công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phương pháp lai phân tử  Phương pháp PCR, ứng dụng  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 9/3/2011 2 BM CNSH TV – Khoa CNSH  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity)  Các dạng phức hợp lai bổ sung: – DNA - DNA – DNA - RNA – Protein – Protein (thƣờng ở dạng phức hợp kháng nguyên – kháng thể) CƠ SỞ KHOA HỌC Lai giữa các nucleic acid 9/3/2011 3 Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA hoặc DNA- RNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T (hoặc U) hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) Lai giữa các nucleic acid T A C G U A 9/3/2011 4 LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 9/3/2011 5 • LAI SOUTHERN (DNA – DNA) • LAI NORTHERN (DNA – RNA) • LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN) MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ 9/3/2011 6 So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai Southern, Northern và Western 9/3/2011 7 • Lịch sử – Do Edwin Southern đề xuất năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện. – Với sự phát triển của kỹ thuật này, Southern đã nhận được giải thưởng Lancaster trong lĩnh vực Y học vào năm 2005. LAI SOUTHERN Edwin Southern 9/3/2011 8 LAI SOUTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn (DNA-DNA) – Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó. • Kỹ thuật lai Southern cho biết – Sự có mặt của đoạn ADN (gen) – Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen) – Độ lớn của đoạn AND – Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò 9/3/2011 9 Các bƣớc tiến hành Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu. Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai (giai đoạn này gồm nhiều bước) Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 9/3/2011 10 [...]... số phương pháp phát hiện khác • • • • Phát hiện nhờ tạo màu Phát hiện nhờ quang hóa học Phát hiện nhờ phóng xạ Phát hiện nhờ phát huznh quang 9/3/2011 31 Ủ với kháng thể và phát hiện Cơ chất VD: Hydrogen peroxide + luminol HRP Kháng thể 2 3-aminophtalate (nhạy với ánh sáng) Kháng thể 1 Kháng nguyên nằm trên màng Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học 9/3/2011 32 Tóm tắt quy trình thực hiện Western blot... Stanford Kỹ thuật này đã được W Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot 9/3/2011 21 LAI WESTERN • Nguyên lý – Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể • Phƣơng pháp này cho biết – Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của protein... màng, màng sẽ chứa các protein ở vị trí giống như vị trí của chúng ở trên gel Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụng BSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trên màng  tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng 9/3/2011 28 Ủ với kháng thể và phát hiện 1 Chuẩn bị mẫu protein 2 Chạy điện di SDS-PAGE 3 Chuyển protein lên màng 4 Cố định màng 5 Ủ với kháng thể và phát hiện 9/3/2011 29... lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA – Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot • Phƣơng pháp này cho biết – – – – 9/3/2011 Sự có mặt của mRNA trong mô Mức độ thể hiện của gen Độ lớn của mRNA Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò 19 Vật nặng Mẫu RNA Giấy thấm Màng lai Khoảng trống... từ mẫu dò được ghi lên phim Các đoạn bổ sung với mẫu dò xuất hiện như các vạch 14 băng Bước 4: Thu kết quả Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi 9/3/2011 15 9/3/2011 16 • MOVIE_Southern Blot 9/3/2011 17 LAI NORTHERN • Lịch sử − Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine và George Stark tại Stanford University − Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA 9/3/2011... phát hiện vị trí lai giữa kháng nguyên – kháng thể Màng lai được xử lý với kháng thể 1, kháng thể này bám đặc hiệu vào kháng nguyên (protein) mục tiêu Chạy điện di SDS-PAGE phân tách các phân tử protein theo kích thước Chuyển protein lên màng lai Màng lai mang các phân tử protein có vị trí giống như trên bản gel Xử lý BSA hoặc sữa bột để “khóa” chỗ trống trên màng lai 33 So sánh 3 phương pháp lai Kỹ thuật. .. lai Các bƣớc tiến hành Bước1: chuẩn bị RNA mẫu Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai - Chạy điện di - Chuyển RNA lên màng lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai 9/3/2011 (E) Ghi nhận kết quả bằng phóng xạ tự ghi Vị trí không lai Vị trí xảy ra lai RNA-DNA 20 LAI WESTERN • Lịch sử − Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford Kỹ. .. có mang các DNA mạch đơn 9/3/2011 Phần màng lai không mang DNA được phủ bằng chất “khóa” màng lai Mẫu dò được phủ trên toàn bộ màng lai nhưng chỉ liên kết với các DNA bổ sung Mẫu dò chỉ còn có mặt ở trạng thái liên kết bổ sung với13 DNA Bước 4: Thu kết quả Màng mang phân tử lai giữa mẫu dò và DNA 9/3/2011 Phim X-quang được đặt trên màng lai cho đến khi sự phát xạ từ mẫu dò được ghi lên phim Các đoạn... kháng thể và phát hiện Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC Kháng thể 1 gắn với kháng nguyên đặc hiệu Các kháng thể không liên kết với kháng nguyên thì được rửa đi Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng Màng được ủ với kháng thể thứ 2, kháng thể này nhận biết và chỉ bám vào kháng thể 1 Kháng thể này liên kết với một phân tử cho phép chúng ta phát hiện được vị trí... mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của protein 9/3/2011 22 Các bƣớc tiến hành 1 Chuẩn bị mẫu protein 2 Chạy điện di SDS-PAGE 3 Chuyển protein lên màng 4 Cố định màng 5 Ủ với kháng thể và phát hiện 9/3/2011 23 Chuẩn bị mẫu 1 Chuẩn bị mẫu protein 2 Chạy điện di SDS-PAGE 3 Chuyển protein lên màng 4 Cố định màng 5 Ủ với kháng thể và phát hiện 9/3/2011 24 Chuẩn bị mẫu Tách chiết protein Hòa tan và biến . CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng. pháp lai phân tử  Phương pháp PCR, ứng dụng  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 9/3/2011 2 BM CNSH TV – Khoa CNSH  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ. DNA – DNA - RNA – Protein – Protein (thƣờng ở dạng phức hợp kháng nguyên – kháng thể) CƠ SỞ KHOA HỌC Lai giữa các nucleic acid 9/3/2011 3 Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA