áp dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hóa học phổ thông

Cũng trong năm 1941 sắc ký phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các cấu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN MẠNH CƯỜNG

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀO GIẢNG DẠY HOÁ HỌC PHỔ THÔNG

Chuyên ngành: Hoá phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS ĐÀO HỮU VINH

HÀ NÔI – 2011

1.4.2 Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu 18

1.7.1 Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl) 24

1.8.1 Sơ lược về muối sắt(III) và ion Fe3+ 29

1.8.2 Sơ lược về muối đồng(II) và ion Cu2+

31 1.8.3 Sơ lược về muối coban(II) và ion Co2+

32 1.8.4 Sơ lược về muối niken(II) và ion Ni2+

33 1.8.5 Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các ion Fe3+

,

Trang

a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi ete dầu

b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

c) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi

d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi

e) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi

f) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi

e) Pha tĩnh là silicagel, pha động dung dịch axit axetic 49

Trang

a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi

b) Bản mỏng sắc ký tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung

3.2.2 Tách các ion kim loại Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+ 54

a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi

a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 59 b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 61

c) Giấy sắc ký là loại 3S, hệ dung môi toluen - cồn etylic

MỞ ĐẦU

1/Lý do chọn đề tài

Sắc ký được ra đời từ năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến nay sắc ký đã phát triển mạnh mẽ trở thành môn học quan trọng của hoá phân tích hiện đại và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

Nhờ có khả năng tách riêng rẽ các chất cho kết quả phân tích định tính hoặc định lượng đều rõ ràng Sắc ký tham gia vào phân tích các mẫu phức tạp trong các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục

vụ đời sống như chữa bệnh, điều tra hình sự Ngoài ra sắc ký còn là công cụ phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học

Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, sắc ký góp phần tách và định lượng các chất dinh dưỡng trong sản phẩm, phân tích các độc tố, như các hóa chất bảo

vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống…

Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân tích thuốc kháng sinh, phân tích các dược phẩm, dược liệu…

Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác động của môi trường tới đời sống con người Thí dụ tách và định lượng hàm lượng các chất độc hại trong không khí

Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức về sắc ký là rất cần thiết, tuy nhiên chương trình môn Hoá Học ở bậc học phổ thông của nước ta hiện nay chưa có phần nào nói về sắc ký Có lẽ khó khăn là các thí nghiệm thực hành về sắc ký thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ hiện đại đắt tiền, thời gian làm thí nghiệm lâu có trường hợp diễn ra trong thời gian dài, nhiều hoá chất khó kiếm đắt tiền không phù hợp với trường THPT

Với mong muốn có thể đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hoá Học phổ thông ở nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, đã

trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn “Áp dụng phương pháp sắc ký cột

và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông”

được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và ứng dụng của sắc ký

3/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Kiến thức về sắc ký là khá rộng, nhưng do mục tiêu đã nêu trên hơn nữa thời gian nghiên cứu và khả năng của bản thân có hạn, nên tôi chỉ tập trung nghiên cứu khảo sát việc thay đổi các hoá chất dụng cụ để thực hiện thí nghiệm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy ở mức tách định tính các chất màu trong lá xanh (chlorophyl, carotenoit), một số ion kim loại thông dụng có màu đặc trưng (Fe3+

, Cu2+, Co2+, Ni2+)

4/ Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu các tài liệu về cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, tài liệu hướng dẫn thực hành sắc ký

Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy; nghiên cứu sự thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích để tìm ra những thí nghiệm phù hợp với mục đích đã nêu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19]

Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá cây Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có màu

Tuy nhiên phát minh của Tsvet gần như bị lãng quên trong một thời gian dài Mãi tới năm 1931 sau khi Vinterstin và Lederer dùng phương pháp của Tsvet tách caroten thô thành và  caroten và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương diện điều chế, phương pháp sắc ký mới bắt đầu được chú ý đúng mức và phát triển nhanh chóng Đặc biệt trong những năm 30 của thế kỷ

XX, nhu cầu về phân tích và tách hỗn hợp các chất trở nên rất cấp thiết nên sắc

ký phát triển nhanh chóng Năm 1938 Izmailov và Shraiber đặt nền móng đầu tiên cho sắc ký lớp mỏng và sau đó những công trình của Stahl đã làm cho sắc

ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi Năm 1941 Tiselius phát triền các kỹ thuật tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải Cũng trong năm 1941 sắc ký phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo

ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn Các tác giả trên đã phát triển một dạng mới của sắc ký phân bố: sắc ký giấy Do có công đóng góp các tác giả đã nhận giải Nobel năm 1952 Vào năm 1941 – 1942, Martin đã làm một bước ngoặt lớn trong sắc ký do dùng sắc ký giấy tách thành công các ancaloit chiết được từ các cây thuốc Năm 1952, Martin công bố công trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên

sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí Vào những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao hiệu quả của phương pháp, các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến,

từ đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố đất hiếm), các ancaloit, các hiđrocacbon trong các mẫu dầu…Ngày nay trong sắc ký lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7m, có khả năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả (Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) có thể tách nhanh các hợp chất khó trong thời gian vài chục giây Ngoài ra phương pháp siêu tới hạn

(Supercritical fluid chromatography – SFC) cũng được phát triển để phù hợp với các chất có khối lượng phân tử lớn Vào cuối thể kỷ trước, một phương pháp tách mới được đời là các phương pháp điện di, đặc biệt là điện di mao quản Phương pháp có hiệu lực tách rất cao, nhanh, có thể tách được nhiều các đối tượng vô cơ và hữu cơ Năm 1994, những máy điện di mao quản đầu tiên được bán trên thị trường, được sử dụng rất có hiệu quả để phân tích các dược phẩm, các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu cực kỳ khó như protein, enzim…

Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động)

1.2 Định nghĩa, nguyên tắc và phân loại các phương pháp sắc ký [10, 15]

1.2.1 Định nghĩa

Tính đa dạng muôn màu của phương pháp sắc ký đã làm nảy sinh nhiều định nghĩa, nhiều tên gọi trong lĩnh vực sắc ký Nhưng định nghĩa được nhiều nhà hoá học thừa nhận là hoàn chỉnh nhất, tổng quan nhất như sau:

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh

- Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động

1.2.2 Nguyên tắc của sắc ký

Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh(stationary phase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase) Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định

1.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

1.2.3.1 Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh

- Theo cách phân loại này tất cả các phương pháp sắc ký được phân thành hai nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng và sắc ký khí Đây là cách phân loại lôgic nhất và được sử dụng rộng rãi

- Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng (được mang trên chất rắn)

1.2.3.2 Phân loại theo cơ chế của quá trình tách

Phương pháp phân loại này dựa trên cơ chế của quá trình hấp thụ - giải hấp thụ, nghĩa là theo tương tác của chất được sắc ký với pha động Có bốn cơ chế sắc ký chính sau đây

tế số đó bị hạn chế rất lớn Như chúng ta đã biết qui tắc về độ tan “các chất giống nhau hoà tan vào nhau”, do đó độ phân cực của các chất được sắc ký cũng như của các pha tĩnh và pha động có ảnh hưởng tới quá trình tách

C Sắc ký trao đổi ion

Sự tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh Chất rắn quan trọng nhất trong trường hợp này là các nhựa trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion chủ yếu dùng trong dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước - dung môi hữu cơ trong môi trường có độ điện môi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền

