Các phương pháp phân tích công nghệ sinh học hiện đại

HƯỚNG DẪNMÔ TẢ MÔN HỌC Giáo trình Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học cung cấp kiến thức cơ bản cho sinhviên đào tạo theo định hướng Công nghệ sinh học về nguyên lý, các kỹ t

Trang 1

ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI

Biên Soạn:

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

www.h u te c h e d u v n

Trang 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ấn bản 2014

Trang 3

MỤC LỤC

MỤC LỤC I

HƯỚNG DẪN IV

BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG … SINH HỌC 1

1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 1

1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 2

1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT 4

TÓM TẮT 7

CÂU HỎI ÔN TẬP 7

BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 8

2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC 8

2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC 15

2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ 16

2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ 17

2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE 18

2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID 19

2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC 24

2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN 29

2.9 TẠO TINH THỂ PROTEIN 32

2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER 34

TÓM TẮT 37

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SỬ DỤNG TRONG SINH HỌC 39

3.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 39

3.2 SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG 42

3.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG SẮC KÝ CỘT 45

3.3.1 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion 46

3.3.2 Sắc ký lọc gel 51

3.3.3 Phương pháp sắc ký ái lực ( affinity chromagraphy) 54

3.3.4 Phương pháp sắc ký cột lỏng (high-performance liquid chromatography) 57

3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 57

3.5 SẮC KÝ KHÍ GC (GAS CHROMATOGRAPHY) 61

TÓM TẮT 63

BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI 65

4.1 KHÁI NIỆM VỀ ĐIỆN DI 65

Trang 4

III MỤC LỤC

4 HƯỚNG DẪN

4.2 ĐIỆN DI TRÊN GEL (POLYCRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS)

66

4.2.1 Giới thiệu phương pháp PAGE 66

4.2.2 Điện di không liên tục 69

4.2.3 Điện di SDS-PAGE 71

4.2.4 Điện di protein theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric Focusing of Protein) 72

4.2.5 Điện di hai chiều (Two-dimensional Electrophoresis) 73

4.2.6 Điện di mao dẫn CE (Capillary Electrophoresis) 75

4.2.7 Điện di miễn dịch IE (Immunoelectrophoresis) 75

4.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN 77

TÓM TẮT 80

BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE 81

5.1 ĐỘNG HỌC ENZYME 81

5.2 THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME 83

5.2.1 Khái niệm chung 83

5.2.2 Xác định họat tính enzyme 85

5.3 ENZYME TYROSINASE 85

5.3.1 Nội dung thí nghiệm 86

5.3.2 Các bước tiến hành 86

5.3.3 Phân tích kết quả 89

5.3.4 Đơn vị họat tính của enzyme 90

5.3.5 Đánh giá các bước tinh chế enzyme 92

TÓM TẮT 93

BÀI 6: BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ 95

6.1 NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ QUANG PHỔ 95

6.1.1 Khái niệm chung 95

6.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ SINH CHẤT 98

6.3 QUANG PHỔ HÙYNH QUANG 101

6.4 PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG DUNG DỊCH 105

TÓM TẮT 108

BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID 109

7.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN THU NHẬN NUCLEIC ACID 109

7.1.1 Thu nhận DNA gồm 3 bước 109

7.1.2 Thu nhận RNA tòan phần và mRNA 111

7.2 THU NHẬN DNA TỪ VI KHUẨN 111

7.2.1 Sơ đồ tách chiết phân đọan DNA từ tế bào vi khuẩn 112

7.2.2 Thu nhận DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 113

Trang 5

7.3 TINH SẠCH NUCLEIC ACID 114

7.3.1 Tinh sạch nucleic acid bằng siêu ly tâm 114

7.3.2 Tinh sạch nucleic acid bằng sắc ký 115

7.4 ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID 115

7.4.1 Định lượng nucleic acid bằng quang phổ kế 116

7.4.2 Định lượng nucleic acid bằng điện di 116

7.4.3 Tinh chế DNA từ gel điện di 117

TÓM TẮT 118

BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 119

8.1 CÁC ENZYME DÙNG TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN 119

8.1.1 Các enzyme cắt giới hạn RE (restrictase) 119

8.1.2 Các enzyme thông dụng khác 120

8.2 ĐIỆN DI NUCLEIC ACID 122

8.3 LAI PHÂN TỬ 123

8.3.1 Cơ sở khoa học của sự lai phân tử 123

8.3.2 Các kiểu lai phân tử 125

8.4 MẪU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU MẪU DÒ 130

8.4.1 Mẫu dò 130

8.4.2 Tác nhân đánh dấu 131

8.4.3 Phương pháp đánh dấu 131

8.5 TÁCH DÒNG DNA (CLONING DNA) 133

8.6 PHẢN ỨNG CHUỖI NHÂN SỢI DNA PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

139 8.6.1 Các bước thực hiện PCR 139

8.6.2 Ứng dụng của PCR 140

8.6.3 Hạn chế của PCR 142

8.7 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA 142

8.8 MICROARRAY 146

TÓM TẮT 148

BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 149

9.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LỌAI KINH ĐIỂN 149

9.2 PHÂN LỌAI PHÂN TỬ 149

9.2.1 Các phương pháp dùng trong phân lọai phân tử 149

9.2.2 Các gen thường dùng trong phân lọai học phân tử 151

9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA ở prokaryote 153

9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium) 155

TÓM TẮT 163

Trang 6

IIIMỤC LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO 164

Trang 7

HƯỚNG DẪN

MÔ TẢ MÔN HỌC

Giáo trình Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học cung cấp kiến thức cơ bản cho sinhviên đào tạo theo định hướng Công nghệ sinh học về nguyên lý, các kỹ thuật và các thiết bị thường sửdụng trong các lĩnh vực nghiên cứu của Công nghệ sinh học hiện đại Chủ yếu tập trung vào nhóm cácphương pháp và thiết bị phân tích protein và nucleic acid, hai đối tượng nghiên cứu chính của Côngnghệ sinh học hiện đại Giáo trình gồm 9 bài giảng

NỘI DUNG MÔN HỌC

Bài 1: Giới thiệu phòng thí nghiệm nghiên cứu CNSH và các thao tác cơ bản chuẩn bị làm việc trongphòng thí nghiệm CNSH

Bài 2: Giới thiệu tổng quan những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu CNSH gồm phương pháp sửdụng các lọai điện cực và biosensor, phương pháp chuẩn bị đệm, các phương pháp phân tích hóasinh truyền thống, phương pháp thẩm tích và lọc, ly tâm theo mẻ và liên tục, sấy phun và đôngkhô, tạo tinh thể và các phương pháp xác định MW của biopolymer

Bài 3: Giới thiệu nguyên lý của phương pháp sắc ký, chủ yếu tập trung vào sắc ký trao đổi ion, lọcgel, sắc ký ái lực và HPLC trong thu nhận và tinh sạch protein Các phương pháp này được trình bầytheo các bước trong quy trình thu nhận và tinh sạch protein gồm 4 modul Cuối cùng là các phươngpháp sắc ký thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp, sự phát triển của các phương pháp sắc ký

