Để tối ưu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định được lượng phối tử đặc hiệu F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp của phản ứng ELISA có thể xác định được.
44
Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA) ở các nồng độ 0,1; 0,5; và 1 µg/ml. Với mỗi nồng độ kháng nguyên như trên, chúng tối tiến hành với các nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase lần lượt ở các nồng độ pha loãng là từ 250 đến 8000 lần (theo giới hạn được khuyến cáo của nhà cung cấp). Kết quả thí nghiệm được trình bày trên hình 3.4. Từ kết quả này, chúng tôi xác định được một số nồng độ cho kết quả thí nghiệm đảm bảo các tiêu chí đó là cho kết quả OD ổn định, và giá trị OD405 ở trong khoảng giá trị đủ lớn (nếu giá trị OD nhỏ, sẽ cho sai số lớn khi kết quả có sự sai số). Tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm để tìm ra khoảng giới hạn về nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể, đó là angiotensin II được đánh dấu fluorescein (fluorescein-angiotensin II, ký hiệu F-AT II). Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh giữa F-AT II với kháng nguyên phủ trên đĩa trước đó (F-BSA), chúng ta có thể xác định được khả năng của phương pháp trong việc đo lượng phối tử liên kết thụ thể.
Hình 3.5 biểu diễn kết quả xác định đường chuẩn F-AT II được thiết lập với phản ứng elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa là 1 µg/ml và nồng độ kháng thể kháng fluorescein là pha loãng 3000 lần.
Hình 3.5. Đường chuẩn nồng độ F-AT II.
Như vậy, chúng tôi đã tối ưu hóa thành công phản ứng ELISA giúp đo được nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể
45
angiotensin II. Và dải nồng độ của phối tử đặc hiệu cũng được xác định trong khoảng từ 10-11
M - 10-8 M. Đây là khoảng nồng độ rất phù hợp cho việc xác định nồng độ của phối tử trong phản ứng liên kết thụ thể - phối tử, vì các phản ứng này thường đo được trong khoảng nM (10-9 M).