỳ, sau mỗi 5 giây hoạt động thì lại ngừng 5 giây sao cho tổng thời gian xử lý đạt yêu cầu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
34 Ngâm Sinh khối khô
Dung môi t=30 phút
Xử lý sóng siêu âm
Lọc pha chứa lipid
Bã 100 W Sấy T=60-70 0C Lipid thô Ngâm On 5 giây : Off 5 giây
Thời gian tùy vào nghiệm thức
Hình 3.4. Quy trình trích ly lipid có xử lý với sóng siêu âm
Ngâm cho thời gian tiếp xúc pha đạt yêu cầu của các thí nghiệm khảo sát sau khi đã xử lý xong.
Loại bỏ bã sinh khối:
o Đối với dung môi hexane: chỉ cần lọc hỗn hợp để thu dịch chiết.
o Đối với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol – nước: để yên cho tách pha thành hai lớp. Sau đó, loại bỏ pha phân cực phía trên, pha còn lại chứa chủ yếu là chloroform và lipid cùng với bã sinh khối được đem lọc để thu dịch chiết.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
35
Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị xử lý sóng siêu âm
(1) Đầu dò; (2) Bình thủy tinh có hệ thống giải nhiệt; (3) Bệ đỡ; (4 và 5) lần lượt là cửa vào và ra của nước giải nhiệt;
(6) Cửa tháo liệu; (7) Bộ xử lý và hiển thị.
Sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C cho đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn (khối lượng bình khôi đổi). Lipid thô được định lượng bằng cân phân tích.
Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức sau: lipid thô
SKK
% Lipid thô = m 100
m
Trong đó: mlipid thô – khối lượng lipid thu được sau khi sấy (g)
mSKK – khối lượng sinh khối khô đem trích ly (g)
3.2.6.2. Trích ly có xử lý với lò vi sóng
Trích ly kết hợp với xử lý lò vi sóng được tiến hành với lò vi sóng gia dụng Sharp model R-218H(S) (Nhật Bản) có công suất điều chỉnh được trong phạm vi 100 W đến 900 W. Quy trình trích ly như hình 3.6.
Mỗi 1 g mẫu được ngâm vào một lượng dung môi xác định trong bình thủy tinh 100 ml được bịt kín. Trong nghiên cứu này, tiến hành với hai loại dung môi đó là: n-hexane và hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v). Trong đó nước chỉ được cho vào hỗn hợp trích ly khi đã xử lý mẫu xong.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
36 Ngâm Sinh khối khô
Dung môi t=30 phút
Xử lý vi sóng
Lắc đều, để nguội
Lọc pha chứa lipid
Lặp cho tổng thời gian xử lý đạt yêu cầu Bã 900 W, 20 giây Sấy T=60-70 0C Lipid thô Ngâm Thời gian tùy vào
nghiệm thức
Hình 3.6. Quy trình trích ly lipid có xử lý với lò vi sóng
Lắc đều hỗn hợp rồi cho bình thủy tinh vào lò vi sóng xử lý với thời gian xác định ở công suất 900 W. Lưu ý, sau mỗi 20 giây lấy bình thủy tinh ra lắc đều, giải nhiệt cho đến khi nguội hẳn rồi mới đem xử lý tiếp. Thí nghiệm được lặp lại cho đến khi tổng thời gian xử lý mẫu trong lò vi sóng đạt yêu cầu.
Ngâm mẫu sau xử lý trong thời gian 24 h. Loại bỏ bã sinh khối:
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
37
o Đối với dung môi hexane: chỉ cần đen hỗn hợp lọc để thu dịch chiết.
o Đối với hỗn hợp dung môi chloroform – methanol – nước (3:1:1 v/v/v): để yên cho tách pha thành hai lớp. Sau đó, loại bỏ pha phân cực phía trên, pha còn lại chứa chủ yếu là chloroform và lipid cùng với bã sinh khối được đem lọc để thu dịch chiết.
Sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C cho đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn (khối lượng bình không đổi). Lipid thô được định lượng bằng cân phân tích.
Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức sau: lipid thô
SKK
% Lipid thô = m 100
m
Trong đó: mlipid thô – khối lượng lipid thu được sau khi sấy (g)
mSKK – khối lượng sinh khối khô đem trích ly (g)
3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết lipid
Quá trình thí nghiệm nhằm mục đích tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly lipid từ sinh khối vi tảo N. oculata trong trường hợp sử dụng dung môi
n-henane và trong trường hợp sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform-methanol-nước. Trong đó các yếu tố được khảo sát khi sử dụng mỗi loại dung môi khác nhau gồm:
- Phương pháp xử lý. - Thời gian xử lý. - Thể tích dung môi. - Thời gian tiếp xúc pha.