D Sắc ký rây phân tử

Trong phương pháp này người ta sử dụng các vật liệu rắn có độ xốp lớn Có các

lỗ với kích thước nhất định để rây chọn lọc các cấu tử tuỳ theo kích thước và hình dạng phân tử Các zeolit tổng hợp có giá trị rất lớn trong sắc ký rây các chất khí Có thể dùng các hợp chất vô cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách các chất

vô cơ và hữu cơ; đặc biệt nhóm polime ưa nước (loại dextran mạng) được dùng

có một phần trao đổi ion (hấp phụ hoá học, tạo phức) hoặc cơ chế phân bố

1.2.3.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ

Cơ sở của phương pháp phân loại này dựa trên cách chuyển dịch tương đối của pha động so với pha tĩnh Có thể khai triển sắc đồ theo ba phương pháp: tiền lưu,

đẩy và rửa giải Phương pháp rửa giải quan trọng và phổ biến nhất, sau đó là phương pháp đẩy, còn phương pháp tiền lưu ít được sử dụng

A Phương pháp tiền lưu

Theo phương pháp này, người ta cho hỗn hợp chất phân tích, ví dụ, dung môi chứa các cấu tử A, B liên tục đi vào lớp đầu tiên của pha tĩnh (đầu cột) và di chuyển tới lớp cuối cùng của pha tĩnh (cuối cột) Nếu chất B bị hấp thụ mạnh hơn chất A thì tuyến dung môi phía trước sẽ nghèo cấu tử B hơn và kết quả là dung môi đi ra khỏi cột chứa cấu tử A nguyên chất Cấu tử B sẽ không bị hấp thụ ở những lớp chất hấp thụ đã bão hoà cấu tử B và chuyển động dọc cột cùng với cấu tử A Cuối cùng dung môi chứa hỗn hợp A, B đi ra khỏi cột Như vậy phương pháp này cho phép thu được một lượng nào đó A nguyên chất

B Phương pháp đẩy

Nguyên tắc của phương pháp này là đưa một mẫu tương đối nhỏ hỗn hợp chất phân tích chứa các cấu tử A, B lên lớp đầu của pha tĩnh (lúc này xảy ra quá trình tiền lưu nhưng rất ít) Sau đó cho dung môi chứa chất E (pha động) đi qua Điều kiện quan trọng là chất E bị hấp thụ mạnh hơn A, B Do đó E đẩy các cấu tử A,

B chuyển động xuống phía dưới Vì B bị giữ mạnh hơn A cho nên B lại đẩy A

về phía trước Kết quả ta được các vùng A nguyên chất, B nguyên chất và pha động chứa E nguyên chất

Hình 1.1 Phương pháp đẩy Như vậy, khác với phương pháp tiền lưu, nhờ phương pháp đẩy ta có thể thu được các phân đoạn chứa từng cấu tử nguyên chất

C Phương pháp rửa giải

Trước hết đưa các mẫu nhỏ gồm hỗn hợp các cấu tử A, B vào lớp đầu tiên của pha tĩnh Giả sử B bị hấp thụ mạnh hơn A Sau đó cho pha động chứa cấu tử E

đi qua cột Điều kiện quan trọng là cấu tử E bị hấp thụ yếu hơn cả Lúc đó pha động sẽ rửa A, B với tốc độ khác nhau tuỳ theo mức độ các cấu tử đó bị pha tĩnh giữ Vì A bị hấp thụ yếu hơn nên nó dịch chuyển nhanh hơn cùng với pha động

Đó là kết quả của sự chuyển dịch cân bằng hấp thụ-giải hấp thụ giữa các cấu tử

A, B, E Nếu tốc độ chuyển dịch của A, B đủ khác nhau, thì các vùng A, B chồng chập nhau lúc đầu dần dần được tách ra và cuối cùng tạo thành hai vùng riêng biệt và được ngăn cách bởi dung môi nguyên chất (chứa E) Vùng A chuyển dịch trước vùng B

Hình 1.2 Phương pháp rửa giải Nếu đường đẳng nhiệt hấp thụ là tuyến tính, thì đường cong biểu diễn sự biến thiên nồng độ các cấu tử có dạng hình chuông (phân bố Gauss) Nhược điểm của phương pháp này là dùng lượng lớn dung môi do đó nồng độ chất đi ra khỏi đầu cột rất loãng

1.2.3.4 Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ

Theo phương pháp phân loại này, tất cả các phương pháp sắc ký được chia thành hai nhóm: Sắc ký cột và sắc ký phẳng Trong sắc ký cột (kể cả sắc ký cột mao quản) quá trình tách hỗn hợp được thực hiện trên các cột hình tròn nạp các chất hấp thụ thích hợp Còn trong sắc ký phẳng sự hình thành sắc đồ được tiến hành trên các lớp phẳng chất hấp thụ (giấy hoặc lớp mỏng)

Cuối cùng cần nói rằng tuyệt đại đa số phương pháp sắc ký đều tiến hành theo lối động, nghĩa là một pha đứng im và một pha chuyển động; tuy nhiên có một

số trường hợp tách theo lối tĩnh nghĩa là cả hai pha đều đứng im tương đối và phải khuấy trộn mạnh để cân bằng hấp thụ - giải hấp thụ xảy ra nhanh Lý thuyết sắc ký không áp dụng cho lối tĩnh

Trong đó [As] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

[Am] là nồng độ chất phân tích trong pha động

Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của các chất trong hệ sắc ký

Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động

Gọi fa là phần thời gian của chất A ở pha động

fa = Số milimol A trong pha động/số milimol A trong toàn cột

1 f

k được gọi là hệ số lưu

Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động, UA là:

A

u u

k đều tỉ lệ nghịch với tốc độ di chuyển của chất tan

Thời gian lưu t R và thời gian lưu hiệu chỉnh t R ’

Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại

, A RA

A

L(1 k ) L

Thể tích lưu V R và thể tích lưu hiệu chỉnh V R ’

Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơmmẫu

vào cột đến khi pic đạt giá trị cực đại Gọi F là tốc độ chảy của pha động (ml/phút) Thể tích lưu VR được tính theo công thức:

VRA = tRA.F; Vm = tm.F; thay vào 3.6 ta có

Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột

V’RA = VR – Vm = Vm.k’A = KDA.Vs (3.9) Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa giải chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh

V’RA/Vs = KDA = Vg

Hệ số tách

Hệ số tách  là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc ký Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỉ số của hệ số phân bố của 2 chất, một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn

Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là   1 (3.10) Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t’RA/t’RB cũng chính là tỉ số của hệ số phân bố

+ Khái niệm đĩa lý thuyết

Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập Theo quan niệm của Martin và synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích sự giãn rộng vùng mẫu, hiện tượng pic sắc ký không cân đối Amoudson và Lapidus và sau

đó là Van Deemter cho rằng đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại,

+ Sắc đồ và tính số đĩa lí thuyết

Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích S hoặc chiều cao h tín hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện, hoặc tần số xung điện…liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian Các tín hiệu này được gọi là “pic” sắc ký Định lượng các chất phân tích dựa vào diện tích pic sắc ký là chính xác nhất Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký hiện đại đều được trang bị phần mềm để tính diện tích của pic một cách tự động

Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân

bằng phân bố chất phân tích tại đó được đáp ứng

Gọi N là số đĩa lí thuyết, là độ lệch chuẩn; tỉ lệ thuận với N Đối với cột sắc ký N càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tR tỉ lệ thuận với số đĩa lí thuyết N, nên ta có thể viết:

Độ phân giải R được định nghĩa: RB RA RB RA

Khi R = 1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95%, nghĩa là còn 2,5% của A ở trong B, 2,5% ở trong A Khi R = 1,5 thì hai cấu tử A và B đã tách khỏi nhau đạt 99,8% có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng:

Thí dụ tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải mới R’ sẽ là R’= 2R

Cách làm tăng độ phân giải

a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột:

