Các phương pháp phân tích công nghệ sinh học hiện đại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CƠNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI Biên Soạn: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng www.hutech.edu.vn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ấn 2014 HƯỚNG DẪN MỤC LỤC III MỤC LỤC MỤC LỤC I HƯỚNG DẪN IV BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG … SINH HỌC 1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT TÓM TẮT CÂU HỎI ÔN TẬP BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC 2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC 15 2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ 16 2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ 17 2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE 18 2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID 19 2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC 24 2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN 29 2.9 TẠO TINH THỂ PROTEIN 32 2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER 34 TÓM TẮT 37 CÂU HỎI ÔN TẬP 38 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SỬ DỤNG TRONG SINH HỌC 39 3.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 39 3.2 SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG 42 3.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG SẮC KÝ CỘT 45 3.3.1 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion 46 3.3.2 Sắc ký lọc gel 51 3.3.3 Phương pháp sắc ký lực ( affinity chromagraphy) 54 3.3.4 Phương pháp sắc ký cột lỏng (high-performance liquid chromatography) 57 3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 57 3.5 SẮC KÝ KHÍ GC (GAS CHROMATOGRAPHY) 61 TÓM TẮT 63 CÂU HỎI ÔN TẬP 64 BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI 65 4.1 KHÁI NIỆM VỀ ĐIỆN DI 65 HƯỚNG DẪN MỤC LỤC III 4.2 ĐIỆN DI TRÊN GEL (POLYCRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS) 66 4.2.1 Giới thiệu phương pháp PAGE 66 4.2.2 Điện di không liên tục 69 4.2.3 Điện di SDS-PAGE 71 4.2.4 Điện di protein theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric Focusing of Protein) 72 4.2.5 Điện di hai chiều (Two-dimensional Electrophoresis) 73 4.2.6 Điện di mao dẫn CE (Capillary Electrophoresis) 75 4.2.7 Điện di miễn dịch IE (Immunoelectrophoresis) 75 4.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN 77 TÓM TẮT 80 CÂU HỎI ÔN TẬP 80 BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE 81 5.1 ĐỘNG HỌC ENZYME 81 5.2 THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME 83 5.2.1 Khái niệm chung 83 5.2.2 Xác định họat tính enzyme 85 5.3 ENZYME TYROSINASE 85 5.3.1 Nội dung thí nghiệm 86 5.3.2 Các bước tiến hành 86 5.3.3 Phân tích kết 89 5.3.4 Đơn vị họat tính enzyme 90 5.3.5 Đánh giá bước tinh chế enzyme 92 TÓM TẮT 93 CÂU HỎI ÔN TẬP 94 BÀI 6: BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ 95 6.1 NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ QUANG PHỔ 95 6.1.1 Khái niệm chung 95 6.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ SINH CHẤT 98 6.3 QUANG PHỔ HÙYNH QUANG 101 6.4 PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG DUNG DỊCH 105 TÓM TẮT 108 CÂU HỎI ÔN TẬP 108 BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID 109 7.