Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và chất gắn đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

Development of a nonradioactive receptorligand binding assay towards drug development strategy in Vietnam Nguyen Anh Luong Hanoi university of Science, VNU; Faculty of Biology Major: Genetics; Code: 60 42 70 Supervisors: Assoc.Prof.PhD Dinh Doan Long Date of Presenting Thesis: 2011 Abstract Tổng quan phương pháp đo tương tác thụ thể phối tử đặc hiệu khơng sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc Việt Nam: Khái quát dược lý phân tử; Các đích tác dụng thuốc; Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR); Thụ thể angiotensin II; Các phương pháp nghiên cứu xác định tương tác thụ thể phối tử; Y học cổ truyền tài nguyên dược liệu Trình bày phương pháp nghiên cứu: Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol; Thu thụ thể màng; Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford; Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn fluorescein; Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay); Phản ứng tương tác phối tử biết dịch chiết với thụ thể đích; Phương pháp xử lý kết Trình bày kết thảo luận: Xác định nồng độ protein thu từ gan chuột; Tối ưu phản ứng ELISA; Tối ưu nồng độ protein thụ thể phản ứng liên kết; Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hịa); Phản ứng cạnh tranh F-AT II với phối tử biết; Nghiên cứu sàng lọc số dịch chiết thực vật Keywords Di truyền học; Thuốc Việt Nam; Đồng vị phóng xạ; Thụ thể Content Việt Nam nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng phong phú giới với 13.200 loài thực vật khoảng 10.000 loài động vật xác định, với nhiều nhóm lồi sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học thực tiễn lớn Xuất phát từ văn hóa đa dạng sắc với nhiều dân tộc sống trải dài khắp lãnh thổ với điều kiện tự nhiên lịch sử riêng hình thành nên Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với nhiều kinh nghiệm sử dụng thuốc đời sống Việc dùng thuốc nhân dân có từ lâu đời, tích lũy dạng kinh nghiệm, thường truyền miệng qua nhiều hệ Hơn 3800 thuốc sưu tầm lại, với hàng nghìn thuốc lưu truyền dân gian, đặc biệt cộng đồng dân tộc thiểu số Tuy nhiên, nhiều thuốc nguyên liệu làm thuốc chưa nghiên cứu chế tác động sở khoa học chưa xác định Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học phát triển thuốc giới, phổ biến phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như H, 125 I) để nghiên cứu đích phân tử thuốc Tuy nhiên, phương pháp chưa áp dụng điều kiện Việt Nam với nguyên nhân hầu hết phịng thí nghiệm sinh dược học ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản loại thải chất phóng xạ Vì lý đó, tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể phối tử đặc hiệu khơng dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mơ hình nhằm sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học đích phân tử có nguồn gốc từ thuốc, thuốc sử dụng hiệu y học cổ truyền với tác dụng chữa bệnh tương ứng Trong Luận văn này, chúng tơi tập trung vào đích phân tử thụ thể angiotensin II, đích tác dụng biết nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với chế phân tử nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với số dịch chiết từ số thuốc Việt Nam biết y học cổ truyền với tác dụng điều hòa huyết áp điều trị chứng bệnh liên quan đến tim, mạch hệ tuần hoàn Xác định nồng độ protein thu từ gan Ở chuột thỏ, có hai nhóm phụ thụ thể angiotensin II khác nhau, thụ thể Agtr1 (hay Agtr1a, AT1A) Agtr1b (hay AT1B) Hai loại thụ thể gen khác quy định có trình tự tương đồng quan trọng vùng mã hóa Các thụ thể tương đồng lực với với angiotensin II chất đối vận không peptide phân biệt mặt dược lý chúng có phân bố khác điều hòa khác [25] So sánh trình tự gen mã hóa thụ thể AT1 người chuột, có tới 95% trình tự axit amin tương đồng [22], có lực tương đồng với chất chủ vận tự nhiên angiotensin II [25] Gan chuột mơ có phân bố thụ thể angiotensin II cao thứ hai, sau tuyến thượng thận [40] Trong nghiên cứu chọn mô gan để thu protein thụ thể mô gan lớn thu mẫu dễ dàng Sau mẫu mô thu được nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein thu theo phương pháp Bradford Với BSA protein chuẩn, đường chuẩn xây dựng, với phương trình y = ax + b; y giá trị OD bước sóng 595nm, x giá trị nồng độ protein (mg/ml) Với mẫu pha loãng từ mẫu protein gốc thu sau nghiền đồng thể, sau đo OD595 ta tìm giá trị OD mẫu pha lỗng giới hạn đường chuẩn xây dựng, từ tính nồng độ mẫu pha lỗng từ số lần pha loãng suy ngược nồng độ mẫu protein gốc ban đầu Trong thí nghiệm này, xác định giá trị nồng độ protein thu từ gan chuột, nồng độ thu 50 mg/ml Tối ưu phản ứng ELISA Để tối ưu phản ứng ELISA cho phản ứng giúp xác định lượng phối tử đặc hiệu F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp phản ứng ELISA xác định Hình Tối ưu nồng độ pha lỗng kháng thể với F-BSA Thí nghiệm tiến hành với nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA) nồng độ 0,1; 0,5; µg/ml Với nồng độ kháng nguyên trên, chúng tối tiến hành với nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase nồng độ pha loãng từ 250 đến 8000 lần (theo giới hạn khuyến cáo nhà cung cấp) Kết thí nghiệm trình bày hình Từ kết này, xác định số nồng độ cho kết thí nghiệm đảm bảo tiêu chí cho kết OD ổn định, giá trị OD405 khoảng giá trị đủ lớn (nếu giá trị OD nhỏ, cho sai số lớn kết có sai số) Tiếp theo, chúng tơi tiến hành thí nghiệm để tìm khoảng giới hạn nồng độ phối tử đặc hiệu phản ứng liên kết với thụ thể, angiotensin II đánh dấu fluorescein (fluorescein-angiotensin II, ký hiệu F-AT II) Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh F-AT II với kháng nguyên phủ đĩa trước (F-BSA), xác định khả phương pháp việc đo lượng phối tử liên kết thụ thể Hình 3.5 biểu diễn kết xác định đường chuẩn F-AT II thiết lập với phản ứng elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa µg/ml nồng độ kháng thể kháng fluorescein pha loãng 3000 lần Hình Đường chuẩn nồng độ F-AT II Như vậy, chúng tơi tối ưu hóa thành cơng phản ứng ELISA giúp đo nồng độ phối tử đặc hiệu phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể angiotensin II Và dải nồng độ phối tử đặc hiệu xác định khoảng từ 10-11 M - 10-8 M Đây khoảng nồng độ phù hợp cho việc xác định nồng độ phối tử phản ứng liên kết thụ thể - phối tử, phản ứng thường đo khoảng nM (10-9 M) Tối ưu nồng độ protein thụ thể phản ứng liên kết Để thực thí nghiệm liên kết thụ thể phối tử chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm Thí nghiệm thực với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml Nồng độ phối tử đặc hiệu FAT II phản ứng 10-8 M, nồng độ tham khảo từ nghiên cứu trước thụ thể với phối tử đặc hiệu AT II đánh dấu phóng xạ [47] Hình Ảnh hưởng nồng độ protein với phối tử Kết trình bày hình 3, cho thấy nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu với thụ thể đích tăng dần nồng độ protein 10 mg/ml, phản ứng bắt đầu đạt giá trị tối đa Từ kết này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử thực thí nghiệm 10 mg/ml Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử thực Giá trị thời gian ủ phù hợp 40 phút Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hịa) Với điều kiện thí nghiệm tối ưu, thời gian ủ 40 phút, nồng độ protein thụ thể 10 mg/ml xác định thơng qua thí nghiệm trước đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm để xác định giá trị Kd Bmax đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT II Thí nghiệm thực với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10-7 M đến 10-9 M Hình Phản ứng bão hịa thụ thể angiotensin II với F-AT II Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mơ hình vị trí liên kết (one site binding model), giá trị Kd tính toán 11,38 nM, kết tương đồng với nghiên cứu cơng bố trước với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47] Như vậy, angiotensin II đánh dấu fluorescein nghiên cứu cho kết khả quan so sánh với phương pháp công bố, ảnh hưởng việc gắn thêm gốc fluorescein có khơng làm ảnh hưởng nhiều đến kết phương pháp Phản ứng cạnh tranh F-AT II với phối tử biết Để xác định xác khả thay phương pháp sử dụng angiotensin II đánh dấu fluorecein so với phương pháp truyền thống (sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ), chúng tơi thực thí nghiệm liên kết cạnh tranh F-AT II với phối tử biết thụ thể đích Các phối tử cạnh tranh chọn angiotensin II không đánh dấu, chất đối vận angiotensin II dùng làm thuốc phổ biến losartan (là thuốc bán chạy nay) Giá trị Ki thu được so sánh với