Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra khả năng cạnh tranh của 12 dịch chiết methanol của 4 loài cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, và các tác dụng liên quan như giãn mạch. Các loài này bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.). Đây là các cây thuốc được sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền, hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi, được chúng tôi tham khảo trong tài liệu “cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” do viện Dược liệu biên soạn. Cây tầm gửi (Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.) là một cây đang được chú ý với một số công bố mới hiện nay.
Các thí nghiệm liên kết được tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào các phép thử dưới 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm của mình, chúng tôi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng của dung môi chiết đến thí nghiệm. Dịch chiết của các mẫu được kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml cho đến 1000 µg/ml.
49
Với các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 và PEI081101). Giá trị IC50 thu được lần lượt là 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 và 0,7 ± 0,6. Kết quả này cho thấy các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng giữa F-AT II với thụ thể angiotensin II cao. Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị Ki của các mẫu được tính toán là 1,2; 0,8 và 0,5 µg/ml.
Hình 3.9. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần trầu. Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu PEI081101 (a);
PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c).
Với các mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC50 thu được đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với các mẫu là 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 và 0,5 ± 0,3). Điều này cho thấy, các dịch chiết này có khả năng ức chế cao phản ứng tương tác giữa thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó. Giá trị Ki của các mẫu này trung bình là khoảng 0,8 µg/ml. Kết quả cho thấy, có thể có những chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể angiotensin II trong các mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu và hạ khô thảo. Đây là những cây cần được chú ý cùng trong các nghiên cứu sâu hơn của đề tài này.
0 0,01 0,1 1 10 100 1000
50
Hình 3.10. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hạ khô thảo. Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu LPV081101 (d);
LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f).
Hình 3.11. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hòe.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu FSJ081101 (j);
FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l).
Log [dịch chiết], µg/ml
51
Hình 3.12. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu LTP081101 (g);
LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i).
Hình 3.11 và 3.12 biểu diễn đồ thị ức chế của các mẫu hòe và tầm gửi trong với phản ứng thụ thể angiotensin II và F-AT II. Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy: các mẫu dịch chiết từ nụ hòe có tiềm lực ức chế yếu hơn của cỏ mần trầu và hạ khô thảo (hình 3.10). 3 mẫu thử của hòe cho IC50 có khả năng ức chế mạnh nhất với mẫu FSJ081101 (IC50 = 13 ± 2 µg/ml) và yếu nhất là mẫu FSJ081102 (IC50 = 71 ± 45 µg/ml). Ki thu được của các mẫu hòe là từ 9,2 đến 93,5 µg/ml. Trong khi đó các mẫu dịch chiết của tầm gửi thể hiện khả năng ức chế rất yếu với giá trị IC50 trên 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103).
Bảng 3.1. IC50 và Ki của các mẫu dịch chiết trong nghiên cứu
Dịch chiết Mẫu IC50 (g/mL) Ki (g/mL)
Eleusine indica – Cỏ mần trầu
PEI081101 1.6 ± 0.3 1.2
PEI081102 1.1 ± 0.5 0.8
PEI081103 0.7 ± 0.6 0.5
Prunella vulgaris – Hạ khô thảo
LPV081101 1.1 ± 0.4 0.8
LPV081102 0.8 ± 0.6 0.6
LPV081103 0.5 ± 0.3 0.3
Sophora japonica – Hòe FSJ081101 13 ± 2 9.2
52
FSJ081102 71 ± 45 52.7
FSJ081103 26 ± 9 19.2
Taxillus philippensis – Tầm gửi
LTP081101 126 ± 32 93.5
LTP081102 330 ± 80 243.9
53
Chƣơng 4. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi xin đưa ra một số kết luận sau:
1. Ngiên cứu này đã xây dựng thành công phương pháp đánh giá tương tác giữa thụ thể angiotensin II thu được từ gan chuột với phối tử đặc hiệu không đánh dấu phóng xạ (fluorescein-angiotensin II), dựa trên phương pháp ELISA. Nghiên cứu này cũng củng cố thêm việc sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein (F-AT II) cho kết quả thí nghiệm liên kết thụ thể angiotensin II tương đương với phương pháp sử dụng các phối tử đánh dấu phóng xạ truyền thống.
