xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Anh Lƣơng XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHƠNG SỬ DỤNG PHĨNG XẠ PHỤC VỤ ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Anh Lƣơng XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐINH ĐOÀN LONG Hà Nội – 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát lƣợc lý phân tử 1.2 Các đích tác dụng thuốc 1.3 Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR) 1.4 Thụ thể angiotensin II 12 1.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định tƣơng tác thụ thể phối tử 20 1.6 Y học cổ truyền tài nguyên dƣợc liệu 26 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36 2.1 Vật liệu 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 37 2.2.2 Thu thụ thể màng 37 2.2.3 Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford 38 2.2.4 Phƣơng pháp elisa để xác định lƣợng phối tử gắn fluorescein 39 2.2.5 Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay) 39 2.2.6 Phản ứng tƣơng tác phối tử biết dịch chiết với thụ thể đích 40 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý kết 40 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột 41 3.2 Tối ƣu phản ứng ELISA 43 3.3 Tối ƣu nồng độ protein thụ thể phản ứng liên kết 45 3.4 Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hịa) 46 3.5 Phả ứng cạnh tranh F-AT II với phối tử biết 47 3.6 Nghiên cứu sàng lọc số dịch chiết thực vật 48 Chƣơng KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AT I Angiotensin I AT II Angiotensin II BSA Bovine serum albumin ELISA Phản ứng miễn dịch hấp thụ liên kết enzym F-AT II Fluorescein – angiotensin II (angiotensin II đánh dấu fluorescein F-BSA Fluorescein – BSA (BSA đánh dấu fluorescein) GPCR G protein - coupled receptor IC50 Nồng độ ức chế 50% Kd Hằng số phân ly cân Ki Nồng độ chất gắn cạnh tranh mà liên kết với nửa số vị trí liên kết trạng thái cân YHCT Y học cổ truyền MỞ ĐẦU Việt Nam nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng phong phú giới với 13.200 loài thực vật khoảng 10.000 loài động vật xác định, với nhiều nhóm lồi sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học thực tiễn lớn Xuất phát từ văn hóa đa dạng sắc với nhiều dân tộc sống trải dài khắp lãnh thổ với điều kiện tự nhiên lịch sử riêng hình thành nên Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với nhiều kinh nghiệm sử dụng thuốc đời sống Việc dùng thuốc nhân dân có từ lâu đời, tích lũy dạng kinh nghiệm, thường truyền miệng qua nhiều hệ Hơn 3800 thuốc sưu tầm lại, với hàng nghìn thuốc lưu truyền dân gian, đặc biệt cộng đồng dân tộc thiểu số Tuy nhiên, nhiều thuốc nguyên liệu làm thuốc chưa nghiên cứu chế tác động sở khoa học chưa xác định Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học phát triển thuốc giới, phổ biến phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như 3H, 125I) để nghiên cứu đích phân tử thuốc Tuy nhiên, phương pháp chưa áp dụng điều kiện Việt Nam với ngun nhân hầu hết phịng thí nghiệm sinh dược học ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản loại thải chất phóng xạ Vì lý đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Xây dựng phƣơng pháp đo tƣơng tác thụ thể phối tử đặc hiệu khơng dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hƣớng phát triển thuốc Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mơ hình nhằm sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học đích phân tử có nguồn gốc từ thuốc, thuốc sử dụng hiệu y học cổ truyền với tác dụng chữa bệnh tương ứng Trong Luận văn này, tập trung vào đích phân tử thụ thể angiotensin II, đích tác dụng biết nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với chế phân tử nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với số dịch chiết từ số thuốc Việt Nam biết y học cổ truyền với tác dụng điều hòa huyết áp điều trị chứng bệnh liên quan đến tim, mạch hệ tuần hoàn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát dƣợc lý phân tử Dược lý phân tử (molecular pharmacology) môn khoa học nghiên cứu tương tác thuốc lên thể sống cấp độ phân tử tế bào, gồm hai phân mơn dược động học (pharmacokinetics) dược lực học (pharmacodynamics) Dược lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu tác dụng phân tử thuốc đến toàn thể Dựa vào hiểu biết hóa sinh, sinh lý, bệnh học, sinh học phân tử hóa hữu để thấy rõ tác dụng thuốc mức độ phân tử đưa đến áp dụng điều trị Qua dược lý phân tử, hiểu sâu sắc chế phân tử tác dụng thuốc, phát thuốc mới, đề xuất hướng dẫn sử dụng thuốc an toàn, hiệu điều trị ngăn chặn phản ứng có hại thuốc sử dụng Nội dung chủ yếu dược lý phân tử dược lý học tác dụng thuốc mức tế bào [2] Dược lý phân tử thể nhiều giai đoạn phân tử thuốc thể, dược lý phân tử nghiên cứu với hướng là: 1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào 2) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử thụ thể màng tế bào 3) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử enzym tế bào 4) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử gen 1.2 Các đích tác dụng thuốc Theo phân tích Overington cộng [38] 21.000 sản phẩm thuốc lưu hành thị trường Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dạng thành phần, dạng muối, vitamin Trong có 1204 thuốc phân tử nhỏ, 166 thuốc sinh học Khoảng 27% thuốc liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ thể nhân, 7,9% tới thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.1) [38] Các thụ thể GPCR Các thụ thể nhân Các kênh ion liên kết phối tử Các kênh ion điện Protein liên kết penicillin Enzyme giống myeloperoxidase Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh DNA topoisomerase typ II Fibronectin typ III Cytochrome P450 Hình 1.1 Phân bố họ gen với đích tác dụng thuốc ( Nguồn: Overington, 2006) Hầu hết thuốc tác dụng lên thể, tế bào thông qua số chế phân tử khác Mỗi chế thích ứng thơng qua tiến hóa họ protein riêng, giúp truyền nhiều loại tín hiệu Các họ protein bao gồm thụ thể bề mặt bên tế bào với enzym thành phần khác giúp tạo ra, khuếch đại, phối hợp kết thúc tín hiệu từ phân tử tác động thuốc chất nội sinh Có chế truyền tín hiệu qua màng tế bào (hình 1.2) [28] Mỗi loại sử dụng chiến lược khác để vượt qua rào cản lớp kép phospholipid màng tế bào Các chiến lược sử dụng (1) phối tử (ligand) tan lipid vượt qua màng sinh chất tác động lên thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể xun màng có hoạt tính enzym nội bào điều khiển dị lập thể phối tử liên kết vào vị trí miền ngoại bào protein này; (3) thụ thể xuyên màng liên kết kích thích protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tương tác với phối tử ( điều khiển hoạt động kênh liên kết với phối tử); (5) protein thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ điều khiển chất truyền tin thứ tế bào Hình 1.2 Các chế truyền tín hiệu Cơ chế thứ (1) Một phân tử tín hiệu (phối tử) hóa học hịa tan lipid qua màng sinh chất tác động lên thụ thể nội bào (mà enzym yếu tố điều hòa phiên mã gen) (2) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào protein xuyên màng, qua kích hoạt hoạt tính enzym miền nội bào protein (3) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào thụ thể liên kết xuyên màng với protein kinase, làm kích hoạt protein kinase (4) Phân tử tín hiệu liên kết trực tiếp điều khiển việc mở kênh ion (5) phân tử tín hiệu liên kết với thụ thể bề mặt tế bào mà liên kết với enzym tác động G protein (A, C: chất; B, D: sản phẩm; R: thụ thể; G: G protein; E: tác động (enzym kênh ion); Y: tyrosine; P: phosphate) (Nguồn: Katzung, 2007) Các đích phân tử phần lớn dược phẩm bao gồm nhóm nêu mục [48]: 1.2.1 Thụ thể kết cặp G protein (GPCR) Hơn 26% thuốc bán thị trường có liên quan tới nhóm thụ thể này; nhóm thụ thể phổ biến biểu bề mặt nhiều loại tế bào Protein liên kết vào màng tế bào thông qua lần xun màng, cịn gọi với tên khác thụ thể lần xuyên màng (hay 7TM) Các G protein phân tử kết cặp với loại thụ thể để truyền tín hiệu sinh sau phối tử (hay chất gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể truyền tín hiệu vào tế bào Hệ gen người có 1000 gen mã hóa cho GPCR, ước tính có khoảng 400 GPCR có angiotensin II Và dải nồng độ phối tử đặc hiệu xác định khoảng từ 10-11 M - 10-8 M Đây khoảng nồng độ phù hợp cho việc xác định nồng độ phối tử phản ứng liên kết thụ thể - phối tử, phản ứng thường đo khoảng nM (10-9 M) 3.3 Tối ƣu nồng độ protein thụ thể phản ứng liên kết Để thực thí nghiệm liên kết thụ thể phối tử tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm Thí nghiệm thực với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml Nồng độ phối tử đặc hiệu