giá trị Ki công bố phương pháp khác a b Hình Sự cạnh tranh angiotensin II (a) losartan (b) với F-AT II liên kết với thụ thể angiotensin II Sự ức chế phối tử với F-AT II thụ thể thu từ gan chuột với AT II (dải nồng độ từ 10-12 – 10-4 M) losartan (dải nồng độ từ 10-10 – 10-2 M) Kết thu được xử lý, biểu diễn hình Giá trị Ki AT II losartan 13x10-9 M 3,6x10-7 M Giá trị Ki AT II nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu công bố trước [7, 48], so sánh với giá trị Kd F-AT II nghiên cứu ta thấy có tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II phối tử không đánh dấu AT II khơng có nhiều khác biệt lực Điều củng cố thêm đánh giá ổn định lực phối tử đánh dấu fluorescein sử dụng nghiên cứu lĩnh vực khác thụ thể angiotensin II nghiên cứu đề cập phần tổng quan tài liệu Giá trị Ki losartan xác định cao nghiên cứu khác xác định nghiên cứu chúng tơi, lý giải điều là thuốc mua từ nhà thuốc, có thêm chất khác bổ sung độ tinh khiết không cao, dùng nghiên cứu khác Mặc dù vậy, việc sử dụng phối tử cạnh tranh với phối tử đánh dấu cho thấy phương pháp cho kết xác cao, áp dụng Việt Nam để thay cho việc sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng nước phát triển Hơn nữa, phù hợp với nghiên cứu đánh giá bước đầu để sàng lọc dịch chiết có tác dụng hoạt động thụ thể đích Nghiên cứu sàng lọc số dịch chiết thực vật Trong nghiên cứu này, kiểm tra khả cạnh tranh 12 dịch chiết methanol loài thuốc sử dụng y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, tác dụng liên quan giãn mạch Các loài bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus philippensis Cham & Schl Ban.) Đây thuốc sử dụng lâu đời thuốc y học cổ truyền, sử dụng rộng rãi, tham khảo tài liệu “cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam” viện Dược liệu biên soạn Cây tầm gửi (Taxillus philippensis Cham & Schl Ban.) ý với số công bố Các thí nghiệm liên kết tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào phép thử 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm mình, chúng tơi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng dung mơi chiết đến thí nghiệm Dịch chiết mẫu kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml 1000 µg/ml Với mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 PEI081101) Giá trị IC50 thu 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 0,7 ± 0,6 Kết cho thấy mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng F-AT II với thụ thể angiotensin II cao Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị Ki mẫu tính tốn 1,2; 0,8 0,5 µg/ml 0 0,01 0,1 10 100 1000 Log [dịch chiết], µg/ml Hình Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết cỏ mần trầu Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  PEI081101 (a);  PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c) Với mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC50 thu đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với mẫu 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 0,5 ± 0,3) Điều cho thấy, dịch chiết có khả ức chế cao phản ứng tương tác thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu Giá trị Ki mẫu trung bình khoảng 0,8 µg/ml Kết cho thấy, có chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể angiotensin II mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu hạ khô thảo Đây cần ý nghiên cứu sâu đề tài Log [dịch chiết], µg/ml Hình Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết hạ khô thảo Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  LPV081101 (d);  LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f) Log [dịch chiết], µg/ml Hình Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết hòe Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  FSJ081101 (j);  FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l) Log [dịch chiết], µg/ml Hình Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II dịch chiết tầm gửi Liên kết đặc hiệu giá trị IC50 (trong ngoặc) xác định với mẫu  LTP081101 (g);  LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i) Hình biểu diễn đồ thị ức chế mẫu hòe tầm gửi với phản ứng thụ thể angiotensin II F-AT II Kết thu từ thí nghiệm cho thấy: mẫu dịch chiết từ nụ hịe có tiềm lực ức chế yếu cỏ mần trầu hạ khơ thảo (hình 8) mẫu thử hòe cho IC50 có khả