Khi nuôi cấy trên môi trường F/2 cải tiến, vi tảo N. oculata có đồ thị sinh khối khô theo thời gian được biểu diễn ở hình 4.3.
Hình 4.3. Đồ thị sự phát triển sinh khối N. oculata theo thời gian 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 S inh khối khô (g/L)
Chương 4: Kết quả và bàn luận
43
Kết quả cho thấy trong môi trường F/2 cải tiến có nồng độ muối 40 g/l, vi tảo phát triển nhanh trong 9 ngày đầu nuôi cấy và chậm lại sau đó. Điều này được giải thích là do trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, hàm lượng chất dinh dưỡng dồi dào, kết hợp với chiếu sáng và sục khí liên tục nên vi tảo sinh trưởng rất mạnh. Lượng sinh khối tăng lên 9 lần so với ban đầu. Đến ngày thứ 11, sinh khối gần như không tăng thêm nữa do nguồn nitơ dần cạn kiệt và đạt giá trị là 0.2372 g/L.
Trong một nghiên cứu do Chiu và các cộng sự (2009) thực hiện trên vi tảo N. oculata NCTU-3, hàm lượng lipid và hàm lượng nitơ được xác định ở các pha logarith, giai đoạn đầu của pha cân bằng, và pha cân bằng. Kết quả hàm lượng lipid thu được lần lượt là 30.8, 39.7 và 50.4% tính trên sinh khối khô. Hàm lượng nitơ cũng giảm dần khi vi tảo chuyển từ pha logarith sang pha cân bằng [14]. Điều này chứng tỏ rằng lipid tích lũy ngày càng nhiều và đạt giá trị cực đại tại pha cân bằng. Nguyên nhân là do trong pha logarith hầu hết lipid dược hình thành ở dạng các phân tử lipid màng góp phần xây dựng nên cấu trúc tế bào. Trái lại, triacylglycrol – lipid trung tính được tổng hợp chỉ với mục đích dự trữ năng lượng cho tế bào. Trong pha cân bằng, nguồn nitơ cạn kiệt nên quá trình sinh tổng hợp triacylglycrol diễn ra mạnh ở pha cân bằng để hạn chế tế bào vi tảo tổng hợp vật chất cho quá trình tăng sinh. Điều này có nghĩa là năng lượng thu được từ quá trình quang hợp ở giai đoạn này được tích trữ ở dạng triacylglycerol.
Dựa vào kết quả của Chiu và các cộng sự, có thể kết luận rằng khi vi tảo phát triển đến giai đoạn cân bằng là thời điểm tốt nhất để thu sinh khối trích ly lipid. Trên đồ thị sinh khối theo thời gian ở hình 4.3, sinh khối ở ngày nuôi thứ 9 đến ngày thứ 10 không chênh lệch đáng kể, đây là giai đoạn đầu của pha cân bằng. Do đó, có thể tiến hành thu hoạch ở ngày thứ 11 để có sinh khối khô nhiều nhất và hàm lượng lipid trong sinh khối khô lúc đó cũng là cao nhất.
Một vấn đề quan trọng trong khâu thu hoạch sinh khối đó là độ tinh sạch của sinh khối. Các thí nghiệm trích ly lipid cần độ tinh sạch của sinh khối cao nên không thể dùng phương pháp kết lắng bằng tác nhân keo tụ như đã nói ở mục 4.1. Về cơ bản, có hai phương pháp có thể sử dụng để thu được sinh khối có độ tinh sạch cao:
- Phương pháp lọc: dùng giấy lọc kết hợp với bơm hút chân không. Phương pháp này có nhược điểm là mất nhiều thời gian, tiêu tốn nhiều năng lượng để tạo áp lực chân không, sau một thời gian thì tốc độ lọc chậm dần do sinh khối làm tắc nghẽn các mao quản trong giấy lọc. Đặc biệt, khi sấy khô thì rất khó
Chương 4: Kết quả và bàn luận
44
khăn trong việc tách sinh khối ra khỏi giấy lọc dẫn đến khối lượng thất thoát rất lớn.
- Phương pháp ly tâm: lợi dụng hàm lượng khoáng có sẵn trong môi trường, có thể để cho dịch nuôi cấy kết lắng tự nhiên. Bằng cách loại bỏ phần dịch nổi rồi ly tâm phần dịch tảo cô đặc (hình 4.4) sẽ thu hồi được sinh khối với độ thất thoát ít hơn. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian tiến hành rất nhanh, nhưng chỉ có thể tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm vì tiêu tốn nhiều năng lượng.