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN THU NHẬN NUCLEIC ACID 109 7.1.1 Thu nhận DNA gồm bước 109 7.1.2 Thu nhận RNA tòan phần mRNA 111 7.2 THU NHẬN DNA TỪ VI KHUẨN 111 7.2.1 Sơ đồ tách chiết phân đọan DNA từ tế bào vi khuẩn 112 7.2.2 Thu nhận DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 113 HƯỚNG DẪN MỤC LỤC III 7.3 TINH SẠCH NUCLEIC ACID 114 7.3.1 Tinh nucleic acid siêu ly tâm 114 7.3.2 Tinh nucleic acid sắc ký 115 7.4 ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID 115 7.4.1 Định lượng nucleic acid quang phổ kế 116 7.4.2 Định lượng nucleic acid điện di 116 7.4.3 Tinh chế DNA từ gel điện di 117 TÓM TẮT 118 CÂU HỎI ÔN TẬP 118 BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 119 8.1 CÁC ENZYME DÙNG TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN 119 8.1.1 Các enzyme cắt giới hạn RE (restrictase) 119 8.1.2 Các enzyme thông dụng khác 120 8.2 ĐIỆN DI NUCLEIC ACID 122 8.3 LAI PHÂN TỬ 123 8.3.1 Cơ sở khoa học lai phân tử 123 8.3.2 Các kiểu lai phân tử 125 8.4 MẪU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU MẪU DÒ 130 8.4.1 Mẫu dò 130 8.4.2 Tác nhân đánh dấu 131 8.4.3 Phương pháp đánh dấu 131 8.5 TÁCH DÒNG DNA (CLONING DNA) 133 8.6 PHẢN ỨNG CHUỖI NHÂN SỢI DNA PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 139 8.6.1 Các bước thực PCR 139 8.6.2 Ứng dụng PCR 140 8.6.3 Hạn chế PCR 142 8.7 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA 142 8.8 MICROARRAY 146 TÓM TẮT 148 CÂU HỎI ÔN TẬP 148 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 149 9.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LỌAI KINH ĐIỂN 149 9.2 PHÂN LỌAI PHÂN TỬ 149 9.2.1 Các phương pháp dùng phân lọai phân tử 149 9.2.2 Các gen thường dùng phân lọai học phân tử 151 9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA prokaryote 153 9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium) 155 TÓM TẮT 163 CÂU HỎI ÔN TẬP 163 HƯỚNG DẪN MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 164 III HƯỚNG DẪN MỤC LỤC III HƯỚNG DẪN MƠ TẢ MƠN HỌC Giáo trình Phương pháp nghiên cứu Công nghệ sinh học cung cấp kiến thức cho sinh viên đào tạo theo định hướng Công nghệ sinh học nguyên lý, kỹ thuật thiết bị thường sử dụng lĩnh vực nghiên cứu Công nghệ sinh học đại Chủ yếu tập trung vào nhóm phương pháp thiết bị phân tích protein nucleic acid, hai đối tượng nghiên cứu Cơng nghệ sinh học đại Giáo trình gồm giảng NỘI DUNG MƠN HỌC Bài 1: Giới thiệu phòng thí nghiệm nghiên cứu CNSH thao tác chuẩn bị làm việc phòng thí nghiệm CNSH Bài 2: Giới thiệu tổng quan phương pháp nghiên cứu CNSH gồm phương pháp sử dụng lọai điện cực biosensor, phương pháp chuẩn bị đệm, phương pháp phân tích hóa sinh truyền thống, phương pháp thẩm tích lọc, ly tâm theo mẻ liên tục, sấy phun đông khô, tạo tinh thể phương pháp xác định MW biopolymer Bài 3: Giới thiệu nguyên lý phương pháp sắc ký, chủ yếu tập trung vào sắc ký trao đổi ion, lọc gel, sắc ký lực HPLC thu nhận tinh protein Các phương pháp trình bầy theo bước quy trình thu nhận tinh protein gồm modul Cuối phương pháp sắc ký thu nhận tinh protein tái tổ hợp, phát triển phương pháp sắc ký lực, từ sử dụng nguyên lý lực kháng nguyên/kháng thể đến lực enzyme/cơ chất cột GST lực thứ tự amino acid His với Ni cột Nikel Bài 4: Giới thiệu phương pháp điện di bao gồm nguyên lý phương pháp điện di, kiểu điện di phân tách, tinh thu nhận protein nucleic acid Bài 5: Giới thiệu enzyme tyrosinase Phân tích bước nghiên cứu động học tyrosinase Đây thực hành lớn nhằm giúp sinh viên biết cách tiếp cận phương pháp phân tích động học phản ứng xúc tác enzyme HƯỚNG DẪN HƯỚNG DẪN V Bài 6: Giới thiệu phương pháp phân tích quang phổ bao gồm nguyên lý, cấu tạo lọai thiết bị đo quang hấp phụ (OD) thường sử dụng máy so mầu, quang phổ khả kiến UV, quang phổ hùynh quang Giới thiệu sơ lược công hưởng từ hạt nhân, phương pháp ghi phổ nhiễu xạ tia X khối phổ MS Sử dụng phương pháp phân tích quang phổ để định lượng protein Bài 7: Tách chiết định lượng