Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và chất gắn đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol; Thu thụ thể màng; Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford; Phương pháp elisa để xác định lượ

Development of a nonradioactive receptor-ligand binding assay towards drug development

strategy in Vietnam Nguyen Anh Luong

Hanoi university of Science, VNU; Faculty of Biology

Major: Genetics; Code: 60 42 70 Supervisors: Assoc.Prof.PhD Dinh Doan Long

Date of Presenting Thesis: 2011

Abstract Tổng quan về phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử

dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam: Khái quát về dược lý phân tử; Các đích tác dụng của thuốc; Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR); Thụ thể angiotensin II; Các phương pháp nghiên cứu xác định tương tác thụ thể và phối tử; Y học cổ truyền và tài nguyên dược liệu Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol; Thu thụ thể màng; Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford; Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn fluorescein; Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay); Phản ứng tương tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích; Phương pháp xử lý kết quả Trình bày kết quả và thảo luận: Xác định nồng độ protein thu được từ gan chuột; Tối ưu phản ứng ELISA; Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết; Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa); Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết; Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật

Keywords Di truyền học; Thuốc Việt Nam; Đồng vị phóng xạ; Thụ thể

Content

Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã được xác định, với nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn

Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài trên khắp lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một nền Y học cổ truyền

với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm trong sử dụng thuốc trong đời sống Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu đời, tích lũy dưới dạng kinh nghiệm, thường chỉ được truyền miệng qua nhiều thế hệ Hơn 3800 bài thuốc đã được sưu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lưu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số Tuy nhiên, rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc như vậy vẫn chưa được nghiên cứu cơ chế tác động cũng như cơ sở khoa học vẫn chưa được xác định

Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như

3

H, 125I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc Tuy nhiên, những phương pháp này chưa được áp dụng trong điều kiện Việt Nam với nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dược học của ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ

Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ

thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt

tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tương ứng

Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể angiotensin II, đây

là đích tác dụng đã được biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với cơ chế phân tử đã được nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết

từ một số cây thuốc Việt Nam đã được biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn

1 Xác định nồng độ protein thu được từ gan

Ở chuột và thỏ, có hai nhóm phụ thụ thể angiotensin II khác nhau, là thụ thể Agtr1 (hay Agtr1a, hoặc AT1A) và Agtr1b (hay AT1B) Hai loại thụ thể này do các gen khác nhau quy định

có trình tự tương đồng quan trọng trong vùng mã hóa Các thụ thể này tương đồng về ái lực với với angiotensin II và các chất đối vận không peptide và không thể phân biệt về mặt dược lý mặc dù chúng có sự phân bố khác nhau và được điều hòa khác nhau [25] So sánh trình tự gen

mã hóa thụ thể AT1 ở người và chuột, có tới hơn 95% trình tự axit amin tương đồng [22], và có

ái lực tương đồng với chất chủ vận tự nhiên là angiotensin II [25]

Gan chuột là mô có sự phân bố của thụ thể angiotensin II cao thứ hai, chỉ sau tuyến thượng thận [40]

Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mô gan để thu protein thụ thể này do mô gan lớn hơn và thu mẫu cũng dễ dàng hơn

Sau khi mẫu mô thu được được nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein thu được theo phương pháp của Bradford Với BSA là protein chuẩn, đường chuẩn được xây dựng, với phương trình y = ax + b; trong đó y là giá trị OD ở bước sóng 595nm, còn x là giá trị nồng độ protein (mg/ml) Với các mẫu pha loãng từ mẫu protein gốc thu được sau khi nghiền đồng thể, sau khi đo OD595 ta tìm được giá trị OD của mẫu pha loãng trong giới hạn của đường chuẩn đã xây dựng, từ đó tính được nồng độ của mẫu pha loãng này rồi từ số lần pha loãng suy ngược ra nồng độ của mẫu protein gốc ban đầu Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định được giá trị của nồng độ protein thu được từ gan chuột, nồng độ thu được là 50 mg/ml

2 Tối ưu phản ứng ELISA

Để tối ưu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định được lượng phối tử đặc hiệu F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp của phản ứng ELISA có thể xác định được

Hình 1 Tối ưu nồng độ pha loãng kháng thể với F-BSA

Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA) ở các nồng

độ 0,1; 0,5; và 1 µg/ml Với mỗi nồng độ kháng nguyên như trên, chúng tối tiến hành với các nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase lần lượt ở các nồng độ pha loãng là từ

250 đến 8000 lần (theo giới hạn được khuyến cáo của nhà cung cấp) Kết quả thí nghiệm được trình bày trên hình 1 Từ kết quả này, chúng tôi xác định được một số nồng độ cho kết quả thí nghiệm đảm bảo các tiêu chí đó là cho kết quả OD ổn định, và giá trị OD405 ở trong khoảng giá trị đủ lớn (nếu giá trị OD nhỏ, sẽ cho sai số lớn khi kết quả có sự sai số) Tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm để tìm ra khoảng giới hạn về nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể, đó là angiotensin II được đánh dấu fluorescein (fluorescein-angiotensin