F-AT II phản ứng 10-8 M, nồng độ tham khảo từ nghiên cứu trước thụ thể với phối tử đặc hiệu AT II đánh dấu phóng xạ [47] Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ protein với phối tử Kết trình bày hình 3.6, cho thấy nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu với thụ thể đích tăng dần nồng độ protein 10 mg/ml, phản ứng bắt đầu đạt giá trị tối đa Từ kết này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử chúng tơi thực thí nghiệm 10 mg/ml 45 Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử thực Giá trị thời gian ủ phù hợp 40 phút 3.4 Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hịa) Với điều kiện thí nghiệm tối ưu, thời gian ủ 40 phút, nồng độ protein thụ thể 10 mg/ml xác định thơng qua thí nghiệm trước đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm để xác định giá trị Kd Bmax đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT II Thí nghiệm thực với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10-7 M đến 10-9 M Hình 3.7 Phản ứng bão hòa thụ thể angiotensin II với F-AT II Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mô hình vị trí liên kết (one site binding model), giá trị Kd tính tốn 11,38 nM, kết tương đồng với nghiên cứu cơng bố trước với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47] Như vậy, angiotensin II đánh dấu fluorescein nghiên cứu cho kết khả quan so sánh với phương pháp công bố, ảnh hưởng việc gắn thêm gốc fluorescein có khơng làm ảnh hưởng nhiều đến kết phương pháp 46 3.5 Phản ứng cạnh tranh F-AT II với phối tử biết Để xác định xác khả thay phương pháp sử dụng angiotensin II đánh dấu fluorecein so với phương pháp truyền thống (sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ), chúng tơi thực thí nghiệm liên kết cạnh tranh F-AT II với phối tử biết thụ thể đích Các phối tử cạnh tranh chọn angiotensin II không đánh dấu, chất đối vận angiotensin II dùng làm thuốc phổ biến losartan (là thuốc bán chạy nay) Giá trị Ki thu được so sánh với giá trị Ki cơng bố phương pháp khác a b Hình 3.8 Sự cạnh tranh angiotensin II (a) losartan (b) với F-AT II liên kết với thụ thể angiotensin II Sự ức chế phối tử với F-AT II thụ thể thu từ gan chuột với AT II (dải nồng độ từ 10-12 – 10-4 M) losartan (dải nồng độ từ 10-10 – 10-2 M) Kết thu được xử lý, biểu diễn hình 3.8 Giá trị K i AT II losartan 13x10-9 M 3,6x10-7 M Giá trị Ki AT II nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu công bố trước [7, 48], so sánh với giá trị Kd F-AT II nghiên cứu ta thấy có tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II phối tử không đánh dấu AT II khơng có nhiều khác biệt lực Điều củng cố thêm đánh giá ổn định lực phối tử đánh dấu fluorescein sử dụng nghiên cứu 47 lĩnh vực khác thụ thể angiotensin II nghiên cứu đề cập phần tổng quan tài liệu Giá trị Ki losartan xác định cao nghiên cứu khác xác định nghiên cứu chúng tơi, lý giải điều là thuốc mua từ nhà thuốc, có thêm chất khác bổ sung độ tinh khiết không cao, dùng nghiên cứu khác Mặc dù vậy, việc sử dụng phối tử cạnh tranh với phối tử đánh dấu cho thấy phương pháp cho kết xác cao, áp dụng Việt Nam để thay cho việc sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng nước phát triển Hơn nữa, phù hợp với nghiên cứu đánh giá bước đầu để sàng lọc dịch chiết có tác dụng hoạt động thụ thể đích 3.6 Nghiên cứu sàng lọc số dịch chiết thực vật Trong nghiên cứu này, kiểm tra khả cạnh tranh 12 dịch chiết methanol loài thuốc sử dụng y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, tác dụng liên quan giãn mạch Các loài bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus philippensis Cham & Schl Ban.) Đây thuốc sử dụng lâu đời thuốc y học cổ truyền, sử dụng rộng rãi, tham khảo tài liệu “cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam” viện Dược liệu biên soạn Cây tầm gửi (Taxillus philippensis Cham & Schl Ban.) ý với số cơng bố Các thí nghiệm liên kết tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào phép thử 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm mình, chúng tơi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng dung mơi chiết đến thí nghiệm Dịch chiết mẫu kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml 1000 µg/ml 48 Với mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 PEI081101) Giá trị IC50 