nucleic acid giới thiệu phương pháp thu nhận DNA RNA tòan phần từ tế bào vi khuẩn, thực vật đông vật Thu nhận plasmid từ tế bào vi khuẩn Tinh nucleic acid ly tâm, sắc ký, định tính định lượng nucleic acid quang phổ, điện di Tinh chế nucleic acid điện di Bài 8: Giới thiệu kỹ thuật sử dụng sinh học phân tử bao gồm nhóm enzyme sử dụng nghiên cứu sinh học phân tử, điện di nucleic acid, phương pháp lai phân tử, Các lọai mẫu dò phương pháp chế tạo, tách dòng DNA, phương pháp PCR mục đích sử dụng, xác định thứ tự nucleotide microarray Bài 9: Phân lọai học phân tử giới thiệu sở khoa học phương pháp phân lọai truyền thống phương pháp phân lọai phân tử Giới thiệu chất phương pháp phân lọai phân tử, gen thường sử dụng cho phân lọai tế bào prokaryote eukaryote Giới thiệu bước thực phân lọai phân tử vi khuẩn hoa lan KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ Môn học Phương pháp nghiên cứu Cơng nghệ sinh học mơ đòi hỏi sinh viên có tảng Hóa sinh, Sinh học phân tử Cơng nghệ sinh học U CẦU MƠN HỌC Người học phải dự học đầy đủ buổi lên lớp làm tập đầy đủ nhà HƯỚNG DẪN HƯỚNG DẪN V CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MƠN HỌC Để học tốt mơn này, người học cần ôn tập học, trả lời câu hỏi làm đầy đủ tập; đọc trước tìm thêm thơng tin liên quan đến học Đối với học, người học đọc trước mục tiêu tóm tắt học, sau đọc nội dung học Kết thúc ý học, người đọc trả lời câu hỏi ôn tập kết thúc toàn học, người đọc làm tập PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MƠN HỌC Mơn học đánh giá gồm: Điểm trình: 30% Hình thức nội dung GV định, phù hợp với quy chế đào tạo tình hình thực tế nơi tổ chức học tập Điểm thi: 70% Hình thức thi tự luận 60 phút Nội dung thuộc thứ đến thứ 1: QUY ĐỊNHVÀ ANTHAO TỒNTÁC VÀ THAO TÁC TRONG THÍ NGHIỆM CƠNG BÀI 1: QUYBÀI ĐỊNH AN TỒN TRONG PHỊNG THÍPHỊNG NGHIỆM CƠNG NGHỆ SINHNGHỆ HỌC SINH HỌC BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TỒN VÀ THAO TÁC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ SINH HỌC u cầu: - Nắm nội dung Quy định an tòan phòng thí nghiệm CNSH - Nắm yêu cầu cách thức chuẩn bị bảo quản dung dịch hóa chất thí nghiệm - Hiểu cách thức chuẩn bị nước cất nước siêu tinh khiết sử dụng phòng thí nghiệm 1.1 QUY ĐỊNH AN TỊAN LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Trước bắt đầu làm việc phòng thí nghiệm, việc phải nắm vững quy định an tồn phòng thí nghiệm, làm quen với dẫn độ độc hại hóa chất sử dụng, yếu tố gây nguy hiểm Các biện pháp thiết bị bảo vệ Trong việc tn thủ quy định làm việc phòng thí nghiệm có ý nghĩa quan trọng Phải ln đeo kính phòng hộ làm thí nghiệm Khơng làm việc phòng thí nghiệm Phải nắm vững tính chất hóa học tính chất vật lý tất hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm Tn thủ bảng hướng dẫn sử dụng hóa chất Luôn phải đeo găng tay làm việc với hóa chất hay yếu tố lây nhiễm 150 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 150 Điện di isozyme cho biết khác biệt trọng lượng, kích thước điện tích enzyme có chức năng, mã hóa gen locus, locus khác nhau; So sánh mẫu protein nhờ kháng thể, thí dụ dùng huyết để xác định nhóm máu A, B, O, Rhezus, M, MN, N ; Phân tích tính đa dạng độ dài đọan cắt giới hạn RFLP (restriction fragment length polymorphism) dựa vào enzyme cắt đặc hiệu DNA gene, tạo hàng lọat phân đọan dài ngắn khác mang biểu tượng đặc trưng lòai Một số kỹ thuật dựa PCR phân tích DNA vệ tinh trình tự lặp lại đơn giản (microsatellite, simple sequence repeat) cho phép phát tính đa hình độ dài trình tự nucleotide đơn giản, khác số lượng nucleotide đơn vị lặp lại số đơn vị lặp lại phát nhờ PCR điện di; Đa hình