ái lực, từ sử dụng nguyên lý ái lực kháng nguyên/kháng thể đến ái lực enzyme/cơ chất trong cộtGST và ái lực thứ tự amino acid His với Ni trong cột Nikel

Bài 4: Giới thiệu phương pháp điện di bao gồm nguyên lý của phương pháp điện di, các kiểu điện diphân tách, tinh sạch và thu nhận protein và nucleic acid

Bài 5: Giới thiệu về enzyme tyrosinase Phân tích các bước trong nghiên cứu động học tyrosinase Đâynhư là bài thực hành lớn nhằm giúp sinh viên biết cách tiếp cận phương pháp phân tích động họcphản ứng xúc tác bởi enzyme

Trang 8

VHƯỚNG DẪN

Bài 6: Giới thiệu phương pháp phân tích quang phổ bao gồm nguyên lý, cấu tạo của 3 lọai thiết bị đoquang hấp phụ (OD) thường sử dụng là máy so mầu, quang phổ khả kiến và UV, quang phổhùynh quang Giới thiệu sơ lược về công hưởng từ hạt nhân, phương pháp ghi phổ nhiễu xạ tia X

và khối phổ MS Sử dụng 5 phương pháp phân tích quang phổ để định lượng protein

Bài 7: Tách chiết và định lượng nucleic acid giới thiệu các phương pháp cơ bản thu nhận DNA và RNAtòan phần từ tế bào vi khuẩn, thực vật và đông vật Thu nhận plasmid từ tế bào vi khuẩn Tinh sạchnucleic acid bằng ly tâm, bằng sắc ký, định tính và định lượng nucleic acid bằng quang phổ, bằngđiện di Tinh chế nucleic acid bằng điện di

Bài 8: Giới thiệu các kỹ thuật cơ bản sử dụng trong sinh học phân tử bao gồm các nhóm enzyme sửdụng trong nghiên cứu sinh học phân tử, điện di nucleic acid, phương pháp lai phân tử, Các lọaimẫu dò và phương pháp chế tạo, tách dòng DNA, phương pháp PCR và mục đích sử dụng, xácđịnh thứ tự nucleotide và microarray

Bài 9: Phân lọai học phân tử giới thiệu cơ sở khoa học của phương pháp phân lọai truyền thống vàphương pháp phân lọai phân tử Giới thiệu bản chất của phương pháp phân lọai phân tử, các genthường sử dụng cho phân lọai ở tế bào prokaryote và eukaryote Giới thiệu các bước thực hiệntrong phân lọai phân tử vi khuẩn và hoa lan

KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ

Môn học Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học mô đòi hỏi sinh viên có nền tảng về Hóa sinh, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học

YÊU CẦU MÔN HỌC

Người học phải dự học đầy đủ các buổi lên lớp và làm bài tập đầy đủ ở nhà

Trang 9

CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC

Để học tốt môn này, người học cần ôn tập các bài đã học, trả lời các câu hỏi và làm đầy đủ bàitập; đọc trước bài mới và tìm thêm các thông tin liên quan đến bài học

Đối với mỗi bài học, người học đọc trước mục tiêu và tóm tắt bài học, sau đó đọc nội dung bàihọc Kết thúc mỗi ý của bài học, người đọc trả lời câu hỏi ôn tập và kết thúc toàn bộ bài học, người đọclàm các bài tập

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC

Môn học được đánh giá gồm:

Điểm quá trình: 30% Hình thức và nội dung do GV quyết định, phù hợp với quy chế đào tạo và tình hình thực tế tại nơi tổ chức học tập

Điểm thi: 70% Hình thức bài thi tự luận trong 60 phút Nội dung thuộc bài thứ 1 đến bài thứ 9

Trang 10

BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1 BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ

THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Yêu cầu:

- Nắm được nội dung trong Quy định an tòan trong phòng thí nghiệm CNSH

- Nắm được yêu cầu và cách thức chuẩn bị và bảo quản dung dịch và hóa chất thí

nghiệm

- Hiểu được cách thức chuẩn bị nước cất và nước siêu tinh khiết sử dụng trong phòng thí nghiệm.

1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Trước khi bắt đầu làm việc trong phòng thí nghiệm, việc đầu tiên là phải nắm vững những quy định antoàn trong phòng thí nghiệm, làm quen với các chỉ dẫn về độ độc hại hóa chất sử dụng, các yếu tố gâynguy hiểm Các biện pháp và thiết bị bảo vệ Trong đó việc tuân thủ quy định làm việc trong phòng thínghiệm có ý nghĩa rất quan trọng

1 Phải luôn đeo kính phòng hộ khi làm thí nghiệm

2 Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm

3 Phải nắm vững tính chất hóa học và tính chất vật lý của tất cả hóa chất sử dụng trong phòng thínghiệm Tuân thủ bảng hướng dẫn sử dụng hóa chất Luôn phải đeo găng tay khi làm việc với hóachất hay yếu tố lây nhiễm

Trang 11

4 Nghiêm cấm ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.

5 Nghiêm cấm thực hành thí nghiệm chưa được dạy

6 Không dùng miệng hút hóa chất bằng pipet hay ống hút

7 Làm quen với hướng dẫn an tòan trong phòng thí nghiệm Phải biết rõ vị trí bình cứu hỏa, tủ thuốc y tế, vị trí nguồn cấp điện, cấp nước

8 Phải tuân thủ hướng dẫn của người có trách nhiệm Phải ghi kết quả thí nghiệm hoặc những vấn đề nẩy sinh, khúc mắc trong nhật ký phòng thí nghiệm của mình

Hình 1.1: Bảng đánh giá an tòan hóa chất của acetic acid theo HMIS (Hazardous

Materials Indentification System) 1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

Hiện dụng cụ thí nghiệm bằng nhựa, chủ yếu từ polyethylene được sử dụng khá phổ biến Trướckhi sử dụng lần đầu phải rửa dung cụ nhựa bằng dung dịch urea 8M ( điều chỉnh về pH 1 bằng HCl).Sau đó tráng bằng nước cất Rửa tiếp bằng dung dịch KOH 1 N, tráng lại bằng nước cất Sau đó trángbằng dịch EDTA 10-3 M để lọai bỏ kim lọai ở dạng vết Sau lần xử lý này, chỉ cần rửa bằng dịch tẩy rửa(dịch xà bông) và tráng bằng nước cất là đạt yêu cầu

Nhiều chất hữa cơ và kim lọai hay bám trên bề mặt dung cụ thí nghiệm Thông

thường có thể lọai bỏ chúng bằng dịch xà bông 0,5% Sau đó tráng kỹ bằng nước cất

Trang 12

hoặc nước trao đổi ion là đủ Trong nhiều trường hợp phải sử dụng dụng cụ thí nghiệm khô

Có thể làm khô bằng cách tráng dụng cụ thí nghiệm bằng acetone Nhưng tốt hơn cả là sau khirửa sạch bằng nước cất, hong cho khô và sấy trong tủ sấy Lưu ý không sấy ống ly tâm bằngcellulose nitrate trong tủ sấy, vì cellulose nitrate là chất dễ nổ

Không rửa cuvette, đặc biệt là cuvette bằng thạch anh hoặc dụng cụ quang học, bằng dịch KOH phatrong cồn, vì dịch này có thể ăn mòn bề mặt của chúng Chỉ cần rửa bằng dịch xà bông 0,5%, dùng quecuốn bông để rửa và sau đó tráng lại bằng nước cất là đạt yêu cầu Trong thực hành phòng thí nghiệm,

để định lượng dung dịch người ta thường sử dụng một số dạng pipet và công cụ hỗ trợ hút dịch như

mô tả trong hình sau

Hình 1.2: Một số dụng cụ định lượng thể tích dịch truyền thống

Hút dịch vào pipet nhờ quả bóp cao su Chú ý không cho dịch tràn vào quả bóp cao su Tiện dụnghơn cả là dùng pipet tự động

Trang 13

Hình 1.3: Thao tác lấy dịch bằng pipet tự động

1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT

Nước dùng trong phòng thí nghiệm thường ở các dạng phổ biến sau: nước trao đổi ion, nước thẩm

tinh sạch bằng thấu ngược và nước cất Tuỳ thuộc mục đích sử dụng, người ta cân nhắc nên sử dụng

loại nước nào cho phù hợp Nước nhận được từ cột trao đổi ion chứa rất ít ion kim loại, nhưng vẫncòn chứa các chất hữu cơ bị thôi ra từ nhựa trao đổi ion, làm gia tăng độ hấp phụ tia UV của nước Dovậy trong thí nghiệm sử dụng phép đo UV, nên sử dụng nước cất, không nên dùng nước trao đổi ion.Nước cất được tạo thành trong quá trình ngưng tụ nước sôi từ nồi cất kim loại hoặc thuỷ tinh Nướccất ngưng tụ từ nồi chưng cất kim loại vẫn còn chứa một ít ion kim loại, có thể ảnh hưởng đến kết quảthí nghiệm Do chúng kết hợp với hoá chất sử dụng hoặc với mẫu đo Nước cất hầu như khôngchứa chất hữu cơ, nếu tốc độ cất nước tương đối chậm Nước cất bằng thiết bị thuỷ tinh là tốt nhất.Tốt nhất là sử dụng nước khử ion để cất nước Không nên sử dụng nước máy, vì muối trong nước máy

sẽ bám cặn lên bộ đốt, làm giảm chất lượng của nước cất Khi bộ đốt bị bám cặn muối, làm sạch nóbằng cách ngâm vào nước giấm hoặc dung dịch HCl 10%

Nước cất tinh khiết thường bị nhiễm bẩn trong quá trình bảo quản Do tia UV giải phóng một số chấthữu cơ từ thùng, can nhựa, ion kim loại tạo lớp trên bề mặt chai thủy tinh đựng nước cất Nước cấtbằng thiết bị chưng cất thuỷ tinh ít khi bị vi sinh vật gây nhiễm Thực nghiệm cho thấy nước cất tinhkhiết có thể bảo quản được lâu trong bình thủy tinh, nút chặt và để trong tủ lạnh Nếu trong bình chứanước cất thấy có vi sinh vật phát triển, phải đổ bỏ, không sử dụng Để phá huỷ chất hữu cơ gây nhiễmbẩn, người ta thường cất hỗn hợp (1lít nước + 1 g potassium permanganate

+1ml 85% phosphour acid)

Trang 14

Hình 1.4: Hệ thống thu nhận nước cất (trái) và nước trao đổi ion (phải)

Quá trình lọai bỏ khóang khỏi nước gọi là làm mềm nước nhờ trao đổi ion Người ta cho nước chẩy

qua nền nhựa tẩm Na Ion Ca+2 trong nước sẽ bị hấp phụ lên hạt nhựa thế chỗ của Na+ Quá trình traođổi ion từ từ, các hạt nhựa cũng từ từ hấp phụ Ca+2, và nhả vào nước Na+ và K+ không ảnh hưởngđến sức khỏe của người

Hình 1.5 Hệ thống thu nhận nước thẩm thấu ngược

Nước tinh khiết tạo thành trong quá trình thẩm thấu ngược nhờ áp suất ép nước qua màng được

chế tạo đặc biệt, có khả năng giữ lại cả các ion khóang

Trang 15

Chuẩn bị dịch và bảo quản hóa chất:

Việc chuẩn bị dung dịch và bảo quản hóa chất phải tuân thủ qui định của nhà sản xuất Nồng độ củadung dịch hóa chất thường thể hiện theo độ mol, độ chuẩn hoặc theo % Theo trọng lượng hoặc theo thểtích, hoặc theo trọng lượng/thể tích (mg/ml hoặc g/lit) Tốt nhất là bảo quản dung dịch trong tủ lạnh.Khi chuẩn bị dung dịch phải tính đến độ ngậm nước của hoá chất để tạo được dung dịch đạt nồng độmong muốn

Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm thu được bằng cách tính thông thường hoặc sử dụng phầnmềm phù hợp

Trang 16

TÓM TẮT

Trong bài này, học viên làm quen với các quy định chung về an tòan làm việc trong phòng thí nghiệm CNSH Trước tiên là phải thực hiện đầy đủ nội quy làm việc trong phòng thí nghiệm Đặc biệt lưu ý đến an tòan phòng chống cháy, nổ và hóa chất độc hại Sinh viên phải làm quen và hiểu các ký hiệu ghi trên các lọ hóa chất.

Điểm tiếp theo là sinh viên phải làm quen và biết những đặc thù làm việc với các đối tượng sống như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men và các quy định an tòan sinh học.

Sinh viên phải biết các lọai dụng cụ, các lọai thiết bị thường sử dụng trong phòng thí nghiệm CNSH Phải biết cách sử dụng các dụng cụ và thiết bị này cũng như việc chuẩn bị và bảo quản chúng Sinh viên phải làm quen với các công tác chuẩn bị làm việc trong phòng thí nghiệm CNSH Đó là việc chuẩn bị các lọai nước cất, nước siêu tinh khiết sử dụng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau Cách thức bảo quản và sử dụng nước cất và nước siêu tinh khiết Sinh viên phải làm quen và nắm được cách thức chuẩn bị dung dịch và hóa chất thí nghiệm Những điểm cần lưu ý trong quá trình chuẩn bị cũng như cách thức bảo quản dung dịch và hóa chất thí nghiệm.

CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1: Cho biết các ký hiệu hay sử dụng liên quan đến an tòan đối với hóa chất sử dụng trong

Trang 17

BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN

TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Yêu cầu:

- Hiểu được bản chất của dung dịch đệm, độ pH, điện cực

- Biết khái niệm về đầu dò sinh học

- Nắm được kỹ thuật thẩm tích, siêu lọc, định lượng nitơ, carbohydrate, lipid

- Nắm được kỹ thuật đông khô, sấy phun

- Hiểu được cách xác định trọng lượng đại phân tử

2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC

Thông thường độ pH của dịch thí nghiệm được đo bằng pH kế Bộ phận quan trọng nhất là điện cực.Các điện cực có thể sử dụng đơn lẻ (gồm điện cực thuỷ tinh nhạy với sự thay đổi nồng độ H+ và điệncực so sánh, còn gọi là điện cực calomel) Hiện phổ biến hơn cả là sử dụng điện cực kép, kết hợp 2điện cực trên

Trước khi sử dụng phải kiểm tra dung dịch KCl bão hoà bên trong điện cực Nếu mức dung dịchKCl bão hoà trong điện cực thấp, phải bổ sung thêm dung dịch KCl bão hoà mới qua lỗ bên hôngđiện cực Trước khi chuẩn máy đo pH, phải điều chỉnh nhiệt độ về nhiệt độ của dung dịch pH chuẩn vàdung dịch cần đo Nhấc điện cực ra khỏi dung dịch bảo quản, rửa kỹ bằng nước cất và lau khô bằnggiấy thấm Ngâm điện cực vào dung dịch đệm chuẩn thứ nhất và điều chỉnh giá trị pH về giá trị pH củađệm chuẩn, cho đến khi chỉ số pH trên máy đo ổn định Lấy điện cực ra khỏi dung dịch đệm thứnhất, rửa và lau điện cực như mô tả ở trên Lặp lại thao tác đo pH đối

Trang 18

9 BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 9

với dung dịch đệm chuẩn thứ hai Giá trị pH đo được phải nằm trong khoảng sai số 

0,05 đơn vị so với giá trị của dung dịch đệm chuẩn thứ nhất Nếu không đạt, phải chỉnh lại pH theo giátrị chuẩn nói trên và kiểm tra lại đối với dung dịch đệm chuẩn thứ nhất Điện cực rất dễ hỏng, dovậy phải rất cẩn thận trong thao tác Điện cực thuỷ tinh luôn được bảo quản trong dung dịch KCl 3M.Sau khi được rửa sạch và lau khô Khi đo dịch protein, thường protein bám màng trên bề mặt điện cực,làm sai lệch kết quả Trong trường hợp này có thể xử lý bằng cách nhúng điện cực vào dịchpepsin 5% trong 0,1 N HCl khoảng 2 giờ Sau đó rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô và giữ trongdung dịch bảo quản

Dịch đệm có nồng độ muối cao ảnh hưởng khá mạnh lên kết quả đo, vì giá trị pH phụ thuộc vào độhoạt động của ion, chứ không phụ thuộc vào nồng độ muối Ở dung dịch loãng, độ hoạt động của ionthường tương ứng với nồng độ Còn ở dung dịch nồng độ muối cao, độ hoạt động của ionkhông tương ứng với nồng độ của muối.Trong thực tế, thường người ta chuẩn bị sẵn dung dịch

mẹ (stock) Khi tiến hành thí nghiệm, người ta sẽ chuẩn bị dung dịch sử dụng, từ dung dịch mẹ Dovậy, phải xác định pH của dung dịch sử dụng, sau khi pha loãng từ dung dịch mẹ

Nhiệt độ cũng ảnh hưởng lên phép đo pH, do hằng số phân ly pKa phụ thuộc vào nhiệt độ theo giátrị pKa/ 0C = - 0,031 Thí dụ đệm Tris ở 40C có giá trị là 7,0, trong

khi ở 370C giảm xuống chỉ còn 5,95 Do vậy trong thực tế phải điều chỉnh pH của dịch đệm vềgiá trị sử dụng là 5,95

Phương trình Henderson-Hasselbalch cho phép tính giá trị pH khi biết tỷ lệ nồng độ mol của cặpacid-base [A-]/[HA] và pKa của HA (giá trị pKa có trong các sách tra cứu

hóa học)

pH  pKa  log [ A

 ] [

HA]

Trong thực tế, đệm tốt nhất là đệm chứa nồng độ tương đương của HA và A- Khi [A-] = [HA] thì

pH = pKa Có nghĩa là pKa của cặp acid-base nằm ở tâm của vùng đệm hoạt động Một số hệ đệm dùngphổ biến trong nghiên cứu sinh học được ghi nhận trong bảng

Trang 19

từ 6 đến 8 Tuy nhiên cũng có trường hợp xảy ra ở vùng đệm có giá trị rộng hơn từ 2 đến 12 Khó cócặp acid và base nào phù hợp cho cả khoảng rộng pH nói trên Do vậy thường người ta dùng kết hợpmột số hệ đệm, thông dụng hơn cả là hệ đệm phosphate, citrate và succinate.

Đệm phosphate được sử dụng rộng rãi nhất, độ đệm của nó nằm trong khoảng pH

6,5-7,5 và bản thân phosphate là muối phổ biến trong tế bào Chủ yếu đệm phosphate được tạo

từ dung dich Na-phosphate và K-phosphate Nhược điểm chủ yếu là đệm phosphate thường tạo cặn vớimột số ion cần cho hoạt động sống, là Ca+2 và Mg+2 Đôi khi đệm phosphate ức chế một số enzyme

Hình 2.1: Các hệ đệm thường dùng trong nghiên cứu sinh học

Trang 20

Hình 2.2: Hệ điện cực đo pH cổ điển (trái) và điện cực kép (phải)

Trang 21

tính, được sử dụng rộng rãi với vùng pH tối ưu nằm trong khoảng

7,5-8,5 Tris ở dạng tinh thể có tính base, dễ định lượng và hoà tan tốt trong nước

Thí dụ để chuẩn bị 1 lít 0,1 M đệm Tris, người ta cân 12,11 g (0,1mol), hoà tan trong

950-975 ml nước cất Bổ sung HCl đậm đặc, khuấy và điều chỉnh cho đến khi đạt pH mong muốn Cuốicùng bổ sung nước cất đến 1 lít Tuy là amine bậc một, Tris hầu như không ảnh hưởng đến các phảnứng sinh hoá, không tạo tủa với Ca+2 Tuy nhiên pH của đệm phụ thuộc vào nồng độ Giá trị pH giảm0,1 đơn vị khi pha loãng 10 lần Đệm Tris có thể có ảnh hưởng đến một số loại điện cực và sự thay đổi

do nhiệt của nó cao hơn so với các loại đệm khác Để khắc phục, nên đo pH sau khi đã pha loãngđệm, sử dụng điện cực phù hợp và chuẩn bị đệm ở nhiệt độ thực hiện

Đệm carboxylic acid bao gồm các đệm acetate, fumarate, citrate và suscinate, chủ yếu dùng chovùng đệm có giá trị pH từ 3 đến 6 Do tất cả chúng đều là chất trao đổi, nên có ảnh hưởng tới các phảnứng sinh học Ngoài ra, citrate và suscinate còn tạo phức với Fe+3, Zn+2, Mg+2… Đệm fumarate có ưuthế là dễ bay hơi, nên trong một số trường hợp có thể loại bỏ dễ dàng nhờ áp suất âm Đệm borate có giátrị vùng đệm trong khỏang pH từ 8,5 đến 10 Nhược điểm chủ yếu là nó dễ tạo phức với nhiều chất traođổi, đặc biệt là với các chất carbohydrate