ức chế mạnh với mẫu FSJ081101 (IC50 = 13 ± µg/ml) yếu mẫu FSJ081102 (IC50 = 71 ± 45 µg/ml) Ki thu mẫu hòe từ 9,2 đến 93,5 µg/ml Trong mẫu dịch chiết tầm gửi thể khả ức chế yếu với giá trị IC50 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103) Bảng IC50 Ki mẫu dịch chiết nghiên cứu Dịch chiết Eleusine indica – Cỏ mần trầu Prunella vulgaris – Hạ khô thảo Sophora japonica – Hòe Taxillus philippensis – Tầm gửi Mẫu PEI081101 PEI081102 PEI081103 LPV081101 LPV081102 LPV081103 FSJ081101 FSJ081102 FSJ081103 LTP081101 LTP081102 LTP081103 IC50 (g/mL) 1.6 ± 0.3 1.1 ± 0.5 0.7 ± 0.6 1.1 ± 0.4 0.8 ± 0.6 0.5 ± 0.3 13 ± 71 ± 45 26 ± 126 ± 32 330 ± 80 800 ± 53 Ki (g/mL) 1.2 0.8 0.5 0.8 0.6 0.3 9.2 52.7 19.2 93.5 243.9 591.7 References Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tăng huyết áp điều trị y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006), Bệnh tăng huyết áp: chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Ayensu E.S., DeFilipps R.A (1978), Endangered and Threatened Plants of the United States Washington, DC:Smithsonian Institution Beck-Sickinger, A.G (1996), Structural characterization and binding sites of G-proteincoupled receptors Drug Discovery Today, 1:502–513 7 Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al (1992), Cloning and characterization of a human angiotensin II type receptor Biochem Biophys Res Commun, 183:989-995 Berk BC, Corson MA (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases Circ Res, 80:607-616 Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM (1990), Receptor-effector coupling of G proteins Biochim Biophys Acta, 1031:163–224 10 Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H (1988), Characterization of the angiotensin II receptor in primary cultures of rat hepatocytes J Biol Chem, 263(29): 14913 – 14919 11 Bradford M.M (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem 72: 248– 254 12 Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM (2000), Role of the angiotensin type receptor in the regulation of blood pressure and renal function Hypertension, 35:155-163 13 Curnow KM, Pascoe L, White PC (1992), Genetic analysis of the human type-1 angiotensin II receptor Mol Endocrinol, 6:1113-1118 14 Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons; 2003 15 Cheng YC, Prusoff WH (1973), Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction J Biochem Pharmacol, 22: 3099 –3103 16 de Jong L.A., Uges D.R., Franke J.P., Bischoff R., (2005), Receptor-ligand binding assays: technologies and applications J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 829: 1–25 17 Ernst, E (1999), Efficacy of Herbal Medicine: Do they Work and Are they Safe?, Pharmaceutical News, Focus on Contemporary Medicine, Special Issue, p 17 18 Fabricant D.S., Farnsworth N.R (2011), The value of plants used in traditional medicine for drug discovery Environ Health Perspect, 109:69–75 19 Farnsworth N.R., Akerele O., Bingel A.S., Soejarto D.D., Guo Z (1985), Medicinal plants in therapy Bull WHO 63:965–981 20 Fourth Country Report: Vietnam’s Implementation of the Biodiversity Convention, ASEAN Biodiversity Magazine 21 Gonzalez-Villalobos R, Klassen RB, Allen PL, Navar LG, Hammond TG ((2005)), Megalin binds and internalizes angiotensin II Am J Physiol Renal Physiol, 288:F420F427 22 Guo D.F., Sun Y.L., Hamet P., Inagami T (2001), The angiotensin II type receptor and receptor-associated proteins Cell Research, 11, 165–180 23 Harmer, I.J and Samuel, D (1989), The FITC-anti-FITC system is a sensitive alternative to biotin- streptavidin in ELISA J Immunol Methods, 122 115-122 24 Hernandez-Presa M., Bustos C., Ortego M., et al.