Hình 4.4. Phễu chiết thu dịch tảo cô đặc
Hình 4.5. Sinh khối khô
Trong nghiên cứu này, ta chọn phương pháp thu sinh khối bằng cách thu dịch tảo cô đặc. Lý do là vì dùng giấy lọc thì sinh khối thường bị bám dính lên bề mặt nên thất thoát rất nhiều. Sau khi ly tâm và sấy khô, sinh khối được nghiền mịn bằng cối và chày như hình 4.5 để tăng cao hiệu suất cho quá trình trích ly về sau.
4.3. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu lên từng phƣơng pháp trích ly 4.3.1. Sử dụng dung môi n-hexane
Kết quả thí nghiệm xử lý sóng siêu âm và xử lý vi sóng các mẫu sinh khối khô trong dung môi n-hexane với thời gian xử lý thay đổi từ 5 phút đến 20 phút được thể hiện ở hình 4.6. Khối lượng sinh khối khô trong mỗi mẫu là 1 g.
Kết quả xử lý với sóng siêu âm: quan sát đồ thị thấy rằng khi xử lý mẫu với dung môi n-hexane, thời gian xử lý càng dài thì lượng lipid hòa tan vào dung môi càng nhiều. Khi xử lý đến 15 phút hàm lượng lipid thô đạt 6.56% sinh khối khô, và không tăng thêm đáng kể cho dù kéo dài thời gian xử lý thêm nữa.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
45
Như đã nói ở mục 2.4.2, tế bào vi tảo sau khi xử lý với sóng siêu âm bị phá vỡ thành nhiều mảnh do tác động của các ứng suất gây ra bởi các siêu bóng khí, và các mảnh tế bào bị teo tóp với các hình dạng khác nhau. Điều này chứng tỏ rằng lipid được chiết vào dung môi theo cả hai cơ chế là phá vỡ cấu trúc tế bào và khuếch tán lipid ra khỏi các thành phần tế bào.
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi n-hexane khi xử lý mẫu ở các thời gian khác nhau
Kết quả xử lý với vi sóng: khảo sát cho thấy rằng các mẫu được xử lý với vi sóng có hiệu suất trích ly cao hơn so với mẫu đối chứng (4.22%). Khi kéo dài thời gian xử lý đến 15 phút thì hiệu suất thu hồi lipid đạt 5.67%, tăng thời gian xử lý dài hơn nữa thì hiệu suất cũng không tăng lên đáng kể.
Hiệu suất tăng lên khi kết hợp xử lý với năng lượng vi sóng được giải thích dựa vào sự tăng tính thấm của dung môi vào tế bào. Bởi vì năng lượng vi sóng là dạng năng lượng điện từ nên có khả năng làm cho các phân tử có hằng số điện môi cao chuyển động hỗn độn sinh ra nhiệt và làm nóng cục bộ các điểm trong hỗn hợp. Trong trường hợp n-hexane, dung môi không phân cực có hằng số điện môi thấp thì tác nhân chuyển động nhiệt không phải là dung môi mà là các cơ chất phân cực khác. Nhiệt sinh ra từ các cơ chất này sẽ truyền sang dung môi làm cho dung môi nóng lên. Do vậy làm cho tính thấm của dung môi vào phân tử cơ chất tăng lên. Đồng thời, năng lượng vi sóng cũng làm đứt các liên kết hydro có trong cơ chất bằng cách làm thay đổi quỹ đạo chuyển động của các electron. Do đó, cấu trúc phân
4.22 5.57 6.03 6.56 6.67 4.22 4.92 5.06 5.67 5.82 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0 5 10 15 20 Hàm lƣợ ng lipid thô (% ) Thời gian xử lý (phút) Sóng siêu âm Vi sóng
Chương 4: Kết quả và bàn luận
46
tử tế bào bị lỏng lẻo tạo điều kiện cho dung môi dễ dàng thấm vào và hòa tan phân tử lipid ra ngoài.
So sánh hai phương pháp xử lý:
Trong trường hợp sử dụng dung môi n-hexane, xử lý với sóng siêu âm cho hiệu suất thu hồi lipid tối ưu là 6.56% khi xử lý 15 phút. Mặc khác, xử lý với vi sóng cho hiệu suất thu hồi lipid tối ưu là 5.67% khi xử lý 15 phút. So sánh hai trường hợp thấy rằng cùng thời gian xử lý thì phương pháp sử dụng sóng siêu âm có lợi hơn về mặt hiệu suất. Xét về mặt năng lượng thì phương pháp xử lý với sóng siêu âm cũng tiêu tốn năng lượng ít hơn: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sử dụng sóng siêu âm với công suất thiết bị 100 W trong 15 phút tiêu hao 90 kJ điện năng.