- Tăng chiều dài cột

- Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn

- Thay đổi pha tĩnh

- Giảm đường kính cột

b) Dựa trên thay đổi vận hành cột

- Tối ưu hoá tốc độ pha động

- Giảm lượng mẫu

- Giảm nhiệt độ (GC)

- Thay đổi thành phần pha động (LC)

1.3.2 Thuyết đĩa

* Thiết lập phương trình rửa giải

Đĩa lý thuyết là một khái niệm vừa trừu tượng vừa hiện thực Nó hiện thực ở chỗ

là một phần của cột sắc ký, tuy nhiên nó cũng trừu tượng ở chỗ không thể phân biệt được ranh giới cụ thể của nó Có thể định nghĩa: “đĩa lý thuyết là phần nào

đó của cột mà trên đó cân bằng phân bố được thiết lập trong quá trình tách” Số đĩa lý thuyết của một sắc ký thường không cố định cho một cột sắc ký nào, thậm chí cho các phép sắc ký khác nhau trên cùng một cột

Gọi là thuyết đĩa vì các tác giả đã xây dựng phương trình tính thể tích lưu cho phép tách sắc ký dựa trên việc tính toán lượng chất tan có trong từng đĩa lý thuyết Đặt KD là hệ số phân bố, V là thể tích trống của một đĩa và Vm là thể tích trống của toàn cột

Gọi Sx,n là phần chất phân tích đi vào pha tĩnh, Lx,n là phần chất phân tích còn lại

ở pha động Theo định nghĩa về hệ số phân bố ta có:

x,n D

x,n

S K

Khi đưa 1V ml dung dịch rửa giải vào:

Pha động của đĩa số 0 di chuyển xuống đĩa số 1

Tại đĩa số 0:

Chất phân tích từ đĩa số 0 phân bố lại:

D 1,0 1,0 0,0

K S

D

K S

D

2K S

từ (3.14) ta có S2,2 K LD 2,2thay vào biểu thức vừa rồi ta có:

K

D

1 (1 K ) 

D 3 D

K (1 K ) 

D 3 D

2K

D

1 (1 K ) 

D 4 D

K (1 K ) 

2 D 4 D

D 5 D

K (1 K ) 

3 D 5 D

4K (1 K ) 

2 D 5 D

6K (1 K ) 

D 5 D

4K

D

1 (1 K ) 

D 6 D

K (1 K ) 

4 D 6 D

5K (1 K ) 

3 D 6 D

10K (1 K ) 

2 D 6 D

10K (1 K ) 

D 6 D

5K

D

1 (1 K ) 

D 7 D

K (1 K ) 

5 D 7 D

6K (1 K ) 

4 D 7 D

15K (1 K ) 

3 D 7 D

20K (1 K ) 

2 D 7 D

15K (1 K ) 

D 7 D

6K (1 K ) 

D 8 D

K (1 K ) 

6 D 8 D

7K (1 K ) 

5 D 8 D

21K (1 K ) 

4 D 8 D

35K (1 K ) 

3 D 8 D

35K (1 K ) 

2 D 8 D

21K (1 K ) 

Phương trình tổng quát tính lượng chất phân tích cho một đĩa bất kỳ như sau:

x n 1 D

D

K x!

D

K x!

Điều kiện x  n, nếu x < n thì Lx,n = 0; Sx,n = 0

Khi x tăng, Lx,n sẽ qua giá trị cực đại sau đó giảm dần tới 0 Trong sắc ký, số đĩa lý thuyết thường rất lớn Giá trị Lx,n tại cực đại được ký hiệu là Lx*,n sẽ không khác nhau nhiều so với Lx-1,n Ta có thể viết:

Lx*,n = Lx*-1,n Giá trị của n rất lớn, như vậy, giá trị của Lx*,n được viết lại là:

x*.V = VR là lượng dung dịch tại cực đại của đường cong rửa

n.V = Vm là thể tích trống của cột Nhân phương trình (3.27) với V ta có phương trình quan trọng để giải thích quá trình sắc ký:

trong đó  là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt, = 1,5; dplà đường kính hạt nhồi

H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diễn bằng phương trình:

H2 = B/u Trong đó B  2 D  m là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó Trong điều kiện nạp cột tốt,

đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu,   1; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là:

H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc nhiều vào tốc độ hấp thụ và giải hấp Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và pha động vì vậy H3 có thể viết:

d - là chiều dày pha tĩnh

Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động,

2

 là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1

Dmlà hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động

Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:

Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm phương trình Van Deemter,

Hình 1.3 Đường cong Van Deemter Ngoài ra còn có các yếu tố làm giãn rộng vùng mẫu do nguyên nhân ở ngoài cột như thể tích pha động giữa đầu ra cột sắc ký và detector lớn, thể tích mẫu bơm vào cột lớn, lượng mẫu lớn…

Vì mục đích và phạm vi nghiên cứu của luận văn đã được trình bày ở trên nên chúng tôi sẽ giới thiệu chi tiết hơn về sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography), sắc ký giấy (paper chromatography) và sắc ký hấp phụ lỏng trên cột (Adsorption liquid chromatography on columns)

1.4 Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) [15, 18]

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Do chất hấp thụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (hay sắc ký lớp mỏng) Trước đây Sắc ký lớp mỏng chủ yếu dùng trong phân tích định tính, nhưng đến nay đã áp dụng sang cả phân tích định lượng do những tiến bộ của kỹ thuật làm tăng tính lặp lại và độ chính xác Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách Hệ số di chuyển Rfđược tính theo công thức:

0 f

l

l

R  hoặc

0 f

v v

Hình 1.4 Cách xác định giá trị Rf Trong đó l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký, lo là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi, v là tốc độ di chuyển của chất tan và vo là tốc độ của dung môi Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 Khi

Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:

+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ

+ Bề dày của lớp mỏng + Chất lượng và độ tinh khiết của pha động + Độ bão hoà của dung môi trong bình sắc ký + Lượng mẫu đưa lên bản mỏng

1.4.1 Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng

Trong sắc ký lớp mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau: , nhôm oxit, xenlulozơ, tinh bột, nhựa trao đổi ion… ngoài ra còn dùng các chất hấp thụ biến tính khác

Bảng 1.2 Các chất hấp thụ thường dùng trong sắc ký lớp mỏng

Silicagel Có hấp thụ và phân bố Cho tất cả các hợp chất

Magie photphat yếu hấp thụ Carotenoit, tocopherol

1.4.2 Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu

Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi

và thuốc thử khác nhau, sau đây là một số hệ dung môi và thuốc thử trong

SKLM các hợp chất tự nhiên

Bảng 1.3 Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự

nhiên hợp

chất

chất hấp thụ

màu

Ankaloit SiO2G CHCl3-MeOH (9:1)

CHCl3-axetol-MeOH-NH3

(20:20:3:1) CHCl3-EtOAC-MeOH (20:201) Benzen-ETOAC-dietylamin (7:2:1)

hơi I2

Saponin SiO2G n-butan-ACOH-H2O (4:1:5)

n-butan-EtOH-NH4OH (7:2:5) CHCl3-MeOH-H2O (61:32 : 7) EtOAC-MeOH-H2O (100 :17 :13)

FeCl3

Flavonit SiO2G Toluen – Etyl fomiat – axit

formic (5:4:1)

MeOH 10%(H2O)

sắc tố lá

cây

CaCO3 Ete petrol

1.5 Sắc ký giấy (paper chromatography) [15, 19]

Là một phương pháp sắc ký dùng giấy hấp thụ để phân tích một lượng nhỏ chất lỏng mang (chất hoà tan) và lấy ra khi vạch chất hoà tan tiến gần đến đầu kia của một băng giấy Trong quá trình sắc ký các cấu tử được tách dọc theo lớp mỏng

của tờ giấy Đặc trưng cho sự chuyển động của các chất trên giấy là hệ số di chuyể Rf như sau:

0 f

l

l

R  ; hoặc Rf = tốc độ chuyển động của một cấu tử/ tốc độ chuyển động của tuyến pha động

Trong đó l là đoạn đường đi của cấu tử, lo là đoạn đường đi của dung môi Nếu

Rf lớn quá thì không tách được các chất, Rf bé quá thì tách chậm

1.5.1 Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy

Có các phương pháp sắc ký giấy như sau: một chiều, hai chiều, vòng và điện di Tuy nhiên do mục đích nghiên cứu đã trình bày nên ở đề tài này tôi xin phép chỉ trình bày sắc ký một chiều đi lên

A Sắc đồ một chiều đi lên

Sắc ký một chiều đi lên là phương pháp đơn giản nhất Dùng mao quản hoặc micropipet chấm một giọt dung dịch mẫu lên phần đuôi giấy cách mép một khoảng nhất định Nếu pha tĩnh là nước thì giấy không phải xử lý đặc biệt, vì giấy trong không khí đã chứa một lượng nước khá đủ (20 – 22%) Rót pha động

đã được bão hoà trước bằng pha tĩnh vào bình sắc ký (xi lanh hoặc ống nghiệm) Nhúng mép dưới giấy vào pha động, trên mép treo để giấy buông tự do xuống dưới Đậy bình và để vào nơi điều hoà nhiệt, dao động của nhiệt độ trong suốt quá trình sắc ký không nên quá 2oC Nhờ lực hút mao quản, chất lỏng được thấm lên theo giấy và các cấu tử được tách thành vùng riêng do các chất chuyển động với tốc độ khác nhau Khi tuyến dung môi đạt tới chiều cao nhất định, thường cách mép trên của băng giấy 1 cm, thì lấy giấy ra, sấy khô giấy và hiện sắc đồ Vì kết quả tách Rf phụ thuộc vào lượng chất đưa lên giấy, thường lấy không quá 0,001 – 0,005 ml Chiều rộng băng giấy cho một giọt là 2 – 5 cm Chiều dài băng phụ thuộc vào điều kiện tách

1.5.2 Giấy sắc ký

Các yêu cầu đối với giây sắc ký như sau: tinh khiết hoá học, trung tính về phương diện hoá học hấp phụ, đồng nhất về tỉ trọng, bảo đảm cho dung môi chuyển động với tốc độ nhất định

Để có giấy tinh khiết hoá học, xử lý giấy lọc thường bằng các tác nhân khác nhau, ví dụ axit amino axetic, 8-oxiquinonlin v.v để tạo phức tan với các ion vô cơ có trong giấy Sau đó rửa bằng dung môi để loại hết tạp chất vô cơ ra khỏi giấy Có thể dùng giấy lọc lọai mịn, giấy vatmam…

Để đặc trưng cho giấy dùng khối lượng 1m2

(tính theo gam) Chiều dày (mm), chiều cao nước thấm lên một đơn vị thời gian (cm/h) và chiều cao thấm của hỗn hợp ancol n-butylic, axit axetic, nước theo tỉ lệ 4:1:5 trong một đơn vị

thời gian Để tách tốt cần chú ý hướng sợi giấy trùng với hướng chuyển động của dung môi Giấy sắc ký phải chứa một lượng pha tĩnh cần để tách các chất

Các loại giấy thường là hyđrophyl ưa nước Do đó nếu dùng nước làm pha tĩnh không cần phải làm ẩm

Để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước cần chuyển giấy từ

ưa nước thành kị nước theo cách tẩm bằng các chất kị nước khác nhau và axetyl hoá

Tẩm giấy bằng dung dịch parafin 1% trong ete dầu hoả dung dịch cao su 0,5% trong bezen, dung dịch dầu thực vật sạch 1- 2% trong ete etylic Kiểm tra

độ kị nước của muối sau khi tẩm dung môi nói trên: cho bay hơi bằng một giọt nước Nếu giọt nước trượt theo tờ giấy, không bị thấm là tốt Giữ giấy trong bình kín bão hoà hơi dung môi sẽ làm pha tĩnh

Axetyl hoá giấy bằng cách xử lí giấy bằng hỗn hợp 90ml axit axetic, 10ml ete dầu hoả và 8 – 10 giọt H2SO4 đặc Nhúng giấy vào hỗn hợp axetyl hoá này trong 45 phút, sau đó lấy ra, rửa cẩn thận bằng dòng nước trong 15 phút, ngâm trong nước cất 10 – 15 phút, rửa và sấy Kiểm tra độ kị nước của giấy như trên

Phương pháp thu sắc đồ trên giấy kị nước dùng để tách các hỗn hợp các chất không tan trong nước gọi là phương pháp pha biến tính Trong trường hợp này pha tĩnh là dung môi không phân cực, còn pha động là dung môi phân cực

1.5.3 Dung môi trong sắc ký giấy

Chọn đúng pha tĩnh và pha động là yếu tố quan trọng nhất để tách các chất trong sắc ký giấy Khả năng tách phụ thuộc vào sự khác nhau của hệ số phân bố (Kp)các cấu tử giữa hai pha lỏng Pha lỏng phải đạt được những yêu cầu sau:

+ Hai chất không được trộn lẫn vào nhau

+ Các cấu tử phải có độ tan trong dung môi làm pha động nhỏ hơn trong dung môi làm pha tĩnh Độ tan của chất trong dung môi làm pha động phải vừa

đủ Nếu lớn quá chất sẽ chuyển động theo tuyến của dung môi động, nếu bé quá chất sẽ gần như ở tuyến xuất phát;

+ Độ tan, hệ số phân bố của các cấu tử phải khác nhau đối với cặp dung môi đã chọn;

+ Thành phần dung môi trong quá trình sắc ký giấy, phải không biến đổi; + Dung môi phải dễ loại khỏi giấy và không độc với người

+ Đối với các chất tan trong nước, dùng dung môi hữu cơ bão hoà nước làm pha động, dùng nước làm pha tĩnh Đối với các chất không tan trong nước phải sắc ký bằng dung dịch nước của các chất hữu cơ, dùng các chất hữu cơ không phân cực làm pha tĩnh

1.5.4 Ứng dụng của sắc ký giấy

Sắc ký giấy được ứng dụng khá rộng rãi điển hình là:

- Phân tích để xác định hệ số phân bố của các chất trước khi chọn phương pháp tách sắc ký một hỗn hợp nào đó

- Phân tích định tính hỗn hợp các cation

- Phân tích định lượng một số axit hữu cơ

- Phân tích định lượng glucozơ trong dung dịch

- Phân tích định lượng hàm lượng nhựa trong các sản phẩm dầu mỏ

- Phân tích định tính và định lượng các axit amino

1.6 Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột (Adsorption liquid chromatography on

columns) [15, 19]

1.6.1 Nguyên tắc của sắc ký hấp phụ lỏng

Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách Giữa nồng độ chất trong dung dịch và nồng độ chất bị hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ có một cân bằng động, cân bằng đó phụ thuộc vào nhiệt độ Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp thụ vào nồng độ của

nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi đường đẳng nhiệt hấp phụ Căn cứ vào đường đẳng nhiệt hấp phụ ta có thể chọn được điều kiện sắc ký thích hợp

Theo thuyết Langmuir có hai giả thiết: 1) trên bề mặt chất hấp phụ có những trung tâm hoạt động, trường lực tự do của chúng có thể hút các phân tử khí hoặc chất tan trong dung dịch; 2)chỉ một lớp đơn phân tử tạo thành trên bề mặt chất rắn do các phân tử đó làm mất trường lực của chất hấp phụ Mặt khác các phân tử bị hấp phụ lại có thể được giải phóng trở lại môi trường xung quanh (bay hơi hoặc giải hấp) Kết quả là cân bằng được thiết lập giữa chất hấp phụ và môi trường xung quanh, nghĩa là tốc độ hấp phụ (dính) và tốc độ giải hấp (nhả) bằng nhau

Trước khi bị hấp phụ, phân tử chuyển động tự do và phải va chạm vào bề mặt chất hấp phụ và dính vào chỗ trống (chỗ bề mặt chưa bị hấp phụ) Vì số lần

va chạm tỷ lệ với nồng độ chất trong dung dịch C, còn xác suất rơi vào chỗ trống tỉ lệ với diện tích trống nên tốc độ quá trình hấp phụ Uh được biểu diễn bởi phương trình:

Trong đó: k1 là hằng số

fs là phần chỗ đã bị chiếm trên bề mặt chất hấp phụ 1-fs là phần chỗ trống

Tốc độ quá trình giải hấp Ug tỉ lệ với số phân tử bị hấp phụ, nghĩa là tỉ lệ với diện tích bề mặt bị chiếm:

Trong đó k2 là hằng số

Khi hệ đạt tới trạng thái cân bằng, ta có Uh = Ug:

k1C(1-fs) = k2fs (3) Giải phương trình (3) theo fs và đặt k = k1/k2 ta có

fs =

kC 1

kC q q

phương trình Langmuir giải thích được đa số các trường hợp hấp phụ khí, lỏng cũng như chất tan trong dung dịch Tuy nhiên, sự hấp phụ trong dung dịch xảy ra phức tạp hơn nhiều do lượng dung môi thường rất lớn so với chất tan Do

đó sự hấp phụ xảy ra ít nhất với hai loại phân tử: dung môi và chất tan Khi bị hấp phụ dung môi làm giảm khả năng hấp phụ chất tan Do đó trong sắc ký cần chọn dung môi nào bị hấp phụ kém nhất đối với chất hấp phụ dùng Khi xác định đường đẳng nhiệt hấp phụ của các chất phải tiến hành trong cùng một loại dung môi Dạng đường đẳng nhiệt hấp phụ trong dung dịch bị sai lệch, khác với đường hấp phụ đẳng nhiệt thông thường, bó có hình chữ S, nghĩa là lượng chất

bị hấp phụ tăng theo nồng độ chất trong dung dịch, vì các phân tử bị hấp phụ trên bề mặt lại có thể làm phân cực các phân tử trong dung dịch hấp phụ chúng Kết quả tạo thành hấp phụ nhiều lớp Như vậy, muốn chọn đúng điều kiện tách sắc ký phải biết đường đẳng nhiệt hấp phụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp Có thể dùng phương pháp sắc ký để xác định các đường đẳng nhiệt hấp phụ đó Trong sắc ký hấp phụ lỏng trên cột thì phương pháp rửa giải có ứng dụng rộng rãi nhất

Giả sử tiến hành phân tích rửa giải một cấu tử Sau khi đưa mẫu vào cột ta thu được sắc đồ sơ cấp

Hình 1.6 Sơ đồ phân bố chất trên cột chất hấp phụ (sắc đồ) với trường hợp đường đẳng nhiệt hấp phụ phi tuyến tính (a, b) và tuyến tính (c)

Trong vùng đó nồng độ chất không đổi và nồng độ cân bằng trong dung dịch là Co Lượng chất bị hấp phụ trên một đơn vị chiều dài cột là mf(Co), trong

đó m là khối lượng chất hấp phụ trên một đơn vị chiều dài, còn f(Co) là hấp phụ năng riêng (lượng chất bị hấp phụ bởi một đơn vị khối lượng chất hấp phụ) ứng với nồng độ dung dịch Co Ở tuyến trước, nồng độ tụt xuống không (dốc thẳng đứng)

Nếu V1olà thể tích pha lỏng trên một đơn vị chiều dài cột thì tổng lượng chất có trong một đơn vị chiều dài cột là V1oCmf ( Co) Sau khi cho qua cột một thể tích dung môi rửa giải Vr , vùng dịch chuyển một đoạn :

o

o o

1

r

o o

o

1

o r

C

) C ( mf

V )

C ( mf

Như vậy khi cho thể tích dung môi V, tuyến trước của chất chuyển dịch một đoạn là L:

o

o o

1

C

) C ( m

) C ( ' mf

(do đường cong lồi) nên L*  X, nghĩa là vùng nồng độ nhỏ sẽ chuyển động chậm hơn Kết quả là sắc đồ bị kéo dài đuôi (hình 4, vùng II) Khi cho dung môi qua càng nhiều (V càng lớn), nồng độ chất bị giảm xuống và đuôi kéo dài hơn (hình 4, vùng III)

Đối với trường hợp đường đẳng nhiệt hấp phụ “lõm” (thực tế rất ít gặp) sắc đồ

có dạng ngược lại, phía trước là mũi nhọn và đuôi bằng Còn khi đường đẳng nhiệt hấp phụ tuyến tính, sự phân bố chất gần như đối xứng (hình 4, c)

Theo các công thức ở trên, chất cùng bị hấp phụ, nghĩa là đường đẳng nhiệt hấp phụ càng dốc, chất chuyển động càng chậm Chính vì thế khi rửa giải cột chứa một số chất bị hấp phụ chúng sẽ được giải hấp với những tốc độ khác nhau và nếu cột đủ dài ta có thể thu được từng chất riêng

Vấn đề tốc độ hấp phụ và giải hấp cần được đặc biệt chú ý như đã nói trong phương trình Van Deemter Phải chọn tốc độ tối ưu đối với dung môi rửa giải để đảm bảo thiết lập cân bằng hấp phụ, đồng thời giảm độ khuếch tán dọc

1.6.2 Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng

Sắc ký hấp phụ lỏng có nhiều ứng dụng điển hình là:

- Xác định hấp phụ năng của silicagel

- Xác định hiđrocacbon thơm trong keroxin

- Tách hỗn hợp parafin – naphten lấy được từ keroxin

- Tinh chế clobenzen và xác định hàm lượng FeCl3

- Xác định các ancaloit trong beladon

- Tách các picmen lá xanh

1.7 Khái quát về chất diệp lục (chlorophyl) và carotenoit (xanthophyl và

caroten) [5, 9, 16]

1.7.1 Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl)

Là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam Từ này có nguồn gốc Hán-Việt: "diệp" là lá, "lục" là xanh Đây là nhóm sắc

tố có vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp, vì nó có khả năng hấp thụ trực tiếp ánh sáng và biến năng lượng hấp thụ được (năng lượng vật lí) thành năng lượng dự trữ trong các hợp chất hữu cơ (năng lượng hoá học) Các nhóm sắc tố khác không làm được chức năng đầy đủ và trực tiếp như vậy

Có 5 loại chlorophyl là chlorophyl a, b, c1, c2 và d (có tài liệu chia thành chlorophyl a,b,c,d và e) nhưng sự khác nhau giữa chúng chỉ ở một số chi tiết về

cấu tạo và sau đó là về điểm cực đại trong quang phổ hấp thụ ánh sáng Chlorophyl c1và c2 chỉ có ở các loại tảo khác nhau, chlorophyl d chỉ có ở vi khuẩn lam, còn chlorophyl a và b có ở các thực vật bậc cao nên rất phổ biến, ở luận văn này ta chỉ xem xét kỹ chlorophyl a và b