Do đó, tiến hành thí nghiệm khảo sát các yếu tố trên theo trình tự được mô tả ở sơ đồ trong hình 3.7.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
38
Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến từng phương pháp xử lý
Chọn phương pháp xử lý và thời gian xử lý tối ưu đối với từng loại dung môi
Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thể tích
Chọn ra thể tích tối ưu
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc pha
Chọn ra thời gian ngâm thích hợp
Kết thúc quá trình khảo sát
Hình 3.7. Quy trình thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly lipid Dựa trên các thông số trích ly lipid từ vi tảo Scenedesmus sp., một loài tảo nước ngọt có hàm lượng lipid từ 6-10% do Ranjan, Patil & Moholkar 2010 đề nghị [39]. Tiến hành chọn lại các điều kiện ban đầu để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình trích ly lipid từ vi tảo N. oculata như sau:
- Đối với trường hợp sử dụng dung môi n-hexane:
o Thể tích thể tích dung môi sử dụng là 30 ml cho 1 g sinh khối khô.
o Thời gian xử lý với sóng siêu âm là 10 phút với công suất thiết bị là 100W. Đối với trường hợp vi sóng là 10 phút, 900 W.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
39
o Thời gian tiếp xúc pha sau khi xử lý là 24 giờ, có lắc đảo với tốc độ 150 vòng/phút.
- Đối với trường hợp sử dụng hỗn hợp chloroform-methanol-nước:
o Tỷ lệ thể tích chloroform:methanol:nước = 3:1:1, trong đó nước chỉ được cho vào sau khi đã tiến hành xử lý xong. Tổng thể tích hỗn hợp chloroform và methanol là 40 ml.
o Tổng thể tích hỗn hợp chloroform + methanol được sử dụng là 40 ml.
o Thời gian xử lý với sóng siêu âm là 10 phút với công suất thiết bị 100W. Đối với trường hợp vi sóng là 10 phút, 900W.
o Thời gian tiếp xúc pha sau khi xử lý là 24 giờ, có lắc đảo với tốc độ 150 vòng/phút.
Từ các quy trình cơ bản, tiến hành thay đổi các giá trị để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình chiết lipid thô từ vi tảo N. oculata bằng các thí nghiệm sau.
3.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu.
Tiến hành lắc các mẫu sinh khối khô khối lượng 1 g với dung môi trong 30 phút. Sau đó, xử lý trong thời gian lần lượt là 5, 10, 15, 20 phút theo quy trình ở hình 3.4 đối với phương pháp sóng siêu âm và theo quy trình ở hình 3.6 đối với phương pháp vi sóng. Các mẫu đối chứng không cần xử lý, chỉ cần ngâm trong hỗn hợp dung môi 24 giờ rồi đem lọc tách bã, bốc hơi dung môi đến khi khối lượng không thay đổi. Các thông số khác như thể tích dung môi, thời gian tiếp xúc pha được giữ cố định như đã đề cập ở mục 3.3 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý.
Đối với từng loại dung môi, chọn ra phương pháp xử lý với thời gian thích hợp. Cố định các yếu tố này để tiến hành khảo sát tiếp các yếu tố khác về sau.
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích dung môi.
Tiến hành lắc các mẫu sinh khối khô khối lượng 1 g với dung môi trong 30 phút trước khi xử lý:
- Thí nghiệm với n-hexane, thay đổi thể tích dung môi khảo sát ở các mức 10, 15, 20, 25, 30 ml.
- Thí nghiệm với hỗn hợp có tỷ lệ thể tích chloroform:methanol:nước = 3:1:1, tổng thể tích chloroform và methanol để khảo sát ở các mức 15, 20, 25, 30, 40 ml.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
40
Các yếu tố khác như phương pháp xử lý và thời gian xử lý cho từng loại dung môi được chọn ra sau loạt thí nghiệm ở mục 3.3.1.
3.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tiếp xúc pha.
Với phương pháp xử lý và thời gian xử lý mẫu thích hợp được chọn ở mục 3.3.1, thể tích dung môi thích hợp được chọn ở mục 3.3.2, ta tiến hành khảo sát lượng lipid thô thu được sau quá trình xử lý với thời gian ngâm lần lượt là 1, 5, 10, 15, 20, 24 giờ. Các mẫu đối chứng sau khi xử lý xong thì loại bã sinh khối ngay rồi đem sấy cho bay hơi dung môi. Cân và tính toán lượng lipid thô như đã mô tả trong mục 3.2.6.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
41
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Hình thái vi tảo Nannochloropsis oculata
Quan sát hình thái vi tảo N. oculata trên kính hiển vi, ta thấy vi tảo tồn tại ở dạng từng tế bào riêng rẽ hình cầu, kích thước lớn nhỏ khác nhau. Sự khác khác biệt về hình dáng và kích thước tùy thuộc theo mức độ sinh trưởng của tế bào. Về hình thái, tế bào có thành trong suốt, quan sát dưới kính hiển vi quang học có thể thấy được sắc tố diệp lục (hình 4.1). Quan sát kỹ hơn sẽ thấy không phải toàn bộ tế bào đều được bao phủ bởi sắc tố diệp lục, mà xen kẽ có những đốm nhỏ trong suốt li ti với kích cỡ khác nhau. Theo Silverberg (1976), lipid vi tảo tồn tại ở dạng các giọt có kích thước khoảng 30 nm trong tế bào chất [47]. Cho nên các đốm li ti này có khả năng là những giọt