- Sử dụng vi sóng với công suất thiết bị 900 W trong 15 phút tiêu hao đến 810 kJ.
Sự chênh lệch về mặt hiệu suất trong trường hợp này được giải thích như sau: dung môi n-hexane là dung môi không phân cực có hằng số điện môi thấp là 1.9 (bảng 2.3). Do đó khi sử dụng vi sóng thì dung môi hầu như không tự thân nóng lên mà chủ yếu là do sự truyền nhiệt từ các thành phần khác. Chính do tính chất này mà hiệu suất khi sử dụng vi sóng không cao. Điển hình là lượng lipid chỉ tăng thêm 1.45 % khi so sánh với mẫu chuẩn. Mặt khác, khi xử lý với sóng siêu âm thì tế bào bị phá vỡ thành những mảnh nhỏ, lipid thoát ra ngoài bằng hai cơ chế là sự phá vỡ và sự khuếch tán như đã nói, lượng lipid tăng thêm 2.34%.
Kết luận: xét cả về hiệu suất và về mặt năng lượng thì phương phương pháp xử lý với sóng siêu âm tỏ ra có ưu thế hơn nhiều. Do đó ở các thí nghiệm khảo sát về sau ta chọn phương pháp xử lý với sóng siêu âm trong 15 phút khi dung môi là
n-hexane.
4.3.2. Sử dụng hỗn hợp chloroform-methanol-nƣớc
Kết quả xử lý sinh khối với hỗn hợp dung môi chloroform:methanol:nước (3:1:1 v/v/v) trong điều kiện sóng siêu âm và điều kiện vi sóng ở các thời gian khác nhau từ 5 đến 20 phút được biểu diễn ở hình 4.7. Khối lượng sinh khối khô trong mỗi mẫu là 1 g.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
47
Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn hàm lượng lipid thô thu được bằng dung môi chloroform- methanol-nước sau khi xử lý mẫu với các thời gian khác nhau
Kết quả xử lý với sóng siêu âm:
Qua đồ thị 4.7 ta thấy xử lý sinh khối với sóng siêu âm cho kết quả cao hơn từ 1.7 đến 2.2 lần so với mẫu đối chứng tương ứng với xử lý từ 5 phút đến 20 phút. Hàm lượng lipid thu được là 14.33% khi xử lý 15 phút, khi tăng thêm thời gian xử lý thì hàm lượng lipid tăng thêm không đáng kể. Sự gia tăng đột xuất hiệu quả trích ly so với mẫu đối chứng chính là do tác động cộng gộp của khả năng dung môi thấm tốt kết hợp với sự phá vỡ tế bào của sóng siêu âm.
- Methanol là hợp chất phân cực, có khả năng phá cấu trúc màng tế bào bằng cách phá liên kết nội phân tử của protein màng để làm thay đổi tính thấm của màng, thậm chí còn phá vỡ cấu trúc của màng. Nhờ đó hỗ trợ cho quá trình thấm của chloroform hòa tan lipid vào dung môi. Hay nói cách khác, tổ hợp dung môi có được tính chất mà dung môi riêng lẻ không có được. Cũng chính nguyên nhân này làm cho hiệu suất của quá trình trích ly cao hơn hẳn so với trường hợp sử dụng dung môi n-hexane. Tuy nhiên, nước được cho vào trong quá trình trích ly chỉ có tác dụng hòa tan các thành phần phân cực được giải phóng ra trong quá trình trích ly.
- Khi các tế bào bị phá vỡ bằng sóng siêu âm thì sự tiếp xúc pha giữa sinh khối với dung môi tăng lên rất nhiều. Điều này làm cho lipid giải phóng vào dung môi cũng nhiều hơn.