Về cấu tạo chung của chlorophyl, ta chú ý đến các đặc điểm sau:

phân tử chlorophyl có 4 nhân pyron liên kết với nhau bằng các cầu nối (-

CH = ) để tạo nên vòng porphyrin có nguyên tử Mg ở giữa liên kết với 4 nguyên

tử N của các nhân pyron, có hai nguyên tử H ở nhân pyron thứ tư, nhân này nối với gốc rượu phyton và có vòng cyclopentan ở nhân pyron thứ ba với một nguyên tử oxi

Sau đây là công thức của chlorophyl a và chlorophyl b:

- Công thức của chlorophyl a (C55H72O5N4Mg)

- Công thức của chlorophyl b: (C55H70O6N4Mg)

Diệp lục b chỉ khác diệp lục a là nhóm CH3 ở nhân pyron thứ hai được thay bằng nhóm CH=O

a Chlorophyl không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ

Vì vậy khi muốn tách chlorophyl ra khỏi lá, bắt buộc phải dùng một dung môi hữu cơ như: ete, cồn, benzen hay axeton, …

b Chlorophyl là este của axit dicacboxilic:

C32H30ON4Mg(COOH)2 với hai loại rượu là phyton: C20H39OH và metanol:

CH3OH, nên công thức của chlorophyl có thể viết như sau:

thế và hình thành một hợp chất kết tủa có màu nâu pheophytin Nếu cho pheophytin tiếp tục tác dụng với một kim loại khác thì kim loại này lại thay thế

vị trí của Mg và tạo thành một hợp chất cơ-kim (hữu cơ - kim loại) có màu xanh rất bền

c Sự mất màu của chlorophyl:

Chlorophyl a có màu xanh lam, còn chlorophyl b có màu xanh vàng Chlorophyl trong tế bào không bao giờ bị mất màu, trừ trường hợp bị phân huỷ trong quá trình hoá già của cơ quan, cơ thể Bởi vì chlorophyl nằm trong phức

hệ cấu trúc chặt chẽ với protein và lipoit Nhưng dung dịch chlorophyl ngoài ánh sáng và trong môi trường có O2 thì sự mất màu xảy ra do chlorophyl bị oxi hoá dưới tác dụng của ánh sáng:

Chlorophyl + h  => Chlorophyl* (trạng thái kích thích)

Chlorophyl* + O2 > ChlorophylO2 (trạng thái oxi hoá, mất màu)

e Quang phổ hấp thụ của chlorophyl

Trong bước sóng ánh sáng nhìn thấy (400 nm - 700 nm), có hai vùng hấp thụ của chlorophyl: vùng xanh tím (430 nm) và vùng đỏ (680nm) Màu xanh đặc trưng của chlorophyl và cũng là màu xanh của lá cây chính là kết quả của sự hấp thụ hai vùng quang phổ xanh tím và đỏ này Vì phổ ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng trắng) gồm các vùng ánh sáng: đỏ, da cam, vàng, lục, lam, chàm, tím Các sắc tố của lá cây hấp thụ các vùng ánh sáng ở đầu và cuối của phổ ánh sáng nhìn thấy để lại ánh sáng vùng lục không hấp thụ (phản xạ hoặc xuyên qua) Ánh sáng màu lục đập vào mắt ta khi ta nhìn vào lá cây và thấy lá cây có màu xanh lục

f Chlorophyl tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp

Năng lượng tích luỹ được bởi chlorophyl khi hấp thụ ánh sáng được chuyển trực tiếp cho các phản ứng quang hoá để quang phân li H2O giải phóng

O2, H+ và electron và sau đó hình thành 2 sản phẩm vô cùng quan trọng của pha

sáng là ATP và NADPH

1.7.2 Carotenoit

Đây là nhóm sắc tố có các màu từ vàng đến tím đỏ Chúng được cấu tạo theo mạch nối đôi không nhánh, gồm 40 nguyên tử C và 56 nguyên tử hidro (C40H56)

Nhóm carotenoit được chia thành 2 nhóm nhỏ theo cấu trúc hoá học: Caroten và xanthophyl

* Caroten - C40H56 là một hiđrocacbon chưa bão hoà, không tan trong nước mà chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Công thức cấu tạo gồm một mạch cacbon dài gồm 8 gốc izopren và hai đầu là một hoặc hai vòng ionon Trong thực vật

thường có 3 loại caroten: anpha, beta, gama caroten Caroten có màu vàng da cam Cắt đôi phân tử beta caroten ta được hai phân tử vitamin Bước sóng hấp thụ cực đại của caroten ở 446 - 467 nm

- Công thức cấu tạo của alpha caroten(C40H56):

- Công thức cấu tạo của beta caroten(C40H56):

- Công thức cấu tạo của gama caroten(C40H56):

* Xanthophyl - C40H56On (n = 1- 6) là dẫn xuất (dạng oxi hoá) của caroten Các nguyên tử oxi liên kết trong các nhóm: hidroxy, cacboxy, axetoxy, metoxy, epoxy,…Vì oxi từ 1 đến 6 nên có nhiều loại xanthophyl ví dụ:

+ Cripthoxanthin (C40H56O)

+ Lutein (C40H56O2)

+ Violaxanthin (C40H56O4)

+ Neoxanthin (C40H56O4)

Bước sóng hấp thụ của cực đại của xanthophyl ở 451 - 481 nm Người ta còn phân chia nhóm carotenoit thành hai nhóm nhỏ theo tính chất sinh học:

Sự phân cực của diệp lục a, diệp lục b, caroten và xanthophyl

Màu sắc và mức độ phân cực của phân tử các chất đó tăng dần theo thứ tự

từ trên xuống như sau:

Bảng 1.4 Màu sắc và thứ tự phân cực của các loại diệp lục, caroten và

violaxanthin màu vàng neoxanthin màu vàng

1.7.3 Các phương pháp sắc ký đã dùng để tách các diệp lục và carotenoit

- Theo [15, 18] Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail Semyonovich Tsvet) đã tách các chất màu thực vật bằng sắc ký cột với pha tĩnh là bột CaCO3, pha động là dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa

- Theo [15] có thể tách các chất màu thực vật trong lá xanh bằng sắc ký cột với pha tĩnh là bột CaCO3 hoặc bột đường, chiết mẫu bằng hỗn hợp xăng ben

- zen (tỉ lệ thể tích 9:1), rửa cột bằng hỗn hợp xăng-benzen (tỉ lệ thể tích 10:1) Picmen sẽ thành 3 vùng màu vàng là carotenoit, màu xanh chlorophyl a và màu xanh vàng là chlorophyl b

- Theo [16] dùng sắc ký giấy với dung môi là ete dầu hoả tách được: clorophin b, clorophin a, xanthophyl, caroten (theo thứ tự từ dưới lên) Trong thời gian 20-30 phút

- Theo [12] cho mẫu chiết từ lá, hoa hoặc quả các thực vật bằng n – hexan chạy HPLC với hệ dung môi (gồm axeton nitrin : metanol :

clorofoc = 70 : 27 : 3) tách và xác định được hàm lượng các carotenoit: beta- caroten, lutein, lycopen

- Theo [24] có thể tách các chất màu ở lá xanh bằng SKLM với pha động

là hỗn hợp 100 ml ete dầu hoả, 11ml isopropanol và 5 giọt nước

- Theo [25] sử dụng SKLM silicagel với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả, oxeton, xyclohexan, etyl axetat và metanol tách được các chất màu trong lá cây rau bina (rau chân vịt) trong 10 phút

