Quy trình thu protein từ gan chuột được tham khảo từ các nghiên cứu được công bố trước đây [46].
38
4 g mô gan chuột Swiss trắng, đã để lạnh ở -200C qua đêm, được cắt thành mảnh nhỏ, bổ sung 8 ml đệm nghiền (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4).
Hỗn hợp được nghiền bằng máy nghiền đồng thể Ultra-Turrax T25 Basic (IKA, Germany) cho đến khi thu được dịch đồng nhất, sau đó chuyển dịch nghiền vào các ống falcon có dung tích phù hợp.
Ly tâm ống 1.000 g ở 40C trong 10 phút, thu dịch pha trên. Dịch pha trên được ly tâm ở 36.000 g ở 40C trong 15 phút, thu tủa và rửa tủa thu được 2 lần với đệm nghiền.
Tủa thu được sau khi ly tâm được hòa trong đệm ủ (Tris 50 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4).
Chú ý: các thao tác được thực hiện nhanh, trên đá để hạn chế sự biến tính mẫu. Xác định nồng độ protein thu được từ mô gan sau khi nghiền đồng thể bằng phương pháp Bradford [11]. Bảo quản ở protein ở -800C cho đến khi dùng trong các phản ứng liên kết.
2.2.3. Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford
Nồng độ protein thu được từ mô gan được đo bằng phương pháp Bradford với protein chuẩn là BSA.
Đường chuẩn được thiết lập với các nồng độ lần lượt là 200, 400, 600, 800 và 1000 µg/ml dung dịch BSA, với chất màu là dung dịch coomassie blue G250.
Mẫu protein cần xác định nồng độ được pha loãng với các nồng độ 1, 1/10, 1/100 và 1/1000 so với nồng độ gốc.
Từ đường chuẩn và giá trị OD595 của các nồng độ pha loãng của mẫu protein cần đo ta xác định đươc nồng độ chính xác của mẫu. Giá trị nồng độ này được dùng để thực hiện các thí nghiệm liên kết tiếp theo.
39
2.2.4. Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn fluorescein
100 µl fluorescein-BSA ở nồng độ thích hợp pha với đệm PBS 1X, pH 7,2 được phủ lên bề mặt mỗi giếng phản ứng trên đĩa 96 giếng.
Đĩa được ủ qua đêm ở 40C, sau đó rửa đĩa bằng đệm rửa (PBS 1X pH 7,4 có bổ sung Tween 20 (0,05%)) 3 lần.
Bổ sung 200 µl dung dịch blocking buffer (BSA 5%, PBS 1X pH 7,4) để khóa các vị trí trống trong giếng hạn chế sự hấp phụ của các thành phần thí nghiệm khác lên bề mặt đĩa (như kháng thể có gắn enzym) gây ra sai số thí nghiệm, ủ 1h ở nhiệt độ phòng (240C). Sau đó rửa đĩa bằng đệm rửa 3 lần.
Hút 100 µl kháng thể kháng fluorescein, cho vào mỗi giếng, ủ đĩa trong 2h 30 phút ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ đĩa. Sau khi đã ủ xong, rửa đĩa 5 lần bằng đệm ủ.
Bổ sung 100 µl dung dịch phát triển màu (ABTS 1X, H2O2 0,03%, trong đệm citrate 0,1 M pH 4,2). Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Dừng phản ứng bằng cách cho 100 µl dung dịch SDS 1% và đo OD405 để thu được kết quả.
2.2.5. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay)
Để xác định sự tương tác của thụ thể angiotensin trên màng tế bào với các chất chuẩn là fluorescein-angiotensin II (pha trong blocking buffer), 500 µl thụ thể được ủ với 100 µl phối tử (fluorescein-angiotensin II) để tổng thể tích là 600 ul.
Ủ và lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian tối ưu, sau đó ly tâm 10.000 g trong 1 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi. Phối tử liên kết đặc hiệu sẽ được phá vỡ liên kết bằng cách bổ sung 100 µl dung dịch angiotensin II (phối tử đặc hiệu, không gắn fluorescein) ở nồng độ cao (10-4M).
40
Ly tâm 20.000 g ở 40C trong 15 phút. Dịch nổi có chứa fluorescein- angiotensin II sẽ được chuyển sang đĩa elisa để xác định lượng đã liên kết với thụ thể angiotensin II.
2.2.6. Phản ứng tương tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích
Sự tương tác giữa phối tử đặc hiệu đã biết và các dịch chiết thông qua thụ thể đích được xác định gián tiếp qua phản ứng cạnh tranh giữa các phối tử hay dịch chiết này với phối tử gắn fluorescein (fluorescein-angiotensin II).
Ở các thí nghiệm này, nồng độ thụ thể và nồng độ phối tử đánh dấu được giữ cố định còn phối tử đã biết (angiotensin II không đánh dấu fluorescein và losartan) và dịch chiết thực vật được đưa vào phản ứng với các nồng độ khác nhau.
