Các phương pháp phân tích trong hóa sinh

Thực phẩm hay nói đơn giản đó là thức ăn, chủ yếu bao gồm các chất như: carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), các vitamin, khoáng chất, và nước, mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạp các chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích. Tuy nhiên, các chất trong thực phẩm dễ bị chuyển hóa bởi nhiều yếu tố khác nhau trong quá trình chế biến và bảo quản.Một trong những yếu tố đó là enzyme.Do phản ứng enzyme mà chất lượng của các nguyên liệu trong quá trình chế biến và bảo quản tăng lên, hoặc giảm sút.Các biện pháp công nghệ trong sản xuất thực phẩm hoặc là kìm hãm hoạt độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cách tối đa.

Đề tài CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN

TÍCH TRONG HÓA SINH

Khoáng

Vitamin

Carbohy drat

Carbohy drat

Enzyme

Protein

Lipid

- Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

- Định lượng đường khử bằng thuốc thử kaliferycianua hay thuốc thử DNS

- Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid

I Định lượng đường khử theo phương pháp vi

lượng của Rodzevich

1 Nguyên tắc:

- Trong môi trường kiềm của đường khử có thể khử Cu +2 →

Cu +1 dưới dạng kết tủa màu đỏ (Cu2O) và qua lượng CuSO4

dư (không tham gia phản ứng) tính được lượng đường khử.

CuSO 4 + 4KI + H 2 SO 4  I 2 + CuI 2 + 2K 2 SO 4

I 2 + 2Na 2 S 2 O 3  Na 2 S 4 O 6 +2NaI

Chuẩn độ I2 tạo thành bằng

Na2S2O30,1N.

II Định lượng đường saccarose theo phương

pháp thủy phân bằng acid

C Phân tích Lipid

- Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol Lipid thường gặp là dầu thực vật và mỡ động vật

- Các phương pháp phân tích:

+ Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet

+ Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp ADAM ROSE – GOTTLIEB

+ Phương pháp Chloroform- Methanol

+ Phương pháp Babcook

+ Phương pháp Lolch

C Phân tích Lipid

I Phương pháp Chloroform- Methanol

1 Nguyên tắc.

- Sử dụng methanol, chloroform hòa tan chất béo trong mẫu

thực phẩm  Hỗn hợp tách thành hai lớp  Tách lấy lớp chất béo đem đi sấy khô  cân định lượng

2 Hóa chất.

- Methanol - Chloroform

- KCL 0.88 % - Na2SO4

C Phân tích Lipid

3 Cách tiến hành.(không có protein bao bọc chất béo)

Trộn 1’

1g mẫu + 10ml Methanol

Tách lớp

Lọc

KCL 0.88

Nước

Na 2 SO4Tách nước

C Phân tích Lipid

1 Nguyên tắc: sử dụng H2SO4 để kết tủa protein  hỗn hợp tự tách làm hai lớp  đo thể tích lớp trên chứa chất béo  % chất béo trong hỗn hợp

II Phương pháp Babcook.

60-Xác định thể tích béo

D Phân tích Vitamin

Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật

D Phân tích Vitamin

 Xác định caroten bằng phương pháp sắc kí cột.

- Chiết caroten ra khỏi mẫu thử bằng hỗn hợp ete dầu mỏ và aceton Loại bỏ aceton, tách caroten từ các carotenoid bằng sắc ký cột và xác định hàm lượng caroten bằng đo quang phổ

E Phân tích khoáng

 Chất khoáng là những thành phần còn lại dưới dạng tro sau khi đốt các mô thực vật và động vật Khoáng là thành phần vi lượng cần thiết cho cơ thể

1 UI = 1 micro mol cơ chất

 Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm

chuyển hóa 1 mol chất sau một giây ở đktc

1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây

G Phân tích enzyme

đổi

1 - Thời gian

- Nồng độ enzyme Biến thiên của S hay P

2 - Lượng S mất đi (hay lượng P tạo

4.1 Nguyên tắc

- Dựa trên sự oxy hóa pirogalol thành purpurogalin khi có H2O2.

G Phân tích enzyme

Tiến hành

40 ml dd enzyme +

dd pirogalol 1% + 1ml H2O2 1%

điều nhiệt ( 25 0 C,

15 – 20’) erlen 250 ml

G Phân tích enzyme

Song song với thí nghiệm kiểm chứng

40ml dd enzyme peroxidaza

a,b – số ml KMnO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm và kiểm chứng.

m – trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứng 40 ml dịch chiết

enzyme đem phân tích

G Phân tích enzyme

5 Xác định hoạt lực enzyme zimaza hay maltala

Xác định lực nở men bánh mì

1 Nguyên tắc.

- Dùng hộp nhôm hay tôn có kích thước xác định Dùng thanh gỗ đặt ngang qua bột và đặt lên thành hộp, đặt cao 1.5 cm Tính thời gian bột nở đến thanh gỗ đặt ngang trên bề mặt bột

2 Cách thực hiện.

G Phân tích enzyme

Loại men Thời gian nở hay lực nở (phút) Men rất tốt 65 – 80

G Phân tích enzyme

6 Xác định hoạt độ enzyme β – glucosidasa

6.1 Nguyên tắc

- Phương trình phản ứng:

G Phân tích enzyme

dịch enzyme bị vô hoạt ngay bằng 1 ml Na2CO3 1M bổ sung thêm vào hỗn hợp này 1 ml cơ chất và cũng giữ trong 15 phút

Đường cong chuẩn.