DNA nhân ngẫu nhiên RAPD (randomly amplified polymorphism DNA) nhờ mồi dài 10 nucleotide với hàm lượng G + C lớn 60% tạo đọan kích thước > 100bp < 2kb Sự khác đọan đột biến vị trí gắn mồi cản trở việc bắt cặp Kết phát có mặt hay vắng mặt đọan; Sự khác biệt độ dài nhân lên thể khác lòai hay thuộc lòai khác xem yếu tố trội Đa hình chiều dài đọan nhân chọn lọc AFLP (amplified fragment length polymorphism) giống RAPD, khác mồi đọan dài (khỏang 15bp) chứa vị trí nhận biết enzyme giới hạn phần thay đổi nhỏ (2-4bp) Phần cố định dài tạo ổn định sản phẩm nhân lên, phần thay đổi ngắn tạo nhiều locus AFLP phát khác đọan DNA nhân lên có chọn lọc trình tự DNA hệ gen cắt enzyme giới hạn Sự đa hình xác định có mặt khơng có mặt băng điện di có liên quan Phương pháp AFLP chủ yếu dùng để thiết lập đồ di truyền tính trạng số lượng Lai phân tử DNA để xác định mức độ tương đồng trình tự nucleotide DNA thuộc lòai khác Ta đo mức độ bắt cặp sợi DNA thuộc hai lòai khác cách xác định nhiệt độ mà phân tử DNA lai bị biến tính Sự tương đồng trình tự nucleotide lòai cao, phân tử lai mau chóng hình thành nhiệt độ cần thiết để phân tử DNA lai bị biến tính cao 151 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 151 Phân tích trình tự DNA nhờ tạo số lượng lớn đọan xếp đơn vị nucleotide, đánh dấu hùynh quang tách điện di Với trợ giúp phần mềm xử lý kết nhận ta nhận kết phân lọai Trong bảng 9.1 trình bầy tổng quan phương pháp phân lọai Bảng 9.1 Các phương phương pháp phân lọai sinh học phân tử Vấn đề Isozyme Lai DNA Phân tích vị trí cắt RE Phân tích đọan DNA Phân tích trình tự Tiến hóa gen M - M -,M,- + Phân lọai phụ quần thể + - + M,+,- + Biến đổi địa lý + - + M,+,M + Ranh giới lòai + - +,M,- Phát sinh triệu năm) + M + -,M,- + Phát sinh (5-50 triệu năm) + + + -,-,- + Phát sinh (50-500 triệu năm) M M M -,-,- + Phát sinh (5003.500 triệu năm) - - - -,-,- + (0-5 + Chú thích: - phương pháp khơng phù hợp; + phương pháp phù hợp; M phương pháp phù hợp phần 9.2.2 Các gen thường dùng phân lọai học phân tử Ribosome máy sinh tổng protein Cấu trúc ribosome bảo tồn gần không thay đổi suốt q trình tiến hóa Trong hệ tế bào, có khỏang 10 tỷ ribosome tạo Ribosome tế bào nhân chuẩn có số lắng 80S gồm tiểu phần lớn nhỏ, với số lắng tương ứng 60S 40S, lớn phức tạp ribosome tế bào nhân sơ có hệ số lắng 70S, tương ứng với tiểu phần 50S 30S Trong mơi trường có nồng độ cation Mg+2, Ca+2, Co+2, Mn+2 thấp, tiểu phần tách ra, ngược lại Các tiểu phần tạo thành liên kết hydro ion Mg+2 rRNA với nhiều phân tử protein 152 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 152 Các phân tử rRNA tạo từ tiền phân tử RNA (pre-rRNA) Ở sinh vật nhân chuẩn, phân tử tiền rRNA 45S trải qua trình biến đổi để tạo rRNA nhỏ Phân tử rRNA 45S methyl hóa 100 nucleotide tổng số 14.000 nucleotide phân tử Hầu hết nhóm 2’OH đường ribose Các vị trí giữ nguyên trạng thái methyl hóa sản phẩm cuối cùng, phân tử rRNA 28S, 18S, 5,8S Riêng rRNA 5S tổng hợp riêng, xúc tác RNA polymerase III, thay RNA polymerase I Phản ứng cắt rRNA 45S cần tham gia số phân tử snRNA (small nuclear RNAs) nằm phức spliceosome Bảng 9.2 Thành phần cấu tạo ribosome Sinh vật Ribosome Thành phần 50S Prokaryote 70S (2,7.103 kDa) (1,8.103 kDa) rRNA 5S (120 nucleotide rRNA 23 S (3200 nuc.) 36 phân tử protein Eukaryote 80S (4,2.103 kDa) 30S rRNA 16S (1540 nucleotide (0,9.103 kDa) 21 phân tử protein 60S rRNA 5S (120 nucleotide,rRNA (2,8.103 kDa) 28 S (4700 nuc.) rRNA 5,8S (160 nuc.) 49phân tử protein 40S rRNA 18S (1900 nucleotide) (1,4.103 kDa) 33 phân tử protein Gen 16S rRNA sử dụng nghiên cứu phả hệ prokaryote vừa có vùng bảo thủ vùng siêu biến động Có thuận lợi gen rRNA ty thể lục lạp thể gần giống Vùng ổn định thường nằm cạnh vùng siêu biến động Các mồi sử dụng thiết kế gắn vào vùng ổn định để khuếch đại thứ tự vùng biến động 5S rRNA 23S prokaryote chứa tương ứng 120 2900 nucleotide nằm tiểu đơn vị lớn ribosome Còn 16S rRNA chứa 1500 nucleotide, nằm tiểu đơn vị nhỏ ribosome 153 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 153 Hình 9.1: Cấu trúc 16S rRNA với mũi tên vùng siêu biến động bảo thủ Cơ sở khoa học việc phân lọai prokaryote theo gen 16S rRNA, ribosome có mặt tất tế bào sống Gen 16S rRNA có tính bảo thủ cao không cần phải nuôi cấy vi sinh vật cần định danh, nên tốn thời gian Vùng siêu biến động gen 16S rRNA cho phép định danh lòai vi sinh vật Phương pháp định danh nhờ ni cấy vi sinh vật, chẩn đóan hóa sinh phương pháp có liên quan khác thường khỏang 8-20 9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA prokaryote Để giám định 16S rDNA vi khuẩn người ta dựa vào số mồi (primer), chọn từ ngân hàng liệu gen 16S rRNA, thứ tự theo 5’ tới 3’ 154 fDl BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 154 Đa số eubacteria fD2 ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCATGGCTCAG Nhóm enterics fD3 ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTTAG Nhóm Borrelia spirochetes fD4 ccgaattcgtcgacaacAGAATTTGATCTTGGTTCAG Nhóm Chlamydiae rDl cccgggatccaagcttAAGGAGGTGATCCAGCC Nhiều lọai eubacteria rPl cccgggatccaagcttACGGTTACCTTGTTACGACTT Nhóm enterics eubacteria rP2 cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT Đa số eubacteria rP3 cccgggatccaagcttACGGATACCTTGTTACGACTT Nhóm fusobacteria eubacteria Chú thích: f - mồi xi; r - mồi ngược; D – vùng ngọai biên, P - vùng theo chiều 5’ tới 3’ Thứ tự nối chứa vị trí cắt cho RE biểu thị chữ nhỏ Trong thứ tự nối nhóm “f” chứa vị trí cắt EcoRI Sall Còn thứ tự nhóm “r” chứa vi trí cắt HindIJI, BamHI Xmal Mồi rPI, rP2 rP3 khác thứ tự thứ 17 từ đầu 3’ Mồi rP2 chứa thứ tự tương ứng với nhiều vi khuẩn Cách thức thực xác định thứ tự gen 16S rRNA mô tả sơ đồ Hình 9.2: Sơ đồ xác định thứ tự gen 16S rRNA 155 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 155 Trước tiên phải thu nhận tinh DNA từ vi khuẩn Sau khuếch đại gen 16S rRNA, sử dụng mồi khuếch đại vùng siêu biến động gen Điện di sản phẩm PCR gel biến tính DGGE Trong gel PA chứa chất gây biến tính DNA, thường urea hay formamide DGGE cho phép xác định sai biệt thứ tự đến gốc nucleotide Trong hình điện di A,B C vi khuẩn biết Làn vi khuẩn cần xác định Mẫu chứa vi khuẩn A C Làn chứa A,B đối tượng chưa biết (mũi tên) Cắt vệt điện di mang xác định thư tự so sánh với ngân hàng liệu gen 16S rRNA 9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium) Gen mã hóa rRNA 18S Gen mã hóa rRNA 45 S cụm gen gồm đơn vị gen nhỏ (từ 16S tới 18S), đơn vị gen lớn (từ 26S tới 28S) gen 5,8S Giữa đơn vị gen có đọan chép nội ITS-1 ITS-2 (internal transcribed spacer) Ở đầu 5’ phiên mã rRNA có đọan chép ngọai biên ETS (external transcribed spacer) Sáu thành phần tạo nên nhóm gen Các nhóm gen lặp lại liên tục hàng nghìn hệ gen Chúng ngăn cách vùng không phiên mã NTS (nontranscribed spacer) Hình 9.3: Sơ đồ nhóm gen mã hóa rRNA sinh vật nhân chuẩn Nói chung, đọan thứ tự gen bảo thủ đọan ITS-1 ITS-2 Các đọan lại bảo thủ đọan EST Thậm chí gen bảo thủ, có vùng có mức độ bảo thủ cao thấp khác khau Do gen coi tập hợp vùng có tốc độ tiến hóa khác Trong phân lọai học, gen mã hóa rRNA 18S 16S hay sử dụng để đánh giá quan hệ tiến hóa sinh vật, mức độ bảo thủ cao Ngòai đọan ITS-1 ITS-2 sử dụng cho mục đích Gen 5,8 rRNA ngắn, mồi thiết kế cho gen lại