- Theo [21] sử dụng SKLM silicagel với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả và axeton tỉ lệ 4:1tách được các chất màu trong lá xanh từ trên xuống là Caroten (vàng), Pheophytin (xanh ô-liu), diệp lục a (màu xanh lá cây), diệp lục b (xanh-vàng), Lutein (vàng), violaxanthin (vàng), neoxanthin (vàng)

- Theo [26] sử dụng SKG với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả và axeton tỉ lệ 7:3 hoặc 8:2 hoặc 9:1tách được các chất màu trong lá xanh

- Theo [26] sử dụng SKG với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả và axeton tỉ lệ 9:1tách được các chất màu trong lá xanh thành 3 nhóm từ trên xuống

là màu vàng, màu xanh lá cây, màu xanh vàng

1.8 Khái quát về ion Co 2+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Ni 2+ và muối của chúng [3, 7]

1.8.1 Sơ lƣợc về muối sắt(III) và ion Fe 3+

Sắt(III) tạo nên muối với đa số các anion, trừ những anion có tính khử Đa

số muối sắt(III) dễ tan trong nước cho dung dịch chứa ion bát diện [Fe(H2O)6]3+màu tím nhạt Khi kết tinh từ dung dịch, muối sắt(III) thường ở dạng tinh thể hiđrat ví dụ như FeF3.3H2O màu đỏ, FeF3.4,5H2O màu hồng FeCl3.6H2O màu nâu vàng, Fe(NO3)3.9H2O màu tím, Fe(ClO4)3.10H2O màu hồng,

Fe2(SO4)3.10H2O màu vàng và phèn sắt MFe(SO4)2.12H2O (trong đó M là Na+,

K+, Cs+, NH4

+

) màu tím nhạt Màu của muối khan tuỳ thuộc vào bản chất của anion ví dụ FeF3 màu lục, FeCl3 màu nâu đỏ, FeBr3 màu đỏ thẫm, Fe2(SO4)3

màu trắng và Fe(SCN)3 màu đỏ máu

Muối sắt(III) thuỷ phân mạnh hơn muối sắt(II) nên dung dịch có màu vàng nâu và có phản ứng axit mạnh; tuỳ theo nồng độ, pH của dung dịch có

thể vào khoảng 2-3:

[Fe(H2O)6]3+ + H2O  [FeOH(H2O)5]2+

+ H3O+[FeOH(H2O)5]2+ + H2O  [Fe(OH)2(H2O)4]+

+ H3O+ Chỉ trong dung dịch có phản ứng axit mạnh (pH < 1) sự thuỷ phân mới bị đẩy lùi Ngược lại khi thêm kiềm hoặc đun nóng dung dịch, phản ứng thuỷ phân xảy ra đến cùng tạo thành kết tủa (gel) hoặc dung dịch keo (sol) của sắt(III) hiđroxit bao gồm những phức chất hiđroxo nhiều nhân do hiện tượng ngưng tụ tạo nên

Vì thế từ dung dịch không thể tách ra những hợp chất FeI3, Fe2S3

Sắt(III) florua khó nóng chảy, thăng hoa ở > 1000oC Sắt(III) clorua nóng chảy ở 308 oC và sôi ở 315oC Sắt(III) bromua kém bền hơn trên 100oC đã phân huỷ thành FeBr2 và Br2 Ở trạng thái khí và ở 700oC, sắt(III) clorua ở dạng đime hoá Fe2Cl6:

Cl Cl Cl

Và ở trên 700o

C Fe2Cl6 bị phân huỷ thành monome FeCl3 Ion sắt(III) tạo nên nhiều phức chất Đa số các phức chất có cấu hình bát diện, ví dụ như M3[FeF6], M3[Fe(SCN)6], M3[Fe(CN)6], một số rất ít có cấu hình

tứ diện, ví dụ như M[FeCl4] (trong đó M là kim loại kiềm) Những phức chất bát diện thường có spin cao, trừ những phức chất tạo nên với phối tử trường mạnh

có spin thấp, ví dụ như [Fe(CN)6]3-, [Fe(phen)3] (ở đây phen là o-phenantrolin)

1.8.2 Sơ lƣợc về muối đồng(II) và ion Cu 2+

Đa số muối đồng(II) dễ tan trong nước, bị thuỷ phân và khi kết tinh từ dung dịch thường ở dạng hiđrat Dung dịch loãng của các muối tan có màu lam, màu của ion [Cu(H2O)6]2+, trong khi ở trạng thái rắn các muối có màu khác

Ion [Cu(H2O)6]2+có hình bát diện lệch với ion Cu2+

ở trung tâm, trong đó hai phân tử H2O ở cách Cu2+

xa hơn so với bốn phân tử H2O còn lại

Ion Cu2+ là chất tạo phức mạnh Những ion phức quen thuộc của Cu2+ là [CuX3]-, [CuX4]2- (trong đó X là F, Cl, Br), [Cu(NH3)4]2+, [Cu(C2O4)2]2-, [Cu(en)2]2+, (trong đó en là etylenđiamin H2N-CH2-CH2-NH2)

Nói chung khi gặp chất khử, muối đồng(II) có thể chuyển thành muối đồng(I) hoặc đồng kim loại

Trong nước khi có NH3 ion Cu2+ tạo phức chất với NH3 bằng cách thay thế lần lượt các phân tử H2O trong ion [Cu(H2O)6]2+ (màu xanh lam) bằng các phân tử NH3 nhưng việc thay thế phân tử NH3 thứ năm và thứ sáu là rất khó hơn nữa hai phân tử H2O còn lại liên kết rất yếu với ion Cu2+

nên ion phức của Cu2+với NH3 thường được biểu diễn là [Cu(NH3)4]2+ (xanh chàm), với lý do tương tự phức chất của ion Cu2+

với etylenđiamin là [Cu(en)2]2+ (xanh chàm đậm) với cấu hình hình vuông

Đồng(II) clorua là chất ở dạng tinh thể màu nâu, nóng chảy ở 596o

C và sôi ở 993oC có phân huỷ thành CuCl và Cl2 Đồng(II) clorua là polime vô cơ, ở trạng thái hơi có cấu tạo mạch dài:

Đồng(II) clorua dễ tan trong nước, rượu, ete và axeton Khi kết tinh từ dung dịch nước, nó tách ra dưới dạng đihiđrat CuCl2.2H2O

Đihiđrat đồng(II) clorua là những tinh thể màu lục cũng có kiến trúc lập phương lệch như đồng(II) clorua khan nhưng trong đó mỗi nguyên tử đồng được phối trí bởi bốn nguyên tử Cl và hai phân tử nước:

Dung dịch đậm đặc của CuCl2.2H2O ở trong nước vẫn có màu lục nhưng dung dịch loãng có màu lam, màu đặc trưng của ion [Cu(H2O)6]2+ Khi đun nóng

150oC thì CuCl2.2H2O mất nước thành muối khan

Đồng(II) sunfat (CuSO4) là bột màu trắng, hút mạnh hơi ẩm của không khí tạo thành hiđrat CuSO4.5H2O màu lam Lợi dụng tính chất này, người ta dùng CuSO4 khan để phát hiện nước lẫn trong chất hữu cơ Khi đun nóng, pentahiđrat mất dần nước và đến 250oC biến thành muối khan:

CuSO4.5H2O  100    o C

CuSO4.3H2O  150    o C

CuSO4.H2O    250  o C

CuSO4 Đồng(II) axetat là chất dạng tinh thể màu lục, dễ tan trong nước Nó có cấu tạo dạng đime [Cu(CH3COO)2.H2O]2 trong đó nguyên tử Cu ở trạng thái lai hoá d2sp3, những nhóm CH3COO- là cầu nối giữa hai nguyên tử Cu