Nồng độ phối tử đã biết trong dãy từ 10-3M đến 10-10M; còn đối dịch chiết thực vật dải nồng độ dịch chiết đưa vào là từ 0,01µg/ml, 0,1µg/ml, 1µg/ml, đến 1000µg/ml. Thể tích dịch chiết đưa vào mỗi thí nghiệm không quá 5% (thể tích/thể tích), trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện với thể tích dịch chiết methanol đưa vào là 6µl trên tổng thể tích phản ứng là 600µl. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả.
Các kết quả thí nghiệm được xử lý và phân tích sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.04 (GraphPad Software Inc., USA).
41
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan
Ở chuột và thỏ, có hai nhóm phụ thụ thể angiotensin II khác nhau, là thụ thể Agtr1 (hay Agtr1a, hoặc AT1A) và Agtr1b (hay AT1B). Hai loại thụ thể này do các gen khác nhau quy định có trình tự tương đồng quan trọng trong vùng mã hóa. Các thụ thể này tương đồng về ái lực với với angiotensin II và các chất đối vận không peptide và không thể phân biệt về mặt dược lý mặc dù chúng có sự phân bố khác nhau và được điều hòa khác nhau [25]. So sánh trình tự gen mã hóa thụ thể AT1 ở người và chuột, có tới hơn 95% trình tự axit amin tương đồng [22], và có ái lực tương đồng với chất chủ vận tự nhiên là angiotensin II [25].
Gan chuột là mô có sự phân bố của thụ thể angiotensin II cao thứ hai, chỉ sau tuyến thượng thận [40].
42
Hình 3.2. Sự phân bố của thụ thể Agtr1b ở chuột. (Nguồn: Regard, 2008). Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mô gan để thu protein thụ thể này do mô gan lớn hơn và thu mẫu cũng dễ dàng hơn.
Sau khi mẫu mô thu được được nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein thu được theo phương pháp của Bradford. Với BSA là protein chuẩn, đường chuẩn được xây dựng, với phương trình y = ax + b; trong đó y là giá trị OD ở bước sóng 595nm, còn x là giá trị nồng độ protein (mg/ml). Với các mẫu pha loãng từ mẫu protein gốc thu được sau khi nghiền đồng thể, sau khi đo OD595 ta tìm được giá trị OD của mẫu pha loãng trong giới hạn của đường chuẩn đã xây dựng, từ đó tính được nồng độ của mẫu pha loãng này rồi từ số lần pha loãng suy ngược ra nồng độ của mẫu protein gốc ban đầu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định được giá trị của nồng độ protein thu được từ gan chuột, nồng độ thu được là 50 mg/ml.
43
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn BSA trong phản ứng Bradford
3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA
Để tối ưu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định được lượng phối tử đặc hiệu F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp của phản ứng ELISA có thể xác định được.
44
Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA) ở các nồng độ 0,1; 0,5; và 1 µg/ml. Với mỗi nồng độ kháng nguyên như trên, chúng tối tiến hành với các nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase lần lượt ở các nồng độ pha loãng là từ 250 đến 8000 lần (theo giới hạn được khuyến cáo của nhà cung cấp). Kết quả thí nghiệm được trình bày trên hình 3.4. Từ kết quả này, chúng tôi xác định được một số nồng độ cho kết quả thí nghiệm đảm bảo các tiêu chí đó là cho kết quả OD ổn định, và giá trị OD405 ở trong khoảng giá trị đủ lớn (nếu giá trị OD nhỏ, sẽ cho sai số lớn khi kết quả có sự sai số). Tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm để tìm ra khoảng giới hạn về nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể, đó là angiotensin II được đánh dấu fluorescein (fluorescein-angiotensin II, ký hiệu F-AT II). Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh giữa F-AT II với kháng nguyên phủ trên đĩa trước đó (F-BSA), chúng ta có thể xác định được khả năng của phương pháp trong việc đo lượng phối tử liên kết thụ thể.
Hình 3.5 biểu diễn kết quả xác định đường chuẩn F-AT II được thiết lập với phản ứng elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa là 1 µg/ml và nồng độ kháng thể kháng fluorescein là pha loãng 3000 lần.
Hình 3.5. Đường chuẩn nồng độ F-AT II.
Như vậy, chúng tôi đã tối ưu hóa thành công phản ứng ELISA giúp đo được nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể
45
angiotensin II. Và dải nồng độ của phối tử đặc hiệu cũng được xác định trong khoảng từ 10-11
M - 10-8 M. Đây là khoảng nồng độ rất phù hợp cho việc xác định nồng độ của phối tử trong phản ứng liên kết thụ thể - phối tử, vì các phản ứng này thường đo được trong khoảng nM (10-9 M).
3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết
Để thực hiện được các thí nghiệm liên kết giữa thụ thể và phối tử chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml. Nồng độ của phối tử đặc hiệu F-AT II trong các phản ứng này là 10-8 M, đây là nồng độ được tham khảo từ những nghiên cứu trước đây trên thụ thể này với phối tử đặc hiệu là AT II đánh dấu phóng xạ [47].
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ protein với phối tử.