Đệm lưỡng tính (Zwitterionic buffer hay Good’s buffer) (1972), khắc phục được một số hạn chếcủa các hệ đệm nói trên Do vậy hiện được sử dụng rất rộng rãi Hạn chế chủ yếu là giá thành cao.Lưu ý là những đệm lưỡng tính phổ biến như Tris, HEPES và PIPES, thường chứa các gốc tự do nênkhông thể sử dụng trong nghiên cứu phản ứng oxyhoá – khử

Điện cực oxy là điện cực đo nồng độ oxy tan trong dung dịch Điện cực oxy gồm: catod bằng Pt,anod bằng Ag gắn vào tấm epoxy Đầu cực bọc màng teflon và được cố định bằng khuyên tròn.Màng này ngăn cách hai điện cực ngâm trong dung dịch KCl bão hoà với dung dịch cần đo trongngăn đựng mẫu Màng teflon cho phép O2 và các khí khác qua lại dễ dàng Khi tiếp xúc với bề mặtcatod Pt, phân tử khí O2 sẽ bị

khử trên bề mặt điện cực: O2 +4 e- + 2H2O  4 OH- Còn trên anode sẽ xẩy ra phản

ứng 4 Ag0 + 4 Cl-  4AgCl- + 4e- Tổng thể sẽ là 4 Ag0 + O2 + 4 Cl- +2 H2O  4

AgCl +4 OH-

Trang 22

Hình 2.3: Sơ đồ họat động của điện cực đo oxy trong dung dịch

Như vậy dòng điện đi qua hệ điện cực tỷ lệ thuận với O2 thẩm thấu qua màng Đồng nghĩa với sốlượng O2 hoà tan trong dung dịch Dòng điện trên được khuyếch đại và ghi nhận theo đơn vị bão hoàoxy Điện cực oxy được sử dụng trong các nghiên cứu liên quan đến trao đổi oxy (phản ứng oxyhoákhử, kiểm soát cung cấp khí cho quá trình lên men trong các bioreactor) Cần đặc biệt chú ý tớimàng teflon, nếu màng bị nhàu, bị thủng, bề mặt màng bị bẩn, thì kết quả nhận được sẽ bị sai lệch.Không được lấy tay sờ lên màng, không làm bẩn màng bằng hoá chất hoặc chất có dầu khi tiến hànhbọc màng lên điện cực Màng cũng hay bị bít bởi protein hay hoá chất có mặt trong ngăn đựng mẫu đo.Kinh nghiệm cho thấy cần thường xuyên kiểm tra màng bằng kính hiển vi có độ phóng đại thấp Cựcanod bằng bạc thường xuyên phải được rửa bằng dung dịch NH4OH nhằm tẩy Ag sulfate, giữ bề mặtđiện cực sáng bóng Nhiệt độ đo cũng rất quan trọng Do vậy điện cực đo thường đặt trong buồng ổnnhiệt, có khuấy từ tránh làm suy giảm oxy trên bề mặt cathode Sự xuất hiện bọt khí trong buồngmẫu đo hoặc trong dung dịch KCl sẽ làm sai lệch kết quả đo, vì bọt khí chứa O2 nhiều hơn trong nướcbão hoà tới 20 lần

Trang 24

2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC

Cho đến nay điện cực đo ion H+ và O2 đã được phát triển rất mạnh Tuy nhiên một số ion, hoặc khíkhác cũng có thể đo được nhờ các hệ điện cực đặc hiệu hoạt động tương tự như điện cực oxy Mỗi loạiđiện cực ion được chế tạo từ vật liệu màng đặc biệt khác nhau, cho phép từng loại ion thẩm thấu qualại dễ dàng Điện cực ion có độ nhạy cao, thiết bị đơn giản, thao tác nhanh Nhược điểm chủ yếu

là kết quả đo thường bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion khác Do vậy thao tác chủ yếu trong phép

đo dùng điện cực ion là tìm cách ngụy trang ion cần đo, hoặc loại bỏ ảnh hưởng của các ion khác

Bảng 1.2: Điện cực ion đặc hiệu

Hình 2.4: Sơ đồ họat động của đầu dò sinh học

Trang 25

chất trao đổi) Thí dụ đo nồng độ urea, carbohydrate, enzyme, kháng thể và các chất trao đổi Về bảnchất, đầu dò sinh học là thiết bị đo gồm đầu dò chứa yếu tố sinh học, làm nhiệm vụ phát hiện, tạo tínhiệu sinh học Chúng thường là enzyme, kháng thể, tế bào, thậm chí bào quan … ở dạng cố định và bộbiến tín hiệu sinh học thành tín hiệu thể hiện trên thiết bị đo.

Lực ion của dung dịch biểu hiện nồng độ của ion trong dung dịch, có ảnh hưởng lên tính chất

của các chất tham gia quá trình sinh học cụ thể nào đấy Lực ion I của dung dịch liên quan đến tất cả cácion có mặt trong dung dịch và được tính bằng công thức:

Trong đó ci là nồng độ mol (M, mol/L) của ion i Đối với chất điện phân như NaCl, thì lực ion bằngnồng độ Nhưng đối với MgSO4, thì lực ion lại gấp 4 lần Ion đa hóa trị có lực ion mạnh hơn ion đơnhóa trị Thí dụ lực ion của 0,050 M của Na2SO4 trong dung dịch 0,020 M trong dịch KCl sẽ là:

I = 1/2 × [(0.050 M × 2 × (+1)2) + (0.050 M × 1 × (−2)2) + (0.020 M × 1 × (+1)2)

+ 0.020 M × 1 × (−1)2)] = 0.17 M

2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ

Dung dịch hóa chất thường được chuẩn bị theo một số cách thể hiện nồng độ sau:

- Nồng độ % tính theo khối lượng, là số g chất trong 100 g hỗn hợp (độ Brix)

- Nồng độ % tính theo thể tích, là số g trong 100 ml

- Nồng độ mol (M), là số gram mol/1 lít

- Nồng độ nguyên chuẩn N, là số gram nguyên chuẩn/1 lít Gram nguyên chuẩn bằng tỷ lệ củaphân tử lượng/số ion H+ (đối với acid) hay OH- (đối với kiềm) trao đổi Thí dụ HCL trao đổi 1 H+,

còn H2SO4 trao đổi 2 ion H+ Để biết độ N, so sánh dung dịch ta chuẩn bị với dịch có số N chuẩn

đã bíết.