thu 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 0,7 ± 0,6 Kết cho thấy mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng F-AT II với thụ thể angiotensin II cao Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị Ki mẫu tính tốn 1,2; 0,8 0,5 µg/ml 0,01 0,1 10 100 1000 Log [dịch chiết], µg/ml Hình 3.9 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết cỏ mần trầu Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  PEI081101 (a);  PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c) Với mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC50 thu đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với mẫu 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 0,5 ± 0,3) Điều cho thấy, dịch chiết có khả ức chế cao phản ứng tương tác thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu Giá trị Ki mẫu trung bình khoảng 0,8 µg/ml Kết cho thấy, có chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể angiotensin II mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu hạ khô thảo Đây cần ý nghiên cứu sâu đề tài 49 Log [dịch chiết], µg/ml Hình 3.10 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết hạ khô thảo Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  LPV081101 (d);  LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f) Log [dịch chiết], µg/ml Hình 3.11 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết hòe Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  FSJ081101 (j);  FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l) 50 Log [dịch chiết], µg/ml Hình 3.12 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết tầm gửi Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  LTP081101 (g);  LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i) Hình 3.11 3.12 biểu diễn đồ thị ức chế mẫu hòe tầm gửi với phản ứng thụ thể angiotensin II F-AT II Kết thu từ thí nghiệm cho thấy: mẫu dịch chiết từ nụ hịe có tiềm lực ức chế yếu cỏ mần trầu hạ khô thảo (hình 3.10) mẫu thử hịe cho IC50 có khả ức chế mạnh với mẫu FSJ081101 (IC50 = 13 ± µg/ml) yếu mẫu FSJ081102 (IC50 = 71 ± 45 µg/ml) Ki thu mẫu hịe từ 9,2 đến 93,5 µg/ml Trong mẫu dịch chiết tầm gửi thể khả ức chế yếu với giá trị IC50 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103) Bảng 3.1 IC50 Ki mẫu dịch chiết nghiên cứu Dịch chiết Mẫu IC50 (g/mL) Ki (g/mL) PEI081101 1.1 ± 0.5 0.8 0.7 ± 0.6 0.5 1.1 ± 0.4 0.8 LPV081102 0.8 ± 0.6 0.6 LPV081103 Sophora japonica – Hòe PEI081102 LPV081101 Prunella vulgaris – Hạ khô thảo 1.2 PEI081103 Eleusine indica – Cỏ mần trầu 1.6 ± 0.3 0.5 ± 0.3 0.3 FSJ081101 13 ± 9.2 51 71 ± 45 52.7 FSJ081103 26 ± 19.2 LTP081101 126 ± 32 330 ± 80 800 ± 53 FSJ081102 Taxillus philippensis – Tầm gửi LTP081102 LTP081103 52 93.5 243.9 591.7 Chƣơng KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, xin đưa số kết luận sau: Ngiên cứu xây dựng thành công phương pháp đánh giá tương tác thụ thể angiotensin II thu từ gan chuột với phối tử đặc hiệu không đánh dấu phóng xạ (fluorescein-angiotensin II), dựa phương pháp ELISA Nghiên cứu củng cố thêm việc sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein (F-AT II) cho kết thí nghiệm liên kết thụ thể angiotensin II tương đương với phương pháp sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ truyền thống Đã chiết xuất thành cơng dịch chiết methanol 12 mẫu thực vật loài bao gồm: Cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaerth.), Hạ khơ thảo (Prunella vulagaris L.), Hịe (Sophora japonica Linn.), Tầm gửi (Taxillus philippensis (Cham & Sch.) Ban) từ địa điểm khác để tiến hành phép thử sinh học Các dịch chiết thực vật thuốc sử dụng y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, thử nghiệm với phương pháp cho kết với dịch chiết mẫu cỏ mần trầu hạ khô thảo, thu giá trị IC50 xoay quanh 0,8 µg/ml 1,1 µg/ml, giá trị Ki xác định theo phương trình Cheng-Prusoff tương ứng khoảng 0,6 µg/ml 0,8 µg/ml Như vậy, cỏ mần trầu hạ khơ thảo có khả ức chế cao phản ứng thụ thể angiotensin II phối tử đặc hiệu fluoresceinangiotensin II Hòe cho kết IC50 thể ức chế yếu với tương tác thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu với giá trị Ki trung bình 27 µg/ml tầm gửi, giá trị Ki trung bình ba mẫu lên đến 309 µg/ml cho thấy mẫu có ức chế yếu tương tác phối tử đặc hiệu với thụ thể angiotensin II 53 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu với dịch chiết thuốc khác sử dụng y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp với thụ thể angiotensin II Nghiên cứu sâu thành phần hóa học dịch chiết cỏ mần trầu hạ khô thảo Đồng thời tiến hành thu phân đoạn hóa học dịch chiết tiến hành nghiên cứu để xác định phân đoạn chất có tác dụng ức chế liên kết angiotensin II với phối tử đặc hiệu Nghiên cứu phương pháp xác định tương tác thụ thể angiotensin II phối tử F-AT II, sử dụng phương pháp đo huỳnh quang (fluorescein gốc huỳnh quang) Tiến hành nghiên cứu với thụ thể GPCR khác với phương pháp sử dụng phối tử đặc hiệu có gắn fluorescein để thay cho phương phác sử dụng đồng vị phóng xạ truyền thống 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tăng huyết áp điều trị y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006), Bệnh tăng huyết áp: chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đốn điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Ayensu E.S., DeFilipps R.A (1978), Endangered and Threatened Plants of the United States Washington, DC:Smithsonian Institution Beck-Sickinger, A.G (1996), Structural characterization and binding sites of Gprotein-coupled receptors Drug Discovery Today, 1:502–513 Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al (1992), Cloning and characterization of a human angiotensin II type receptor Biochem Biophys Res Commun, 183:989995 Berk BC, Corson MA (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases Circ Res, 80:607-616 Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM (1990), Receptor-effector coupling of G proteins Biochim Biophys Acta, 1031:163–224 55 10 Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H (1988), Characterization of the angiotensin II receptor in primary cultures of rat hepatocytes J Biol Chem, 263(29): 14913 – 14919 11 Bradford M.M (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem 72: 248–254 12 Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM (2000), Role of the angiotensin type receptor in the regulation of blood pressure and renal function Hypertension, 35:155-163 13 Curnow KM, Pascoe L, White PC (1992), Genetic analysis of the human type-1 angiotensin II receptor Mol Endocrinol, 6:1113-1118 14 Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons; 2003 15 Cheng YC, Prusoff WH (1973), Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction J Biochem Pharmacol, 22: 3099 –3103 16 de Jong L.A., Uges D.R., Franke J.P., Bischoff R., (2005), Receptor-ligand binding assays: technologies and applications J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 829: 1–25 17 Ernst, E (1999), Efficacy of Herbal Medicine: Do they Work and Are they Safe?, Pharmaceutical News, Focus on Contemporary Medicine, Special Issue, p 17 18 Fabricant D.S., Farnsworth N.R (2011), The value of plants used in traditional medicine for drug discovery Environ Health Perspect, 109:69–75 19 Farnsworth N.R., Akerele O., Bingel A.S., Soejarto D.D., Guo Z (1985), Medicinal plants in therapy Bull WHO 63:965–981 20 Fourth Country Report: Vietnam’s Implementation of the Biodiversity Convention, ASEAN Biodiversity Magazine 56 21 Gonzalez-Villalobos R, Klassen RB, Allen PL, Navar LG, Hammond TG ((2005)), Megalin binds and internalizes angiotensin II Am J Physiol Renal Physiol, 288:F420-F427 22 Guo D.F., Sun Y.L., Hamet P., Inagami T (2001), The angiotensin II type receptor and receptor-associated proteins Cell Research, 11, 165–180 23 Harmer, I.J and Samuel, D (1989), The FITC-anti-FITC system is a sensitive alternative to biotin- streptavidin in ELISA J Immunol Methods, 122 115-122 24 Hernandez-Presa M., Bustos C., Ortego M., et al.