1.8.3 Sơ lƣợc về muối coban(II) và ion Co 2+

Ion Co2+ tạo muối với hầu hêt các anion bền Muối khan có màu khác với muối ở dạng tinh thể hiđrat, ví dụ như CoBr2 màu lục còn CoBr2.6H2O màu đỏ, CoCl2 màu xanh lam còn CoCl2.6H2O màu đỏ-hồng Khi tan trong nước ion

Co2+ tạo ion bát diện [Co(H2O)6]2+ có màu đặc trưng là đỏ - hồng, ion

[Co(H2O)6]2+ tồn tại trong một số tinh thể hiđrat như CoCl2.6H2O màu đỏ - hồng, Co(NO3)2.6H2O màu đỏ - hồng Trong nước ion [Co(H2O)6]2+ thuỷ phân một phần làm cho dung dịch có phản ứng axit yếu CoX2 khi được kết tinh từ dung dịch nước thường ở dạng tinh thể hiđrat CoX2.6H2O(trừ florua) Các

hexahiđrat dễ tan trong nước, trong rượu Ở dạng khan màu của muối tuỳ thuộc vào màu của các anion cụ thể:

CoF2 màu đỏ nhạt, CoCl2 màu xanh lam, CoBr2 màu lục, CoI2 màu đen CoCl2 nóng chảy ở 727oC và sôi ở 1049o

C

Khi nhiệt phân tinh thể hiđrat CoX2.6H2O cũng như muối hiđrat khác của Co(II) xảy ra hiện tượng mất nước dần kèm theo sự đổi màu từ đỏ - hồng đến xanh lam

Quá trình mất nước của CoCl2.6H2O không kèm theo sự thuỷ phân làm cho sự tương tác giữa CoCl2 và nước có tính thuận nghịch Dựa vào tính chất này người

ta cho CoCl2 vào silicagel để làm chất chỉ thị độ ẩm

CoSO4 màu hồng, phân huỷ ở trên 600oC, hút ẩm và dễ tan trong nước Khi kết tinh từ dung dịch nước ở nhiệt độ thường thu được tinh thể hiđrat CoSO4.7H2O có màu đỏ, nóng chảy ở 96-98o

C CoSO4.7H2O bền trong không khí, tan trong nước nhưng không tan trong rượu, khi đung nóng CoSO4.7H2O mất dần nước biến thành muối khan

Ion Co2+ tạo nên nhiều phức chất bát diện với số phối trí là 6 ví dụ amoniacat coban(II) [Co(NH3)6]2+ có màu nâu vàng, [Co(CN)6]4- màu đỏ, [Co(H2O)6]2+ có màu đặc trưng là đỏ - hồng, [CoF6]4- Ion Co2+ cũng tạo nên nhiều phức tứ diện ví dụ như: [CoCl4]2-, [CoBr4]2-, [CoI4]2-, [Co(OH)4]2-, [Co(SCN)4]2- Phức chất bát diện của Co(II) có màu đỏ-hồng còn phức chất tứ diện của Co(II) có màu xanh lam Trong dung dịch nước, amoniacat coban(II)

dễ dàng tác dụng với oxi không khí tạo thành amoniacat coban(III):

4[Co(NH3)6]2+ + O2 + 2H2O 4[Co(NH3)6]3+ + 4OH-

1.8.4 Sơ lƣợc về muối Niken(II) và ion Ni 2+

Niken(II) tạo được muối với hầu hết các anion bền, muối khan có màu khác với muối ở dạng tinh thể hiđrat, ví dụ NiSO4 màu vàng nhưng NiSO4.7H2O màu lục, NiSO4.6H2O màu lục Trong nước ion Ni2+

hiđrat hóa tạo ion bát diện [Ni(H2O)6]2+ có màu lục và ion này thủy phân một phần làm dung dịch có phản ứng axit yếu Trong tinh thể hiđrat có trường hợp không có ion [Ni(H2O)6]2+ ví

dụ trong NiCl2.6H2O Màu của các muối halogen khan tùy thuộc vòa anion NiF2

màu lục, NiCl2 màu vàng, NiBr2 màu nâu sẫm, NiI2 màu đen Muối ddihalogenua có thể kết hợp với halogen kim loại kiềm (M) tạo nên muối kép M[NiX3] hay M2[NiX4] NiSO4.7H2O bền trong không khí, khi đun nóng mất dần nước cuối cùng biến thành muối khan Ion Ni2+

tạo nhiều phức chất đa số có cấu hình bát diện ví dụ [Ni(H2O)6]2+, [Ni(NH3)6]2+ đều thuận từ Trong những phức chất với số phối trí là 4 của niken một số ít được tạo nên với phối tử trường yếu có cấu hình tứ diện như [NiCl4]2- và số nhiều hơn với phối tử trường mạnh,

và có cấu hình hình vuông như [Ni(CN)4]2-, tất cả các phức chất hình vuông của Ni(II) đều có tính nghịch từ và có các màu đỏ vàng hay nâu ví dụ Na2[Ni(CN)4] màu vàng, K2[Ni(CN)4] màu da cam, niken ddimetylglioxximat màu đỏ [Ni(CN)4]2- là phức bền nhất của niken, Kb = 1.1031 Muối Ni(II) khan kết hợp với khí NH3 tạo nên muối phức amoniacat chứa ion bát diện [Ni(NH3)6]2+ có màu tím với Kb là 1,02.108 , [Ni(NH3)6]2+ được tạo nên cả trong dung dịch, sự thay thế nước trong [Ni(H2O)6]2+ bằng NH3 đã làm màu biến đổi từ lục sang tím

Muối [Ni(NH3)6](ClO4)2 có độ tan rất bé nên có thể dung để định lượng niken Muối Ni(II) khi tác dụng với xianua kim loại kiềm mới đầu tạo nên kết tủa Ni(CN)2 màu lục, sau đó kết tủa tan trong xianua dư tạo nên ion phức hình vuông [Ni(CN)4]2-

1.8.5 Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách ion Co 2+ , Cu 2+ ,

Fe 3+ , Ni 2+

- Theo [15] có thể dùng cột anoinit để tách hỗn hợp 2 loại ion Fe3+-Zn2+, Cu2+

-Zn2+, Co2+-Zn2+ hoặc Ni2+-Zn2+ ra khỏi nhau trong dung dịch nước dựa vào khả năng tạo phức [ZnCl4]2- của ion Zn2+ trong dung dịch HCl 0,5 – 1,0M và bị cột giữ lại Rửa cột bằng dung dịch HCl 1,0M các ion Fe3+

photphat và pha động là các dung dịch axit tách được ion của các kim loại Cu-Ag-Zn-Fe hoặc Co-Cu-Ag-Zn-Fe

Ni-+ SKLM trên lớp silicagel với pha động là axeton có thể tách ion của các kim loại Fe, Cu, Ni, Co, Ca, Hg, Zn ra khỏi các nguyên tố đất hiếm

+ SKG dung môi axeton chứa 5% nước và 8% HCl đặc tách được các ion theo thứ tự từ dưới lên: Ni2+

, Co2+, Cu2+, Fe3+ trong khoảng thời gian từ 2-4 giờ

- Theo [26] SKG với pha động là hỗn hợp HCl đặc, etanol và butanol trong khoảng 75 – 90 phút tách được các ion Co2+

, Fe3+, Cu2+, Ni2+ ra khỏi dung dịch muối nitrat trong nước

- Theo [29] SKG với pha động là hỗn hợp 10ml HCl 7,2M và 30ml butan-2-ol tách được các ion Co2+

, Fe3+, Cu2+, Ni2+ ra khỏi dung dịch muối tan trong nước của chúng