6.3 Công thức tính đơn vị hoạt độ β – glucosidaza

HDE = Trong đó:

HDE: hoạt độ enzyme β – glucosidaza (UI/ml)

a: nồng độ p – NP giải phóng ra (tra theo đồ thị đường

II Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme

1 Hoạt độ riêng

 Được tính bằng số đơn vị hoạt độ E trên một đơn vị

khối lượng protein

 Là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ sạch của chế phẩm E

 Trong quá trình tinh sạch, hoạt độ riêng không tăng => chế phẩm E có độ tinh khiết cao

G Phân tích enzyme

2 Thu nhận chế phẩm enzyme thô

 Bước 1: Phá vỡ tế bào

 Phương pháp: Siêu âm, dùng E, máy nén, sốc nhiệt,…

 Đặc điểm: Chứa nhiều protein khác,nồng độ E thấp

 Bước 2: Cô đặc dịch chiết, gây kết tủa Protein/E

 Dùng dung môi hữu cơ như ethanol, caceton hay muối trung tính

 Mục đích: Tăng nồng độ E, loại bỏ tạp chất

G Phân tích enzyme

3 Tách từng phần và tinh sạch

 Phương pháp sắc ký trao đổi ion

 Phương pháp sắc ký lọc gel (sắc ký lọc rây phân tử)

 Phương pháp ly tâm siêu tốc

 Phương pháp sắc ký ái lực

 Phương pháp điện di chế phẩm hay điện ly không biến tính

G Phân tích enzyme

4 Phương pháp kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzyme.

 Điện di trên gel polyacrylamide biến tính (PAGE)

 Sử dụng gel và đệm có chứa sodium dodecyl sulfate

(SDS)

 Phân tử Protein bị duỗi thẳng và tích điện âm => di chuyển

về cực dương trong điện trường

 Gel được nhuộm coomassie hay bạc nitrate => các protein dưới dạng monome tinh sạch sẽ xuất hiện dưới dạng một băng duy nhất

 SDS – PAGE: Khối lượng phân tử trên băng protein.

Þ Tiểu đơn vị cấu thành của protein tự nhiên

 Thông qua hoạt độ riêng

G Phân tích enzyme

III Ứng dụng enzyme trong phản ứng hóa sinh

1 Xác định cacbohydrate

 Glucose: được xác định bằng phương pháp enzyme

hexokinase (chu trình đường phân)

G Phân tích enzyme

 Fructose : enzym hexokinase cũng tác động lên fructose Ta có thể xác định fructose sau khi xác định glucose

 Galactose : được xác định theo phản ứng sau

 Tinh bột : tinh bột có nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài vi sinh vật Xác định tinh bột theo phương trình phản

ứng sau

G Phân tích enzyme

2 Xác định acid hữu cơ

 Oxalic acid: oxalid acid đóng vai trò quan trọng trong hấp thụ calcium của cơ thể người

 Acetic acid : Thuộc nhóm acid bay hơi, người ta sử dụng

enzyme để xác định acetic acid Acetate có nhiều trong vang

G Phân tích enzyme

3 Xác định alcohol

 Ethanol: ethanol là sản phẩm lên men đường bởi nấm men

 Glycerol: glycerol phổ biến nhiều trong thiên nhiên và có nhiều trong quá trình lên men

G Phân tích enzyme

4 Xác định các thành phần khác

 Cholesterol: cholesterol là một steroid có ý nghĩa rất lớn

trong sinh lý người và động vật

 Acetaldehyde: đây là chất tạo mùi cho bia, yaourt và các loại nước giải khát

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Thí nghiệm phân tích thực phẩm_ Lê Hoàng Du[2] Phân tích hóa học thực phẩm_ Hà Duyên Tư[3] Hóa sinh (Phần III)_ TS Bùi Xuân Đông

[4] Phương pháp phân tích thành phần hóa lý thực phẩm_TS Phạm Tại Huân

[5] Thực hành hóa sinh thực phẩm_ TS Trịnh

Khánh Sơn

[6] Food Analysis _S.Suzanne Nielsen

[7] Food Biochemistry and food processing

Cảm ơn cô và các bạn đã

lắng nghe