(1997), Angiotensin-converting enzyme inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, and macrophage infiltration in a rabbit model of early accelerated atherosclerosis Circulation, 95:1532-1541 25 Hoe K.L., Saavedra J.M (2002), Site-directed mutagenesis of the gerbil and human angiotensin II AT(1) receptors identifies amino acid residues attributable to the binding affinity for the nonpeptidic antagonist losartan Mol Pharmacol., Jun;61(6):1404-15 26 Janssen MJ, Ensing K, de Zeeuw RA (2001), A fluorescent receptor assay for benzodiazepines using coumarin-labeled desethylflumazenil as ligand Anal Chem Jul 1;73(13):3168-73 27 Jourdain E., et al (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies among Wild Bird Species PLoS One 6:e24155 28 Katzung B.G (2007), Basis and clinical pharmacology, 10th ed McGraw Hill, LANGE 29 Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I (1970), Radioreceptor Assay of Adrenocorticotropic Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide Hormones in Plasma Science 170: 633 30 Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL (2006), AT1 receptor-mediated accumulation of extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases Am J Physiol Renal Physiol, 291:F375-F383 31 Lloyd R.V ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology techniques Humana Press 32 Lundstrom K.H and Chiu M.L (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery, CRC Press Taylor & Francis Group, 33 Mahoney CW (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of binding of platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor receptor beta-extracellular domain using biotinylated ligand with enzyme-linked immunosorbent assay Anal Biochem., 276(1):106-8 34 Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al (1995), The angiotensin II type (AT2) receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain-of-function study using gene transfer Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667 35 Noda K, Feng YH, Liu XP, et al (1996), The active state of the AT1 angiotensin receptor is generated by angiotensin II induction Biochemistry, 35:16435-16442 36 Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal method for detecting skin ulceration in fish Vet Pathol 39:726–731 37 Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of plants and animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic Southeast Asia report, Published by TRAFFIC 38 Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L (2006), How many drug targets are there? Nature Rev Drug Discov 5: 993–996 39 Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ (2002), Seven-transmembrane receptors Nature Rev, 3:639–650 40 Regard JB, Sato IT and Coughlin SR (2008), Anatomical profiling of G protein-coupled receptor expression Cell, Volume 135, Issue 3, 561-571 41 Rong Y.P., et al (2009), The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor Proc Natl Acad Sci USA, 106:14397-402 42 Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, et al (2000), Angiotensin II activates nuclear transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) in vascular smooth muscle cells: molecular mechanisms Circ, 86:1266-1272 43 Solecki R., Shanidar I.V (1975), A Neanderthal flower burial in northern Iraq Science 190:880–881 44 Takeuchi T, Tanaka S, Rechnitz GA (1992), Biotinylated 1012-S conjugate as a probe ligand for benzodiazepine receptors: characterization of receptor binding sites and receptor assay for benzodiazepine drugs Anal Biochem., 203(1):158-62 45 Trevor A.J, Katzung B.G, Maters S.B (2010), Pharmacology examination and board review, 9th ed McGraw Hill, LANGE; 2010 46 Vogle H.G (2002), Drug discovery and evaluation: pharmacology assays 2nd ed Springer 47 Widdowson P.S., Renouard A., Vilaine J.P (1993), Binding of [3H]angiotensin II and [3H]DuP753 (losartan) to rat liver homogenates reveals multiple sites Relationship of AT1a and AT1b-type angiotensin receptors and novel nonangiotensin binding sites Peptides, 14(4): 829 – 837 48 World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005, Geneva 49 Zander E.D (2011), The Science and Business of Drug Discovery Springer  ... phương pháp đo tương tác thụ thể phối tử đặc hiệu khơng dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc Việt Nam? ?? nhằm tiến tới ứng dụng mơ hình nhằm sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh... từ thuốc, thuốc sử dụng hiệu y học cổ truyền với tác dụng chữa bệnh tương ứng Trong Luận văn này, tập trung vào đích phân tử thụ thể angiotensin II, đích tác dụng biết nhiều thuốc có tác dụng. .. chất có hoạt tính sinh học phát triển thuốc giới, phổ biến phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như H, 125 I) để nghiên cứu đích phân tử thuốc Tuy nhiên, phương pháp chưa áp dụng điều kiện Việt