sử dụng để nhân vùng ITS kề bên 156 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 156 Đặc điểm cấu tạo DNA ty thể Ty thể bào quan có mặt tất tế bào hơ hấp hiếu khí Nó có DNA riêng, có tính di truyền độc lập với hệ di truyền nhân bào Trong ty thể có ribosome lọai rRNA cần thiết, để tổng hợp số protein đặc trưng ty thể DNA ty thể sợi xoắn kép, cấu trúc vòng, dài khỏang µm, chiếm khỏang 1-5% DNA tế bào DNA ty thể tự tái Khác với DNA nhân, DNA ty thể không gắn histone Về tổng thể, DNA ty thể tương tự DNA vi khuẩn nhân tố định tính di truyền tế bào chất DNA ty thể mã hóa tạo nhiều thành phần ty thể Phần lớn protein ty thể gen nhân quy định Còn DNA ty thể mã hóa cho 22-23 lọai tRNA 10-12 lọai protein có màng ty thể Mã di truyền ty thể có tính linh họat Nhiều tRNA đọc cụm mã khung Chính vậy, cần 22 lọai tRNA ty thể đủ nhận biết 61 ba mã hóa Trong nhân cần tới 32 lọai tRNA Ở phần lớn động vật có xương sống, DNA ty thể dài khỏang 16,8 kb Trên DNA ty thể, ngòai gen cấu trúc, có vùng điều khiển gọi vùng D-loop mang promoter cho trình chép phiên mã RNA ty thể DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp lần, so với gen nhân DNA ty thể phân tử đơn bội, không tái tổ hợp Như vậy, kiểu đơn bội khác DNA ty thể, sử dụng làm dấu hiệu thị để phát khác biệt di truyền theo dòng mẹ, quần thể nuôi nhốt sống hoang dại Vùng điều khiển vùng tiến hóa nhanh DNA ty thể Trung bình tích lũy dạng đột biến với tỷ lệ cao gấp 5-10 lần, so với gen khác ty thể Vì việc xác định trình tự nucleotide vùng điều khiển DNA ty thể công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền phân nhánh tiến hóa bên trong, quần thể lòai Giám định gen mã hóa rRNA 18S từ lan hài (Paphiopedilum) Lan hài chi lan nuôi trồng sớm phổ biến Việt Nam Do nguồn tài nguyên q cần phải phân lọai, phục vụ cho cơng tác bảo tồn nguồn gen, triển khai ứng dụng thực tiễn 157 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 157 Hình 9.4: Lan hài Paph helenae (trái) Paph delenatii (phải) Để xác định quan hệ chủng lọai họ Lan, người ta so sánh khác biệt trình tự nucleotide số gen, gen rRNA 18S Trong thí dụ tác giả sử dụng mẫu lan hài Paph helenae Paph delenatii Cụ thể gồm bước Tách chiết DNA tổng số từ thực vật: Phá vỡ thành tế bào thực vật phương pháp học, kết hợp sử dụng chất tẩy rửa mạnh DNA giải phóng làm nhờ proteinase K, dung dịch CHCl3/Isoamyl alcol (24/1) Tủa DNA cồn tuyệt đối -20oC, thu tủa ly tâm Các bước cụ thể thực sau: Bước 1: Nghiền g cối chày sứ vô trùng, giữ -70oC nitơ lỏng thành bột mịn Bước 2: Hòa tan mẫu ml dung dịch đệm chiết chứa 1M NaCl, 1M Tris-HCl pH 8,0, 10 ml mM EDTA pH 8,0, SDS 10% Bước 3: Thêm 10 µl proteinase K (10 mg/ml), ủ mẫu 56oC Bước 4: Thêm ml NaCl 6M, để 45 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14.000 v/phút 4oC, thu dịch phía trên, chuyển sang ống Bước 5: Lọai protein tạp chất CHCl3/Isoamyl alcol (24/1) Ly tâm 14.000 v/phút 20 phút 4oC, thu dịch phase phía Bước 6: Tủa DNA cồn 100% 20oC Bước 7: Ly tâm 14.000 v/phút 15 phút 4oC Thu tủa lọai bỏ dịch 158 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 158 Bước 8: Rửa tủa cồn 70% Ly tâm 14.000 v/phút 15 phút 4oC, thu tủa Bước 9: Làm khô mẫu hòa tan DNA nước khử ion vơ trùng Bước 10: Lọai RNA cách bổ sung RNA ase vào mẫu DNA thu đạt nồng độ cuối 100 µg/ml, ủ mẫu 37oC Các bước lặp lại bước 5, 6, 7, 8, Kết tách DNA từ lòai lan Paph helenae Paph Delenatii Mẫu DNA từ lòai lan Paph helenae Paph delenatii tách theo quy trình trên, kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Trên điện di đồ giếng xuất băng DNA đậm nét Kết cho thấy DNA tổng số không bị phân hủy, RNA bị hủy hòan tòan Như mẫu DNA đảm bảo yêu cầu chất lượng cho thí nghiệm Nhân đọan gen mã hóa rRNA 18S Nhân gen mã hóa Hình 9.5: Phổ điện di DNA tổng số Paph helenae (1) Paph delenatii (2) 18S rRNA phản ứng PCR với cặp mồi xuôi là: 5’-GCG ATC CGA ACA CTT CAC CGG-3’ mồi ngược là: 5’-GCT TGT TCT CAA GAT TAA GCC-3’ Cặp mồi thiết kế dựa số trình tự đầu đọan thứ tự bảo thủ cao gen rRNA 18S, số lòai thực vật bậc cao cơng bố Dự đóan vùng bảo thủ có mặt trình tự gen rRNA 18S lòai thuộc chi Lan hài Theo lý thuyết sử dụng cặp mồi nhân đọan gen rRNA 18S kích thước khỏang 1,7 kb Phản ứng PCR thực theo chu kỳ bước Bước 1: biến tính DNA khn 95oC phút Bước gồm 30 chu kỳ nhiệt 95oC-30 giây, 50oC – phút, 72oC – 1phút 20 giây Bước kết thúc tổng hợp 72oC phút bảo quản 4oC Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8% Kết cho thấy lòai lan thu sản phẩm PCR đặc hiệu với kích thước 1,7 kb tương ứng kích thước tính tóan theo lý thuyết Hình 9.6 Phổ điện di sản phẩm PCR thang DNA chuẩn (1), Paph helenae (2) Paph delenatii (3) Phân tích đọan gen rRNA nhận enzyme giới hạn Dùng số enzyme giới hạn để phát vị trí cắt khác vùng gen rRNA 18S lòai lan Mặc dù sản phẩm PCR gen rRNA 18S chúng có kích thước giống nhau, có số thứ tự nucleotide khác Thứ tự tạo khác biệt rơi vào vị trí cắt enzyme giới hạn đó, số enzyme thử nghiệm Ngòai ra, phân đọan tạo dùng làm nguyên liệu để tạo dòng phụ (subclone) Là bước cần thiết để xác định tòan trình tự đọan gen rRNA 18S Phân tích trình tự đọan gen rRNA 18S phần mềm PC GENE, có tham khảo thêm kết giám định gen rRNA 18S số tác giả khác, nhận kết liên quan đến vị trí cắt trình tự gen rRNA 18S lan hài Paph helenae Paph micranthum Bảng 9.3: Vị trí nhận biết số RE trình tự 18S rRNA lan hài Paph helenae Enzyme AccI Vị trí cắt 192 Paph micranthum Số điểm cắt 142 276, 882, 1506, 1557 Số điểm cắt ApaLI ApolI Vị trí cắt 275, 881, 1505, 1556 BamHI 515 515 BsaAI 142 141 BspHI 225 EcoRI HaeII 1557 719, 1446 1566 718 HindII 1296, 1590 HindIII 1352 1352 HpaI 1279 1296 NaeI 1049 1048 NcoI 319 318 PvuI 629 628 SacI 1224 1223 SacII 551 550 XbaI 129 128 XhoI 515 514 Chọn enzyme Hind III Bam HI để phân tích đọan gen rRNA 18S Theo kết bảng, Hind III có điểm cắt gen rRNA 18S vị trí nucleotide thứ 1352 Paph helenae Paph micranthum Như enzyme cắt đọan gen rRNA 18S thành đọan có kích thước xấp xỉ 298 bp 1331 bp Đồng thời enzyme Bam HI có điểm cắt vị trí thứ 515 gen rRNA 18S lòai lan Kết phản ứng cắt enzyme thể điện di đồ Hình 9.7: Phổ điện di sản phẩm PCR xử lý enzyme giới hạn Giếng 1: Marker (thang DNA chuẩn) Giếng 2: Sản phẩm PCR lòai Paph helenae Giếng 3: Sản phẩm PCR lòai Paph helenae cắt Bam HI Giếng 4: Sản phẩm PCR lòai Paph helenae cắt Hind III Giếng 5: Sản phẩm PCR lòai Paph delenatii Giếng 6: Sản phẩm PCR lòai Paph delenatii cắt Bam HI Giếng 7: Sản phẩm PCR lòai Paph delenatii cắt Hind III Trên hình phổ điện di cắt gen rRNA 18 S enzyme giới hạn, thấy có khác biệt lòai Paph helenae Paph delenatii Bam HI cắt gen rRNA 18 S thành phân đọan 0,5 kb 1,2 kb Hind III cắt thành 0,3 kb 1,4 kb Điều có nghĩa Hind III Bam HI có điểm cắt gen rRNA 18S lòai Tuy nhiên dựa vào kết phân tích enzyme giới hạn, chưa thể khẳng định khác biệt lòai Paph helenae Paph delenatii Để có kết luận xác, cần phải tiếp tục tách dòng gen rRNA 18S Paph delenatii, tiến hành đọc trình tự đọan gen so sánh với gen rRNA 18S Paph helenae Sản phẩm tách dòng DNA plasmid làm khơ hòa tan nước khử ion vô trùng Cho chạy điện di Quan sát phổ điện di thấy mẫu DNA số nằm vị trí cao (do kích thước lớn hơn), so với DNA plasmid đối chứng Như vậy, plasmid có chứa đọan DNA ngọai