Trang 26

BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

17 BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ

Nitơ tổng số xác định theo nguyên tắc là khi vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4, thì nitơ trong mẫu sẽ trở

thành dạng ammonium sulfate Chất này khi cho tác dụng với kiềm sẽ phóng thích NH3 ở dạng(NH4OH)

(NH4)2SO4 + NaOH  NH4OH + Na2 SO4Hơi nước lôi cuốn NH3 từ dịch nhờ máy Parnas-Wargner, tạo sự dư acid trong dịch Chuẩn độlượng acid dư sẽ biết được lượng NH3 phóng thích Từ đó sẽ biết được tổng lượng đạm trong mẫu phântích

Hình 2.5: Thiết bị lôi cuốn NH3 trong máy Parnas-Wargner cổ điển và thiết bị tự

động

N formol (phương pháp Sorensen) để xác định đạm “protein” trong dịch chứa hỗn hợp nhiều lọai

đạm (protein, peptide, amino acid, ammoniac, amine ) người ta dùng phương pháp Sorensen Trong đóformol sẽ tác dụng với nhóm –NH2 tạo phức methylene (mono-, tri- và hexamethylene)

HOOC-CH(R)-NH2 + HCHO  HOOC-CH(R)-N=CH2 + H2O

R-NH4+Cl + HCHO  R-N=CH2 + H2O + HClGốc HOOC- và HCl xuất hiện sẽ được xác định bằng cách chuẩn độ để biết lượng –

NH2

Trang 27

N-ammonium (ở dạng muối ammonium hay amine) là sản phẩm phân hủy của protein, là dạng đạm

mất phẩm chất Chúng có tính kiềm yếu, được xác định bằng cách dùng MgO đuổi NH4+ ra khỏi dịch

và lôi cuốn theo hơi nước qua bình đựng lượng acid dư Định lượng acid còn lại sau phản ứng sẽ giántiếp biết được lượng đạm amon có trong mẫu phân tích

2(NH4)+ + Mg(OH)2  2 NH3 + 2H2O + Mg+2

2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4

2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE

Định lượng đường hòa tan dựa vào phản ứng mầu của đường khi có sự hiện diện của H2SO4.

Tiến hành như sau: Ly trích đường từ mẫu sinh khối bằng cồn 90o, đun cách thủy, lọc lấy phần dịchtrong (dịch cồn chứa đường), không lấy cặn Bổ sung cồn

80o vào phần cặn, chiết tiếp để lấy đường Cuối cùng cho phần bã lên giấy lọc và rửa

bằng cồn vài lần, để ly trích và thu hết đường có trong mẫu Tiếp theo cho bay hơi cồn ở nhiệt độphòng, hay đun cách thủy ở điều kiện nhẹ nhàng Cặn khô trong cốc thủy tinh pha với nước cất Lọc lấydịch trong và cho tác dụng với:

- Phenol: Dịch đường + Phenol + H2SO4 đậm đặc, sẽ xuất hiện mầu

- Orcinol: Dịch đường + Orcinol + H2SO4 đậm đặc, đun cách thủy ở 80oC, để lạnh sẽ xuất hiện mầu, đo ở bước sóng 520 nm hoặc 470 nm

- Anthrol: Dịch đường + Anthrol đun sôi khỏang 7 phút, để nguội, dịch xuất hiện mầu, đo ở

630 nm

Đường khử : Đun cách thủy mẫu với H2SO4 (hay HCl) trong khỏang 1 giờ, trung hòa bằng NaOH.

Định lượng đường khử bằng thuốc thử Schaffer-Hartmann khử Cu Để xác định lượng iod phóngthích, dùng tinh bột làm chất chỉ thị Cũng có thể xác định đường khử bằng phương pháp so mầu khidịch chứa Fe+3 bị khử thành Fe+2 Đo ở bước sóng 690 nm

Phân tích thành phần đường trong dung dịch

Carbohydrate có mặt trong tất cả các cơ thể sống Điều đặc biệt là chúng có mặt ở một số dạng cấutrúc không gian lập thể khác nhau, do chứa nhiều nguyên tử C bất đối xứng Có thể xác định cácđơn vị đường thành phần tạo nên carbohydrate bằng

Trang 28

phương pháp đo độ quay quang bằng phân cực kế hoặc bằng phương pháp hóa học Trong

đó phương pháp đo độ quay quang của dịch đường bằng phân cực kế phổ biến hơn

Trước hết cần xác định độ quay quang []20D Đổ đầy dịch đường cần định danh tên hoặc xác định nồng độ vào buồng đo (cuvette) của phân cực kế Khi đo phải giữ

nhiệt độ của buồng đo luôn ổn định bằng cách điều chỉnh nhiệt độ của áo nước bọc xung quanh Thôngthường người ta điều chỉnh nhiệt độ về 20oC, được chọn là nhiệt độ chuẩn Tuy nhiên, do phân tửđường còn tồn tại ở dạng hỗn hợp, nên cũng cần phải xác định thêm giá trị quay quang của hỗn hợp.Hai kết quả nhận được cho phép định danh đường cần xác định theo bảng chuẩn

Hình 2.6: Sơ đồ họat động của phân cực kế

Hình 2.7: Biến đổi qua lại giữa 2 dạng đồng phân quang học D-glucose và

-D glucose trong dung dịch

2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID

Lipid tổng số được xác định bằng cách dùng ether, phổ biến nhất là ether dầu hỏa, để ly trích lipid từ

mẫu chứa trong các gói giấy thấm đặt trong buồng ly trích của máy

Trang 29

Soxhlet Ly trích cho kiệt lipid, lấy các túi ra, để khô, sấy cho đến trọng lượng không đổi % lipid tổng

số (gr hay mg) là hiệu số của khối lượng túi giấy trước khi ly trích m1 (gr hay mg) - khối lượng túigiấy lọc sau ly trích m2 (gr hay mg) chia cho khối lượng túi giấy trước khi ly trích m1 và nhân với

100 % lipid = (m1 - m2)/m1 x

100

Chỉ số xà phòng là số mg KOH để xà phòng hóa acid béo trong 1 g chất béo.

Chỉ số acid là số mg KOH để trung hòa tất cả các acid béo tự do trong 1 g chất

béo

Chỉ số iod là số g I2 kết hợp với 100 g chất béo (2 iod kết hợp với 1 liên kết đôi).

Hình 2.8: Hệ soxhlet cổ điển và máy chiết lipid hiện đại

Phân tích thành phần lipid

Lipid là nhóm phân tử sinh chất có MW không lớn chiết tách từ sinh khối bằng dung môi hữu

cơ Các nhóm lipid chủ yếu là triacylglycerol, glycerophospholipid, sphingolipid, glycolipid và sterol.

Tuy cấu trúc của lipid có vẻ đơn giản, nhưng chức năng sinh học của chúng lại rất phức tạp Thể hiệntrong họat động chức năng của màng tế bào, vitamin tan trong dầu, cơ chế nhận biết và truyền tải thôngtin hóa học giữa tế bào và năng lượng sinh học

Để nghiên cứu thành phần lipid của hạt nhụ đầu khấu (làm thí dụ), trước tiên tiến hành ly trích lipid

từ đối tượng bằng các lọai dung môi có độ phân cực khác nhau, kết

Trang 30

hợp xử lý nhiệt và lọc tách lấy bã và dịch Do lipid kém phân cực, nên dung môi hữu cơ là phù hợp đểchiết tách chúng Người ta thường sử dụng riêng từng lọai dung môi hữu cơ, có độ phân cực khác nhau,

để tách chiết các nhóm lipid có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên phổ biến hơn cả là sử dụng hệ dungmôi gồm một số dung môi hữu cơ pha trộn theo các tỷ lệ khác nhau, để lần lượt thu nhận các phân đọanlipid

Dịch sau đó thường được cô quay chân không, để lọai bớt dung môi Dùng hexane hòa tan tủa Lọctách cặn và dịch chứa lipid thô Xử lý dịch lipid thô bằng silicagel, hay tạo tinh thể bằng cách hòa

tan trong acetone Kết quả nhận được lipid tinh sạch Phân tích thành phần lipid bằng sắc ký bản mỏng,

hay sắc ký khí.