II, ký hiệu F-AT II) Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh giữa F-AT II với kháng nguyên phủ trên

đĩa trước đó (F-BSA), chúng ta có thể xác định được khả năng của phương pháp trong việc đo lượng phối tử liên kết thụ thể

Hình 3.5 biểu diễn kết quả xác định đường chuẩn F-AT II được thiết lập với phản ứng elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa là 1 µg/ml và nồng độ kháng thể kháng fluorescein là pha loãng 3000 lần

Hình 2 Đường chuẩn nồng độ F-AT II

Như vậy, chúng tôi đã tối ưu hóa thành công phản ứng ELISA giúp đo được nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể angiotensin II Và dải nồng độ của phối tử đặc hiệu cũng được xác định trong khoảng từ 10-11 M - 10-8 M Đây là khoảng nồng

độ rất phù hợp cho việc xác định nồng độ của phối tử trong phản ứng liên kết thụ thể - phối tử,

vì các phản ứng này thường đo được trong khoảng nM (10-9

M)

3 Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết

Để thực hiện được các thí nghiệm liên kết giữa thụ thể và phối tử chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml Nồng độ của phối tử đặc hiệu

F-AT II trong các phản ứng này là 10-8

M, đây là nồng độ được tham khảo từ những nghiên cứu trước đây trên thụ thể này với phối tử đặc hiệu là AT II đánh dấu phóng xạ [47]

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ protein với phối tử

Kết quả được trình bày trong hình 3, cho thấy ở nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu với thụ thể đích tăng dần cho đến nồng độ protein là 10 mg/ml, ở đó phản ứng bắt đầu đạt được giá trị tối đa Từ kết quả này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho các phản ứng liên kết thụ thể

- phối tử được chúng tôi thực hiện trong các thí nghiệm tiếp theo là 10 mg/ml

Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử cũng được thực hiện Giá trị thời gian ủ phù hợp nhất là 40 phút

4 Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa)

Với các điều kiện thí nghiệm đã tối ưu, đó là thời gian ủ 40 phút, và nồng độ protein thụ thể 10 mg/ml đã được xác định thông qua các thí nghiệm trước đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo để xác định được các giá trị Kd và Bmax đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT

II Thí nghiệm được thực hiện với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10-7

M đến 10-9

M

Hình 4 Phản ứng bão hòa thụ thể angiotensin II với F-AT II

Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mô hình một vị trí liên kết (one site binding model), giá trị Kd được tính toán là 11,38 nM, kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã được công

bố trước đó với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47] Như vậy, angiotensin II đánh dấu fluorescein trong nghiên cứu này của chúng tôi đã cho kết quả rất khả quan khi so sánh với các phương pháp đã công bố, và sự ảnh hưởng của việc gắn thêm gốc fluorescein nếu có thì cũng không làm ảnh hưởng nhiều đến kết quả của phương pháp này

5 Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết

Để xác định sự chính xác và khả năng thay thế của phương pháp sử dụng angiotensin II đánh dấu fluorecein so với phương pháp truyền thống (sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ), chúng tôi thực hiện các thí nghiệm liên kết cạnh tranh giữa F-AT II với các phối tử đã biết của thụ thể đích Các phối tử cạnh tranh được chọn là angiotensin II không đánh dấu, và một chất đối vận của angiotensin II được dùng làm thuốc rất phổ biến hiện nay là losartan (là một trong những thuốc bán chạy nhất hiện nay) Giá trị Ki thu được được so sánh với các giá trị Ki đã công bố của các phương pháp khác

Hình 5 Sự cạnh tranh angiotensin II (a) và losartan (b) với F-AT II trong liên kết với thụ

thể angiotensin II

Sự ức chế của các phối tử với F-AT II trên thụ thể thu được từ gan chuột với AT II (dải nồng độ từ 10-12 – 10-4 M) và losartan (dải nồng độ từ 10-10 – 10-2 M) Kết quả thu được được

xử lý, biểu diễn trên hình 5 Giá trị Ki của AT II và losartan lần lượt là 13x10-9 M và 3,6x10-7

M Giá trị Ki của AT II trong nghiên cứu này là khá tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây [7, 48], và so sánh với giá trị Kd của F-AT II trong nghiên cứu này ta thấy có sự tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II và phối tử không đánh dấu AT II không có nhiều khác biệt về ái lực Điều này cũng củng cố thêm những đánh giá về sự ổn định và ái lực của phối tử được đánh dấu fluorescein sử dụng trong các nghiên cứu trong các lĩnh vực khác trên thụ thể angiotensin II như trong các nghiên cứu đã được đề cập trong phần tổng quan tài liệu

Giá trị Ki của losartan được xác định cao hơn trong các nghiên cứu khác được xác định trong nghiên cứu này của chúng tôi, có thể lý giải điều này là do đây là thuốc được mua từ các nhà thuốc, vì vậy có thêm các chất khác bổ sung và độ tinh khiết không cao, như được dùng trong các nghiên cứu khác Mặc dù vậy, việc sử dụng các phối tử cạnh tranh với phối tử đánh dấu đã cho thấy phương pháp này cho kết quả chính xác khá cao, và có thể áp dụng được ở Việt Nam để thay cho việc sử dụng các phương pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng ở các nước đang phát triển Hơn nữa, phù hợp với các nghiên cứu đánh giá bước đầu để sàng lọc các dịch chiết có tác dụng hoạt động trên thụ thể đích

6 Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra khả năng cạnh tranh của 12 dịch chiết methanol của 4 loài cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, và

các tác dụng liên quan như giãn mạch Các loài này bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus

philippensis Cham & Schl Ban.) Đây là các cây thuốc được sử dụng lâu đời trong các bài

thuốc y học cổ truyền, hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi, được chúng tôi tham khảo trong tài liệu “cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” do viện Dược liệu biên soạn Cây tầm gửi

(Taxillus philippensis Cham & Schl Ban.) là một cây đang được chú ý với một số công bố mới

hiện nay

Các thí nghiệm liên kết được tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào các phép thử dưới 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm của mình, chúng tôi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng của dung môi chiết đến thí nghiệm Dịch chiết của các mẫu được kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml cho đến 1000 µg/ml

Với các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 và PEI081101) Giá trị IC50 thu được lần lượt là 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 và 0,7 ± 0,6 Kết quả này cho thấy các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng giữa F-AT II với thụ thể angiotensin II cao Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị Ki của các mẫu được tính toán là 1,2; 0,8 và 0,5 µg/ml

Hình 6 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần trầu

Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu  PEI081101 (a);  PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c)

Với các mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC50

thu được đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với các mẫu là 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 và 0,5 ± 0,3) Điều này cho thấy, các dịch chiết này có khả năng ức chế cao phản ứng tương tác giữa thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó Giá trị Ki của các mẫu này trung bình là khoảng 0,8 µg/ml Kết quả cho thấy, có thể có những chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể angiotensin II trong các mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu và hạ khô thảo Đây là những cây cần được chú ý cùng trong các nghiên cứu sâu hơn của đề tài này

Hình 7 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hạ khô thảo

Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu  LPV081101 (d);  LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f)

Log [dịch chiết], µg/ml

0 0,01 0,1 1 10 100 1000

Log [dịch chiết], µg/ml

Hình 8 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hòe Liên kết

đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu  FSJ081101 (j);  FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l)

Hình 9 Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi Liên

kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) được xác định với các mẫu  LTP081101 (g);  LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i)

Hình 8 và 9 biểu diễn đồ thị ức chế của các mẫu hòe và tầm gửi trong với phản ứng thụ thể angiotensin II và F-AT II Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy: các mẫu dịch chiết

từ nụ hòe có tiềm lực ức chế yếu hơn của cỏ mần trầu và hạ khô thảo (hình 7 và 8) 3 mẫu thử của hòe cho IC50 có khả năng ức chế mạnh nhất với mẫu FSJ081101 (IC50 = 13 ± 2 µg/ml) và yếu nhất là mẫu FSJ081102 (IC50 = 71 ± 45 µg/ml) Ki thu được của các mẫu hòe là từ 9,2 đến

Log [dịch chiết], µg/ml

Log [dịch chiết], µg/ml

93,5 µg/ml Trong khi đó các mẫu dịch chiết của tầm gửi thể hiện khả năng ức chế rất yếu với giá trị IC50 trên 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103)

Bảng 1 IC50 và Ki của các mẫu dịch chiết trong nghiên cứu

Eleusine indica – Cỏ mần trầu

PEI081102 1.1 ± 0.5 0.8 PEI081103 0.7 ± 0.6 0.5

Prunella vulgaris – Hạ khô thảo

LPV081101 1.1 ± 0.4 0.8 LPV081102 0.8 ± 0.6 0.6 LPV081103 0.5 ± 0.3 0.3

Sophora japonica – Hòe

Taxillus philippensis – Tầm gửi

References

Tài liệu tiếng Việt

1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong và các cộng

sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I và II, NXB Khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội

2 Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà

Nội

3 Tăng huyết áp và điều trị trong y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam

4 Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006), Bệnh tăng

huyết áp: cơ chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán và điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí

Minh

Tài liệu tiếng Anh

5 Ayensu E.S., DeFilipps R.A (1978), Endangered and Threatened Plants of the United

States Washington, DC:Smithsonian Institution

6 Beck-Sickinger, A.G (1996), Structural characterization and binding sites of

G-protein-coupled receptors Drug Discovery Today, 1:502–513