2. Đã chiết xuất thành công dịch chiết methanol của 12 mẫu thực vật của 4 loài bao gồm: Cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaerth.), Hạ khô thảo (Prunella vulagaris L.), Hòe (Sophora japonica Linn.), và Tầm gửi (Taxillus philippensis (Cham. & Sch.) Ban) từ các địa điểm khác nhau để tiến hành các phép thử sinh học.
3. Các dịch chiết thực vật của các cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, được thử nghiệm với phương pháp này đã cho kết quả với dịch chiết của các mẫu cỏ mần trầu và hạ khô thảo, thu được giá trị IC50 xoay quanh 0,8 µg/ml và 1,1 µg/ml, giá trị Ki xác định theo phương trình Cheng-Prusoff tương ứng là khoảng 0,6 µg/ml và 0,8 µg/ml. Như vậy, cỏ mần trầu và hạ khô thảo có khả năng ức chế khá cao phản ứng giữa thụ thể angiotensin II và phối tử đặc hiệu fluorescein- angiotensin II. Hòe cho kết quả IC50 thể hiện sự ức chế yếu hơn với tương tác thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu với giá trị Ki trung bình là 27 µg/ml và đối với tầm gửi, giá trị Ki trung bình của ba mẫu lên đến 309 µg/ml cho thấy các mẫu này có sự ức chế rất yếu đối với tương tác phối tử đặc hiệu với thụ thể angiotensin II.
54
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục tiến hành các nghiên cứu với dịch chiết của các cây thuốc khác được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp với thụ thể angiotensin II.
2. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của dịch chiết cỏ mần trầu và hạ khô thảo. Đồng thời tiến hành thu các phân đoạn hóa học của các dịch chiết này và tiến hành các nghiên cứu để xác định phân đoạn chất nào có tác dụng ức chế liên kết angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó.
3. Nghiên cứu phương pháp xác định tương tác thụ thể angiotensin II và phối tử F-AT II, sử dụng phương pháp đo huỳnh quang (fluorescein là gốc huỳnh quang).
4. Tiến hành các nghiên cứu với các thụ thể GPCR khác với phương pháp sử dụng phối tử đặc hiệu có gắn fluorescein để thay thế cho phương phác sử dụng đồng vị phóng xạ truyền thống.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong và các cộng sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I và II, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. Tăng huyết áp và điều trị trong y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam.
4. Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006),
Bệnh tăng huyết áp: cơ chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán và điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
5. Ayensu E.S., DeFilipps R.A. (1978), Endangered and Threatened Plants of the United States. Washington, DC:Smithsonian Institution.
6. Beck-Sickinger, A.G. (1996), Structural characterization and binding sites of G- protein-coupled receptors. Drug Discovery Today, 1:502–513.
7. Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al. (1992), Cloning and characterization of a human angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 183:989- 995.
8. Berk BC, Corson MA. (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res, 80:607-616.
9. Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM. (1990), Receptor-effector coupling of G proteins. Biochim Biophys Acta, 1031:163–224.
56
10. Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H. (1988), Characterization of the angiotensin II receptor in primary cultures of rat hepatocytes. J Biol Chem, 263(29): 14913 – 14919.
11. Bradford M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,
Anal. Biochem. 72: 248–254.
12. Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. (2000), Role of the angiotensin type 2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function. Hypertension, 35:155-163.
13. Curnow KM, Pascoe L, White PC. (1992), Genetic analysis of the human type-1 angiotensin II receptor. Mol Endocrinol, 6:1113-1118.
14. Current Protocols in Molecular Biology.. John Wiley & Sons; 2003.
15. Cheng YC, Prusoff WH. (1973), Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction. J Biochem Pharmacol, 22: 3099 –3103.
16. de Jong L.A., Uges D.R., Franke J.P., Bischoff R., (2005), Receptor-ligand binding assays: technologies and applications. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 829: 1–25.
17. Ernst, E. (1999), Efficacy of Herbal Medicine: Do they Work and Are they Safe?, Pharmaceutical News, Focus on Contemporary Medicine, Special Issue, p. 17.
18. Fabricant D.S., Farnsworth N.R. (2011), The value of plants used in traditional medicine for drug discovery. Environ Health Perspect, 109:69–75.
19. Farnsworth N.R., Akerele O., Bingel A.S., Soejarto D.D., Guo Z. (1985), Medicinal plants in therapy. Bull WHO 63:965–981.