Hình 2.9: Sơ đồ tách chiết phân đọan lipid từ hạt nhục đầu khấu

Trang 31

Hình 2.10: Thiết bị cô quay chân không

Hình 2.11: Thứ tự rửa thôi các phân đọan lipid từ cột sắc

ký trên nền silica gel

Trang 32

Hình 2.12: Sắc ký bản mỏng TLC tách lipid Hệ dung môi chạy là hexane- acetic acid (90:10:1) (1) cholesterol, (2) acid béo, (3)

diethylether-triacylglycerol, (4) methyl ester của acid béo, (5) Cholesterol ester, (6) glycerophosphatide, (7)

sphingolipid, (8) 1,3- hay 1,2- diacylglycerol, (9) 1- hay 2- monoacylglycerol.

Rf đối với (5) là cholesterol ester tính như sau:

Rf = Khỏang di chuyển của cholesterol ester/Khỏang di chuyển của dung môi =

A/B = 72 mm/85 mm = 0,85

Cuối cùng để biết thành phần acid béo từ nguồn sinh khối ban đầu nói trên, người ta tiến hành tách phân đọan theo sơ đồ Trong đó có sử dụng kỹ thuật sắc ký khí

Trang 33

Hình 2.13: Sơ đồ phân tích acid béo

2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC

Thẩm tích (dialysis) Ứng dụng chủ yếu của phương pháp thẩm tích là để loại muối và các phân tử

nhỏ, từ hỗn hợp dung dịch chứa phân tử sinh học lớn (protein) Thí dụ thẩm tích tách (NH4)2SO4 từdịch tủa với protein chẳng hạn Thẩm tích thực hiện trong túi bán thấm, ngâm trong dung dịch đệm cólực ion thấp (trong một số trường hợp ngâm trong nước cất) Các lỗ thành túi thẩm tích có kích thước rấtnhỏ, chỉ cho phép những phân tử có MW nhỏ khuếch tán qua, còn protein thì không Cân bằng sẽ đạtkhỏang 4-6 giờ Nếu cần lọai bỏ triệt để hơn nữa các phân tử nhỏ khỏi dịch chứa protein, người ta lặplại thao tác trên Thẩm tích nên thực hiện ở nhiệt độ thấp 3-40C, được khuấy nhẹ bằng khuấy từ Thực tếcho thấy nên để chừa một khoảng trống, khoảng 10% thể tích túi, để khi thẩm tích, túi thẩm tích nổi trênmặt nước, không bị hư do khuấy từ

Màng túi thẩm tích khá đa dạng Thường là vật liệu collodion, celophane và cellulose Trên cơ sởvật liệu cellulose, người ta chế tạo ra các lọai màng Spectropor cellulose khác nhau cho phép tách theokhối lượng (molecular cutoff) từ 1.000 Da đến

50.000 Da Thẩm tích được ứng dụng trước tiên cho mục đích lọai muối khỏi tủa với

Trang 34

protein Vì sự có mặt của muối sẽ cản trở quá trình tinh sạch protein tiếp theo (thí dụ bằng điện di haysắc ký) Phương pháp thẩm tích đơn giản trong thực hiện, và nhất là không tốn kém Thẩm tích cũngđược sử dụng để tách những phân tử nhỏ hay ion liên kết yếu với biopolymer Thí dụ tách các cofactorcủa enzyme-protein như NAD, FAD hay ion kim lọai

Túi thẩm tích mới sử dụng thường còn chứa glycerol, kim lọai nặng, gốc sulfur dạng vết, đôikhi có cả vết protease Do vậy trước tiên cắt tạo túi thẩm tích kích thước 10-20 cm và ngâm trongdung dịch 1% acetic acid 1 giờ Sau đó chuyển sang ngâm trong nước cất Để lọai vết kim lọai, đun sôitúi thẩm tích trong dung dịch 1% EDTA kiềm (1% Na-carbonate, 10-3 M EDTA) 1 giờ Ngâm và thay 5lần nước cất Bảo quản lạnh trong nước cất, bổ sung Na-azide và vài giọt chloroform để ức chế vi khuẩnphát triển

Hình 2.14: Hệ thống thẩm thấu

Trang 35

Biote c h

CE RC

Sta

n dardRC

100-500,

500-1000, 3.5-5K,8-10K, 20K, 50K,100K,

300K, 1000K

3.5k, 8k, 10k, 15k,25k

Opaque, Flexible, Hydrophilic

Good

2 - 1260°CNO

U

n ive r sal Only

NO

1k, 2k, 3.5k, 5k,6-8k, 10k, 12-14k,15k, 25k, 50k

Opaque, Rigid, Hydrophilic Clear Flexible, Hydrophilic

Standard Regenerated Cellulose (RC) broad range, low cost lab applications

Tuy phương pháp thẩm tích hãy còn được sử dụng để tinh sạch protein, nhưng hiện phổ biến

và tiện lợi hơn là phương pháp lọc gel và siêu lọc Vì nhược điểm chủ yếu của phương pháp thẩmtích là rất mất thời gian (có khi đến vài ngày), trong khi lọc gel và siêu lọc chỉ mất 1-2 giờ Siêu lọc

có thể sử dụng để lọc dung tích khá lớn đến 50 l

Vi lọc protein

Vi lọc là việc dùng màng xốp vi lỗ để tách các thành phần nhỏ của dịch lỏng Vi lọc có nhiều ứng

dụng: Có 2 phương pháp lọc thường được áp dụng: lọc sâu (depth filter) và thông dụng hơn là

lọc màng Lọc sâu là dạng màng sợi xốp cấu tạo từ sợi

Trang 36

thủy tinh hoặc cellulose, sắp xếp một cách ngẫu nhiên Màng có khả năng giữ tế bào và các mảnh vỡ của

nó không những trên bề mặt, mà cả ở sâu bên trong màng

Phương pháp lọc màng thường sử dụng các tấm lọc polymer như cellulose acetate, cellulose

nitrate, nylon, polytetrafluoroethylene (PTFE) xốp chứa các lỗ nhỏ li ti

khoảng 0,2 đến 10 m Màng có kích thước lỗ nằm trong khoảng 0,2-0,45 m có khả

năng giữ tế bào vi sinh vật trên bề mặt màng, và do vậy, lọc màng luôn phải kèm theo nén Phươngpháp lọc màng rẻ tiền và đơn giản trong thao tác Màng lọc thường ở dạng đĩa, hoặc cuốn nhiều lớpthành dạng hình trụ sắp xếp trong ống thép không rỉ Đa số các dạng lọc này hiện đều có thể khửtrùng trong nồi áp suất hoặc dùng hơi

nước Chúng họat động có hiệu quả ở nhiệt độ tới 70-75oC

Hình 2.15: Thiết bị lọc và phụ kiện

Nhược điểm lớn nhất là màng là dễ bị bít bởi sinh khối lọc làm tăng áp suất nén, giảm tốc độ dòng,đôi khi làm màng bị thủng Để khắc phục người ta thường sử dụng hệ thống màng lọc nhiều lớp vớikích thước lỗ giảm dần, cho phép tăng hiệu quả hoạt động của màng Trong quá trình sử dụng, người tathường xuyên dùng phương pháp thử bọt và thử áp suất để kiểm tra độ nguyên vẹn của màng