(1997), Angiotensin-converting enzyme inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, and macrophage infiltration in a rabbit model of early accelerated atherosclerosis Circulation, 95:1532-1541 25 Hoe K.L., Saavedra J.M (2002), Site-directed mutagenesis of the gerbil and human angiotensin II AT(1) receptors identifies amino acid residues attributable to the binding affinity for the nonpeptidic antagonist losartan Mol Pharmacol., Jun;61(6):1404-15 26 Janssen MJ, Ensing K, de Zeeuw RA (2001), A fluorescent receptor assay for benzodiazepines using coumarin-labeled desethylflumazenil as ligand Anal Chem Jul 1;73(13):3168-73 27 Jourdain E., et al (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies among Wild Bird Species PLoS One 6:e24155 28 Katzung B.G (2007), Basis and clinical pharmacology, 10th ed McGraw Hill, LANGE 29 Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I (1970), Radioreceptor Assay of Adrenocorticotropic Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide Hormones in Plasma Science 170: 633 30 Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL (2006), AT1 receptor-mediated accumulation of extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases Am J Physiol Renal Physiol, 291:F375-F383 57 31 Lloyd R.V ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology techniques Humana Press 32 Lundstrom K.H and Chiu M.L (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery, CRC Press Taylor & Francis Group, 33 Mahoney CW (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of binding of platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor receptor beta-extracellular domain using biotinylated ligand with enzyme-linked immunosorbent assay Anal Biochem., 276(1):106-8 34 Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al (1995), The angiotensin II type (AT2) receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gainof-function study using gene transfer Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667 35 Noda K, Feng YH, Liu XP, et al (1996), The active state of the AT1 angiotensin receptor is generated by angiotensin II induction Biochemistry, 35:1643516442 36 Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal method for detecting skin ulceration in fish Vet Pathol 39:726–731 37 Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of plants and animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic Southeast Asia report, Published by TRAFFIC 38 Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L (2006), How many drug targets are there? Nature Rev Drug Discov 5: 993–996 39 Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ (2002), Seven-transmembrane receptors Nature Rev, 3:639–650 40 Regard JB, Sato IT and Coughlin SR (2008), Anatomical profiling of G protein-coupled receptor expression Cell, Volume 135, Issue 3, 561-571 41 Rong Y.P., et al (2009), The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor Proc Natl Acad Sci USA, 106:14397-402 58 42 Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, et al (2000), Angiotensin II activates nuclear transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) in vascular smooth muscle cells: molecular mechanisms Circ, 86:1266-1272 43 Solecki R., Shanidar I.V (1975), A Neanderthal flower burial in northern Iraq Science 190:880–881 44 Takeuchi T, Tanaka S, Rechnitz GA (1992), Biotinylated 1012-S conjugate as a probe ligand for benzodiazepine receptors: characterization of receptor binding sites and receptor assay for benzodiazepine drugs Anal Biochem., 203(1):15862 45 Trevor A.J, Katzung B.G, Maters S.B (2010), Pharmacology examination and board review, 9th ed McGraw Hill, LANGE; 2010 46 Vogle H.G (2002), Drug discovery and evaluation: pharmacology assays 2nd ed Springer 47 Widdowson P.S., Renouard A., Vilaine J.P (1993), Binding of [3H]angiotensin II and [3H]DuP753 (losartan) to rat liver homogenates reveals multiple sites Relationship of AT1a and AT1b-type angiotensin receptors and novel nonangiotensin binding sites Peptides, 14(4): 829 – 837 48 World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005, Geneva 49 Zander E.D (2011), The Science and Business of Drug Discovery Springer 59 ... chất phóng xạ Vì lý đó, tiến hành đề tài ? ?Xây dựng phƣơng pháp đo tƣơng tác thụ thể phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hƣớng phát triển thuốc Việt Nam? ?? nhằm tiến tới ứng dụng. .. NHIÊN - Nguyễn Anh Lƣơng XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHƠNG SỬ DỤNG PHĨNG XẠ PHỤC VỤ ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học... kết thụ thể- phối tử hoạt tính phóng xạ Các phép thử liên kết thụ thể - phối tử phổ biến dạng không đồng phát triển sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ để liên kết với thụ thể màng Phương pháp định