Kết quả xử lý với vi sóng: 6.58 11.30 12.88 14.33 14.45 6.58 9.71 14.93 14.92 15.14 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 5 10 15 20 Hàm lƣợng l ipid thô (% ) Thời gian xử lý (phút) Sóng siêu âm Vi sóng
Chương 4: Kết quả và bàn luận
48
Tương tự như trường hợp xử lý với sóng siêu âm, xử lý với vi sóng cũng cho ra kết quả rất cao, cao hơn từ 1.5 đến 2.3 lần so với mẫu đối chứng (6.58%) tương ứng với xử lý từ 5 phút đến 20 phút. Hàm lượng lipid đạt 14.67% khi xử lý 10 phút và không tăng thêm đáng kể cho dù có xử lý lâu hơn nữa. Hiệu quả trích ly cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng được giải thích là do tác động cộng gộp của tổ hợp dung môi và sự gia tăng mức độ truyền khối dưới tác động của vi sóng:
- Như đã nói, tổ hợp dung môi chloroform-methanol-nước có khả năng hòa tan màng tế bào, làm cho lipid thoát ra ngoài dễ dàng hơn.
- Năng lượng vi sóng làm cho một mặt bẻ gãy liên kết hydro bằng cách làm đảo chiều moment lưỡng cực của các phân tử. Nhờ vậy các phân tử được ion hóa chuyển động hỗn độn tạo ra kẽ hở làm tăng tính thấm của dung môi vào sinh khối. Trong trường hợp này, thành phần dung môi còn có methanol với hằng số điện môi cao (bảng 2.3), nên hỗn hợp dưới tác dụng của vi sóng sẽ nóng lên rất nhanh thúc đẩy quá trình truyền khối diễn ra nhanh hơn. Có thể dự đoán rằng, sự tác động của vi sóng là nguyên nhân chính gây ra sự gia tăng đột biến hàm lượng lipid, hàm lượng lipid tăng đột ngột từ 9.71% lên 14.93% khi tăng thời gian xử lý từ 5 phút lên 10 phút.
So sánh hai phương pháp xử lý:
Xử lý với vi sóng chỉ cần 10 phút để đạt giá trị 14.93%. Trong khi đó, xử lý với sóng siêu âm cần đến 15 phút để đạt giá trị 14.33%. Từ đó cho thấy rằng tốc độ của quá trình chiết lipid với vi sóng cao hơn so với quá trình chiết với sóng siêu âm. Điểm mấu chốt có thể lý giải cho hiện tượng này chính là việc dùng tổ hợp dung môi chloroform + methanol. Hỗn hợp dung môi này có thể hòa tan màng làm lộ các cấu trúc bên trong tế bào ra, kết quả là tế bào bị phá hủy thành những phần nhỏ. Như đã trình bày trong hình 2.12c, quan sát một loại tế bào vi tảo được trích ly bằng phương pháp Bligh & Dyer (sử dụng hỗn hợp chloroform + methanol) cho thấy sinh khối bị phá hủy thành từng mảnh nhỏ có hình dạng teo tóp. Do đó, khi kết hợp thêm sự phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm thì dường như mức độ phá vỡ không được cải thiện rõ rệt.
Xét về mặt hiệu suất thu hồi lipid thì xử lý với vi sóng có hiệu quả cao hơn 0.6%. Tuy nhiên, nếu xét về mặt năng lượng thì phương pháp sóng siêu âm có lợi hơn:
Chương 4: Kết quả và bàn luận
49
- Xử lý vi sóng 10 phút với công suất thiết bị 900 W cần 540 kJ điện năng. Do mục đích của thí nghiệm khảo sát là tìm ra phương pháp có hiệu quả nhất đối với một loại dung môi cụ thể phục vụ cho định lượng. Cho nên mặc dù phương pháp sóng siêu âm tiêu tốn năng lượng ít hơn nhưng ta vẫn chọn phương pháp xử lý với vi sóng trong trường hợp này. Lý do là hiệu suất thu được lipid cao hơn thích hợp cho việc khảo sát hàm lượng lipid trong các nghiên cứu về sau. Hơn nữa, theo một số nghiên cứu thì phương pháp xử lý với vi sóng có những ưu điểm, đó là:
- Tiêu tốn dung môi ít, thời gian cần cho quá trình xử lý ngắn [21]. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu sau này, đặc biệt là những nghiên cứu chịu ảnh hưởng nhiều bởi hàm lượng lipid trích ly được.
- Thất thoát dung môi ra môi trường ít. Vì tiến hành thí nghiệm bằng cách hạ nhiệt độ bình bít kín sau mỗi lần đun nóng, hoặc sử dụng hệ thống sinh hàn [35].
Kết luận: sau khi cân nhắc ưu và nhược điểm của từng phương pháp thì phương pháp xử lý với vi sóng trong thời gian 10 phút được chọn để tiến hành các khảo sát về sau khi sử dụng hỗn hợp dung môi chloroform-methanol-nước.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});