Trang 37

Hình 2.16: Hình chụp hiển vi điện tử màng siêu lọc Hạt lớn hơn 0,1 µm sẽ bị giữ lại trên mặt

hoặc trong lỗ bên trong màng

Làm trong dịch mẫu vì dịch chứa biopolymer có MW cao, hay dịch chiết tế bào thường bị đục.

Điều này sẽ cản trở quá trình phân tích, đặc biệt là phân tích quang phổ Do vậy cần phải làm trongdịch Làm trong dịch thể tích nhỏ thường thực hiện trong phễu lọc dưới áp suất hút nhỏ (thườngdùng bơm vòi nước) Trong một số trường hợp, người ta dùng biện pháp này để khử trùng dịch chứabiopolymer không khử trùng được, như nucleic acid hay protein Màng lọc khử trùng được sẽ ngăn vàgiữ vi khuẩn trên màng lọc Trong khi nucleic acid và protein đi qua màng lọc

Hình 2.17: Hệ thống lọc màng phòng thí nghiệm

Trang 38

Thu tủa để phân tích cũng sử dụng lọc màng giống như mô tả ở trên Chú ý để lọc tủa chứa chất

phóng xạ, người ta dùng màng cellulose nitrate và màng từ sợi thủy tinh Vì những vật liệu này có thểcho thẳng vào máy đếm nhấp nháy xác định phóng xạ

Thu tế bào vi khuẩn từ dịch lên men thường được thực hiện nhờ lọc màng và ly tâm Ly tâmtheo từng đợt không hiệu quả bằng lọc màng Để thu sinh khối tế bào từ mẻ lên men lớn, tốt hơn cả làdùng ly tâm liên tục

Hình 2.18: Sơ đồ cấu tạo máy ly tâm liên tục

Cô dịch chứa biopolymer Trong phòng thí nghiệm, người ta thường dùng thiết bị mô tả trong hình

để cô dịch chứa biopolymer phục vụ cho công tác phân tích Trong đó dịch biopolymer được khuấy vàtách dịch qua màng bên dưới cánh khuấy nhờ máy bơm hút tạo chân không thấp

2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN

Đông khô là quá trình hút chân không làm bay hơi nước từ trạng thái đóng băng để làm khô dịch

protein Các chế phẩm protein đông khô có thể bảo quản ngay cả ở nhiệt độ phòng trong thời gian rấtlâu, có khi tới cả hàng chục năm, mà không mất họat tính Trong đó có nhiều lọai protein dược dụng nhưvaccine, enzyme dược dụng, hormone, kháng thể Sở dĩ có thể bảo quản được lâu như vậy, là vìchế phẩm protein đông khô thường có độ ẩm rất thấp, chỉ khỏang 3% Trước hết phải làm lạnh sâu ốngđông khô (thông thường là ống hay lọ thủy tinh) đựng dịch protein đến

Trang 39

khỏang ½ thể tích ống Do quá trình làm lạnh sâu xẩy ra nhanh, nên các tinh thể chứa nước cũng xuất hiện khá nhanh Cùng với sự

hình thành các khối tinh thể, nồng độ protein

(cũng như các chất tan khác như muối, thành phần

đệm, các hóa chất bổ sung khác) còn ở lại

pha dịch cũng gia tăng

Đối với phần lớn protein nhiệt độ làm lạnh sâu thường

khỏang -40oC tới -60oC là phù hợp Sau khi đạt nhiệt

độ lạnh sâu phù hợp, chuyển ống vào máy đông khô (gồm

buồng lạnh và hệ thống bơm chân không 2 cấp) Lúc này

phải nâng nhiệt độ lên trên 0oC, để đẩy nhanh sự thăng hoa

của tinh thể nước Tiến hành cô dưới độ chân không

khỏang 5-25 mm Hg Kết quả nhận được sinh khối

bioplolymer

Hình 2.30: Máy đông khô do hãng Savant sản xuất

Sấy phun là kỹ thuật rất hay đựợc sử dụng trong sản xuất chế phẩm protein thô dạng bột Thường

các chế phẩm protein thương mại ở dạng lỏng và bột Hai quy trình công nghệ sản xuất các sảnphẩm này có giai đọan đầu giống nhau là giai đọan thu nhận dịch protein (kể cả dịch ngọai bào và nộibào) Dịch protein sau giai đọan ly tâm tách chiết dịch lên men đối với protein ngọai bào, hoặc táchchiết thu nhận sinh

Trang 40

khối tế bào, phá tế bào để thu nhận dịch protein nội bào, thì đều được cô chân không ở nhiệt độkhỏang 40oC để tránh làm protein bị biến tính Sau đó tiến hành lọc để lọai tế bào hoặc mảnh vỡ tếbào còn lại trong dịch.

Nếu sản phẩm protein thương mại sử dụng ở dạng dịch thô, thì người ta chỉ việc bổ sung thêm các

chất ổn định, thường là propylene glycol, glycerol và sorbitol, hoặc chất bảo vệ như là NH4-sulfate,

Na-sulfate hoặc NaCl Nếu sản phẩm protein thương mại ở dạng bột, thì sau khi bổ sung chất ổn định

và bảo vệ, người ta tiến hành tạo bột từ dịch protein bằng phương pháp sấy phun

Sấy phun là kỹ thuật trong đó người ta tạo các hạt aerosol từ dịch sinh phẩm (thí dụ dịch protein)

cô đặc và hướng các hạt này vào dòng khí nóng Dòng khí nóng sẽ làm bốc hơi nước trong mộtkhỏang thời gian rất nhỏ, không làm biến tính sinh chất (thí dụ là protein) Kết quả tạo ra các hạt bộtprotein Bột protein có thể gây dị ứng da đối với người sản xuất và người tiêu dùng Để khắc phụcngười ta bọc các hạt protein trong gel ở dạng con nhộng Bột protein, trong đó phần lớn là cáclọai enzyme, hiện được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy rửa, mỹphẩm

Hình 2.31: Sơ đồ nguyên tắc họat động của máy sấy phun

Định dạng
Số trang	174
Dung lượng	9,74 MB