20. Fourth Country Report: Vietnam’s Implementation of the Biodiversity Convention, ASEAN Biodiversity Magazine.
57
21. Gonzalez-Villalobos R, Klassen RB, Allen PL, Navar LG, Hammond TG. ((2005)), Megalin binds and internalizes angiotensin II. Am J Physiol Renal Physiol, 288:F420-F427.
22. Guo D.F., Sun Y.L., Hamet P., Inagami T. (2001), The angiotensin II type 1 receptor and receptor-associated proteins. Cell Research, 11, 165–180.
23. Harmer, I.J. and Samuel, D. (1989), The FITC-anti-FITC system is a sensitive alternative to biotin- streptavidin in ELISA. J. Immunol. Methods, 122. 115-122. 24. Hernandez-Presa M., Bustos C., Ortego M., et al.(1997), Angiotensin-converting
enzyme inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, and macrophage infiltration in a rabbit model of early accelerated atherosclerosis. Circulation, 95:1532-1541.
25. Hoe K.L., Saavedra J.M. (2002), Site-directed mutagenesis of the gerbil and human angiotensin II AT(1) receptors identifies amino acid residues attributable to the binding affinity for the nonpeptidic antagonist losartan. Mol Pharmacol.,
Jun;61(6):1404-15.
26. Janssen MJ, Ensing K, de Zeeuw RA. (2001), A fluorescent receptor assay for benzodiazepines using coumarin-labeled desethylflumazenil as ligand. Anal Chem. Jul 1;73(13):3168-73.
27. Jourdain E., et al. (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies among Wild Bird Species.PLoS One6:e24155.
28. Katzung B.G. (2007), Basis and clinical pharmacology, 10th ed. McGraw Hill, LANGE.
29. Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I. (1970), Radioreceptor Assay of Adrenocorticotropic Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide Hormones in Plasma. Science 170: 633.
30. Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL. (2006), AT1 receptor-mediated accumulation of extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases. Am J Physiol Renal Physiol, 291:F375-F383.
58
31. Lloyd R.V. ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology techniques. Humana Press.
32. Lundstrom K.H. and Chiu M.L. (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery, CRC Press Taylor & Francis Group,.
33. Mahoney CW. (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of binding of platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor receptor beta-extracellular domain using biotinylated ligand with enzyme-linked immunosorbent assay. Anal Biochem., 276(1):106-8.
34. Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al. (1995), The angiotensin II type 2 (AT2) receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain- of-function study using gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667. 35. Noda K, Feng YH, Liu XP, et al. (1996), The active state of the AT1 angiotensin receptor is generated by angiotensin II induction. Biochemistry, 35:16435- 16442.
36. Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal method for detecting skin ulceration in fish. Vet Pathol 39:726–731.
37. Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of plants and animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic Southeast Asia report, Published by TRAFFIC.
38. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. (2006), How many drug targets are there? Nature Rev. Drug Discov. 5: 993–996.
39. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. (2002), Seven-transmembrane receptors.
Nature Rev, 3:639–650.
40. Regard JB, Sato IT and Coughlin SR.. (2008), Anatomical profiling of G protein-coupled receptor expression. Cell, Volume 135, Issue 3, 561-571.
41. Rong Y.P., et al. (2009), The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 106:14397-402.
59
42. Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, et al. (2000), Angiotensin II activates nuclear transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) in vascular smooth muscle cells: molecular mechanisms. Circ, 86:1266-1272.
43. Solecki R., Shanidar I.V. (1975), A Neanderthal flower burial in northern Iraq.
Science 190:880–881.
44. Takeuchi T, Tanaka S, Rechnitz GA. (1992), Biotinylated 1012-S conjugate as a probe ligand for benzodiazepine receptors: characterization of receptor binding sites and receptor assay for benzodiazepine drugs. Anal Biochem., 203(1):158- 62.
45. Trevor A.J, Katzung B.G, Maters S.B. (2010), Pharmacology examination and board review, 9th ed. McGraw Hill, LANGE; 2010.
46. Vogle H.G. (2002), Drug discovery and evaluation: pharmacology assays. 2nd ed. Springer.
47. Widdowson P.S., Renouard A., Vilaine J.P. (1993), Binding of [3H]angiotensin II and [3H]DuP753 (losartan) to rat liver homogenates reveals multiple sites. Relationship of AT1a and AT1b-type angiotensin receptors and novel nonangiotensin binding sites. Peptides, 14(4): 829 – 837.
48. World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005, Geneva.