Kết quả được trình bày trong hình 3.6, cho thấy ở nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu với thụ thể đích tăng dần cho đến nồng độ protein là 10 mg/ml, ở đó phản ứng bắt đầu đạt được giá trị tối đa. Từ kết quả này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho các phản ứng liên kết thụ thể - phối tử được chúng tôi thực hiện trong các thí nghiệm tiếp theo là 10 mg/ml.
46
Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử cũng được thực hiện. Giá trị thời gian ủ phù hợp nhất là 40 phút.
3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa) hòa)
Với các điều kiện thí nghiệm đã tối ưu, đó là thời gian ủ 40 phút, và nồng độ protein thụ thể 10 mg/ml đã được xác định thông qua các thí nghiệm trước đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo để xác định được các giá trị Kd và Bmax đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT II. Thí nghiệm được thực hiện với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10-7 M đến 10-9 M.
Hình 3.7. Phản ứng bão hòa thụ thể angiotensin II với F-AT II.
Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mô hình một vị trí liên kết (one site binding model), giá trị Kd được tính toán là 11,38 nM, kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã được công bố trước đó với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47]. Như vậy, angiotensin II đánh dấu fluorescein trong nghiên cứu này của chúng tôi đã cho kết quả rất khả quan khi so sánh với các phương pháp đã công bố, và sự ảnh hưởng của việc gắn thêm gốc fluorescein nếu có thì cũng không làm ảnh hưởng nhiều đến kết quả của phương pháp này.
47
3.5. Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết
Để xác định sự chính xác và khả năng thay thế của phương pháp sử dụng angiotensin II đánh dấu fluorecein so với phương pháp truyền thống (sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ), chúng tôi thực hiện các thí nghiệm liên kết cạnh tranh giữa F-AT II với các phối tử đã biết của thụ thể đích. Các phối tử cạnh tranh được chọn là angiotensin II không đánh dấu, và một chất đối vận của angiotensin II được dùng làm thuốc rất phổ biến hiện nay là losartan (là một trong những thuốc bán chạy nhất hiện nay). Giá trị Ki thu được được so sánh với các giá trị Ki đã công bố của các phương pháp khác.
a b
Hình 3.8. Sự cạnh tranh angiotensin II (a) và losartan (b) với F-AT II trong liên kết với thụ thể angiotensin II.
Sự ức chế của các phối tử với F-AT II trên thụ thể thu được từ gan chuột với AT II (dải nồng độ từ 10-12 – 10-4 M) và losartan (dải nồng độ từ 10-10 – 10-2 M). Kết quả thu được được xử lý, biểu diễn trên hình 3.8. Giá trị Ki của AT II và losartan lần lượt là 13x10-9
M và 3,6x10-7 M. Giá trị Ki của AT II trong nghiên cứu này là khá tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây [7, 48], và so sánh với giá trị Kd của F-AT II trong nghiên cứu này ta thấy có sự tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II và phối tử không đánh dấu AT II không có nhiều khác biệt về ái lực. Điều này cũng củng cố thêm những đánh giá về sự ổn định và ái lực của phối tử được đánh dấu fluorescein sử dụng trong các nghiên cứu trong các
48
lĩnh vực khác trên thụ thể angiotensin II như trong các nghiên cứu đã được đề cập trong phần tổng quan tài liệu.
Giá trị Ki của losartan được xác định cao hơn trong các nghiên cứu khác được xác định trong nghiên cứu này của chúng tôi, có thể lý giải điều này là do đây là thuốc được mua từ các nhà thuốc, vì vậy có thêm các chất khác bổ sung và độ tinh khiết không cao, như được dùng trong các nghiên cứu khác. Mặc dù vậy, việc sử dụng các phối tử cạnh tranh với phối tử đánh dấu đã cho thấy phương pháp này cho kết quả chính xác khá cao, và có thể áp dụng được ở Việt Nam để thay cho việc sử dụng các phương pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng ở các nước đang phát triển. Hơn nữa, phù hợp với các nghiên cứu đánh giá bước đầu để sàng lọc các dịch chiết có tác dụng hoạt động trên thụ thể đích.
3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra khả năng cạnh tranh của 12 dịch chiết methanol của 4 loài cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, và các tác dụng liên quan như giãn mạch. Các loài này bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.). Đây là các cây thuốc được sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền, hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi, được chúng tôi tham khảo trong tài liệu “cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” do viện Dược liệu biên soạn. Cây tầm gửi (Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.) là một cây đang được chú ý với một số công bố mới hiện nay.
Các thí nghiệm liên kết được tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào các phép thử dưới 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm của mình, chúng tôi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng của dung môi chiết đến thí nghiệm. Dịch chiết của các mẫu được kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml cho đến 1000 µg/ml.
49
Với các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 và PEI081101). Giá trị IC50 thu được lần lượt là 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 và 0,7 ± 0,6. Kết quả này cho thấy các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng giữa F-AT II với thụ thể angiotensin II cao. Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị Ki của các mẫu được tính toán là 1,2; 0,8 và 0,5 µg/ml.
Hình 3.9. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần trầu. Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu PEI081101 (a);