lai gắn vào Để khẳng định gen rRNA 18S gắn vào plasmid, tiến hành kiểm tra sản phẩm plasmid cắt enzyme giới hạn Hình 9.8 Phổ điện di sản phẩm tách DNA plasmid Giếng 1: Vector pBluescript dùng làm chuẩn Giếng 2-12: Các dòng khuẩn lạc đem tách Trên vector Bluescript KS (-) có điểm cắt enzyme Bam HI Hind III vùng gắn đa vị trí Ngòai theo kết phân tích trên, gen rRNA 18S có vị trí cắt Bam HI thứ tự 515 Hind III 1352 Do theo lý thuyết, plasmid mang đọan gen rRNA 18S, cắt Bam HI cho băng kích thước khỏang 1,3 kb Cắt Hind III - cho băng khỏang 1,4 kb Còn cắt cho băng kích thước khỏang 0,3 kb, 0,5 kb 0,9 kb Kết cắt enzyme nhận phổ điện di sau Hình 9.10: Phổ điện di sản phẩm DNA plasmid xử lý enzyme giới hạn Giếng 1: Marker (thang DNA chuẩn) Giếng 2: DNA xử lý Bam HI Giếng 3: DNA xử lý Hind III Giếng 4: DNA xử lý Bam HI Hind III Trên điện di đồ thấy DNA plasmid sau cắt Bam HI cho băng kích thước khỏang 1,2 kb Cắt Hind III cho băng khỏang 1,4 kb Khi cắt cho băng: 0,3kb, 0,5 kb 0,9 kb Kết hòan tòan khớp với tính tóan theo lý thuyết, chứng tỏ dòng plasmid chọn có chứa đọan gen rRNA 18S Các tế bào nhân lên, tách DNA plasmid lượng lớn để đọc trình tự đọan gen rRNA 18S TĨM TẮT Trong này, sinh viên làm quen nắm chất phương pháp phân lọai học phân tử Sự khác biệt phương pháp phân lọai học phân tử so với phương pháp phân lọai học truyền thống Các phương pháp thường sử dụng phân lọai học phân tử Nắm lý thường sử dụng phân lọai học phân tử gen 16S 18S ribosome RNA Nắm sơ đồ giám định gen prokaryote theo 16S ribosome RNA gồm bước thu nhận tinh DNA, tiến hành PCR thứ tự gen 16S RNA Xác định thứ tự nucleotide sản phẩm PCR so sánh với database để có kết luận định danh phân lọai Nắm sơ đồ giám định gen eukaryote theo 18S ribosome RNA (từ lan hài Paphiopedium) gồm bước thu nhận tinh DNA, tiến hành PCR thứ tự gen 18S RNA Xác định thứ tự nucleotide sản phẩm PCR so sánh đặc điểm vị trí cắt enzyme cắt giới hạn Cuối so sánh với database để có kết luận định danh phân lọai CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: So sánh phương pháp phân lọai học truyền thống phương pháp phân lọai học phân tử? Câu 2: Trình bầy sở khoa học phương pháp phân lọai học phân tử phân lọai thể prokaryote eukaryote? Câu 3: Trình bầy phương pháp phân lọai học phân tử? Câu 4: Nêu lý sử dụng gen 16S, 18S ribosome RNA gen ty thể phân lọai học phân tử? Câu 5: Nêu sơ đồ bước thực phân lọai học phân tử? 164 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Hun, “Giáo trình sinh hóa đại”, NXB Giáo dục, 1998 Hồ Hùynh Thùy Dương, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục, 1998 R Boyer, Modern Experimental Biochemistry, 2000 4.Lê Trần Bình cộng sự, Ap dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, 2003 Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình “Hóa sinh đai cương”, 2011 Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình “Phương pháp phân tích CNSH”, 2011 ... thực phân lọai phân tử vi khuẩn hoa lan KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ Môn học Phương pháp nghiên cứu Cơng nghệ sinh học mơ đòi hỏi sinh viên có tảng Hóa sinh, Sinh học phân tử Cơng nghệ sinh học U CẦU MƠN HỌC... Bài 9: Phân lọai học phân tử giới thiệu sở khoa học phương pháp phân lọai truyền thống phương pháp phân lọai phân tử Giới thiệu chất phương pháp phân lọai phân tử, gen thường sử dụng cho phân lọai... 19 2: CÁC KỸ THUẬT BẢN TRONG NGHIÊN BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢNBÀI TRONG NGHIÊN CỨU CƠ CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 19 phương pháp đo độ quay quang phân cực kế phương pháp hóa học Trong