Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (larich desidue) và bèo tấm (lema sp-wolffia sp)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna sp wolffia sp) Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM 7379 26/5/2009 HÀ NỘI – 2008 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI 1 BÀI TÓM TẮT 2 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 4 LỜI MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 7 1.1. Tổng quan về bèo tấm 7 1.1.1. Cây phân loại bèo tấm 7 1.1.2. Phân bố của bèo tấm 7 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm 8 1.1.4. Đặc điểm sinh học 8 1.2. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm 12 1.3. Nghiên cứu chuy ển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp 13 1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 13 1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 15 1.3.3. Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19 1.3.4. Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm 23 1.4. Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna 25 1.4.1. Bệnh Gumboro ở gia cầm 25 1.4.2. Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới 26 1.4.3. Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới 27 1.5. Nghiên cứ u sản xuất vaccin qua đường miệng 29 1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước 30 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Mục tiêu của đề tài 32 2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 32 2.3. Vật liệu 33 2.3.1. Vật liệu thực vật 33 2.3.2. Vật liệu vi khuẩn 33 2.3.3. Hoá chất 35 2. 4. Phương pháp 35 2.4.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 35 2.4.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 44 2.4.3. Phương pháp biến nạp gen 45 2.4.4. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen 49 2.4.5. Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà 57 CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 58 1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT 58 1.1. Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR 58 1.2. Kết quả tạo dòng gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 58 1.2.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR đ 2.1 58 1.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng InV α F ’ 59 1.2.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid 60 1.2.4. Kiểm tra vectơ tái tổ hợp bằng cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI 60 1.3. Kết quả giải trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 61 1.4. Thiết kế vectơ biểu hiện VP2 63 2. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở 66 BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA 66 2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm Wolffia australiana 66 2.1.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều kiện nuôi khác nhau 67 2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana 68 2.1.3. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong ống nghiệm W. australiana trong điều kiện nuôi tủ ổn nhiệt 69 2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm Lemna 70 2.2.1. Tạo vật liệu vô trùng 70 2.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường nhân cây bèo phù hợp 70 2.2.3. Tạo và nhân callus 75 2.2.4. Nhân sinh khối callus dạng I 81 2.2.5. Tái sinh cây từ callus 82 3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM WOFFIA SP, LEMMA SP. 86 3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Woffia sp 86 3.1.1. Xác định chủ ng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana 86 3.1.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87 3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 88 3.1.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 89 3.1.5. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của kháng sinh Geneticin và Paromycine đến khả năng gây chết bèo tấm Woffia australiana 90 3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna 92 3.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 92 3.2.2. Xây d ựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen 99 4. CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA 104 4.1. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana 104 4.2. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna 106 4.2.1. Chuyển gen nguyên cây bèo LA 106 4.2.2. Tạo callus và vật liệu chuyển gen 107 4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II 108 5. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN 109 THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM 109 5.1. Phân tích đánh giá cây chuyển gen 109 5.1.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen 110 5.1.2. Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm 111 5.1.3. Phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen VP2 111 5.1.4. Phân tích lai Southern 113 5.1.5. Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen 113 5.2. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm 116 5.2.1. Thu mẫu huyết thanh gà 116 5.2.2. Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA 117 CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 121 4.1. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 121 4.2. Kết quả về khoa học 121 4.3. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 122 4.4. Trình độ công nghệ 122 4.5. Khả năng áp dụng 123 4.6. Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng 123 4.7. Đào tạo 123 4.8. Sản phẩm khoa học của đề tài 124 4.9. Hợp tác quốc tế 124 4.10. Tình hình sử dụng kinh phí 124 4.11. Danh sách các công trình công bố 125 4.12. Hạn chế của đề tài 125 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126 5.1. Kết luận 126 5.2. Đề nghị 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài DANH MC HèNH Trang Hỡnh 1.1. Vũng sinh sn vụ tớnh ca L. aequinoctialis (Landolt, 1986) 9 Hỡnh 1.2. Hoa ca L.A 10 Hỡnh 1.3. Bốo tm W. australiana nuụi trờn a thch 12 Hỡnh 1.4. Cu trỳc pPAMksGFP 15 Hỡnh 1.5. Cu trỳc Ti plasmid dng octopine 19 Hỡnh 1.6. C ch lõy nhim ca A. tumefaciens vo t bo thc vt 21 Hỡnh 1.7. S cu trỳc h vector nh th 22 Hỡnh 1.8. S cu trỳc vector liờn hp 22 Hỡnh 2.1. Bốo tm W. australiana No. 7540 33 Hỡnh 2.2. Bốo tm Lemna aequinoctialis 33 Hỡnh 2.3: Cu trỳc ca vector nh phõn pBIN GUS-int 34 Hỡnh 2.4: Vector nh phõn pCAMBIA1301 34 Hỡnh 2.5: Cu trỳc Vector pPAM-VP2 34 Hỡnh 3.1. Kt qu sn phm PCR 58 Hỡnh 3.2. Kt qu bin np gen mó hoỏ protein VP2 vo InV F 59 Hỡnh 3.3. Kt qu tỏch chit ADN plasmid 60 Hỡnh 3.4. Kt qu kim tra cỏc dũng ADN plasmid sau khi x lớ bng EcoRI 61 Hỡnh 3. 5. Trỡnh t nucleotit ca on ADN tỏch dũng mang gen VP2 63 Hỡnh 3.6. Phõn ct gen VP2 v vect pPAMksGFP vi enzym ct gii hn. 64 Hỡnh 3.7. Thit k plasmid pPAM- VP2 65 Hỡnh 3.8. Xỏc nh s cú mt ca gen VP2 trong chng Agrocaterium GV3101pMp90 65 Hỡnh 3.9. Mt s hỡnh nh bốo tm LA tỏi sinh sau kh trựng 70 Hỡnh 3.10. Bốo nhõn trờn mụi trng H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0 74 Hỡnh 3.11. Callus to c trờn nn N6/2 vi k t hp 2,4D +BAP 75 Hỡnh 3.12. Mụ callus dng II 76 Hỡnh 3.13. To callus dng I t callus dng II 81 Hỡnh 3.14. Nhõn callus dng I trờn mụi trng cú 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP 82 Hỡnh 3.15. Tỏi sinh cõy t callus dng II 82 Hỡnh 3.16. Bốo tỏi sinh t callus dng I trờn mụi trng khụng cú cht HST 83 Hỡnh 3.17. Tỏi sinh bốo t callus dng I 85 Hỡnh 3.18. Kt qu thớ nghim th chng VK W. australiana 87 Hỡnh 3.19. Xỏc nh thi gian ly tõm chõn khụng thớch hp 87 Hỡnh 3.20: nh hng ca mt VK v thi gian ng nuụi cy 88 Hỡnh 3.21: Kt qu thi nghim thi gian ng nuụi cy v m t VK ln 2 89 Hỡnh 3.22: ỏnh giỏ nh hng ca mụi trng ng nuụi cy 90 Hỡnh 3.23: nh hng ca geneticin n kh nng sng ca W. australiana 91 Hỡnh 3.24: nh hng ca Paramomycin n kh nng sng ca W. australiana 92 Hỡnh 3.25. Biu hin tm ti ca gen GUS trờn bốo tm vi cỏc chng khỏc nhau 93 Hỡnh 3.26. nh hng ca kanamycin ti bốo LA 97 Hỡnh 3.27. nh hng ca hygromycin ti bốo LA 98 Hỡnh 3.28. nh hng c a hygromycin ti bốo LA 99 Hỡnh 3.29. Sng lc cõy bốo tm chuyn gen trờn mụi trng chn lc 106 Hỡnh 3.30: Cỏnh bốo trờn mụi trng dit khun 107 Hỡnh 3.31: Kt qu chn lc nguyờn cỏnh LA trờn mụi trng b sung hygromycin, geneticin 107 Hỡnh 3.32. Callus dng I (A); callus dng II (B) 108 Hỡnh 3.33: Mu callus dng I LA trờn mụi trng dit khun 108 Hỡnh 3.34 : Callus dng II ang tỏi sinh 109 Hỡnh 3.35: Cỏnh bốo chuyn gen callus dng II lot thớ nghim s 12 109 Hỡnh 3.36: Cỏnh bốo chuyn gen callus dng II lot thớ nghim s 25 109 Hỡnh 3.37: Biu hin gen gus cỏnh bốo tm W. australiana (1); W. globosa (2) v bốo LA (3) chuy n gen sau chn lc 110 Hinh 3.38. Kt qu phõn tớch PCR gen gus cỏc dũng bốo tm chuyn gen 111 Hỡnh 3.39. Kt qu phõn tớch PCR cỏc dũng Lemna aequinoctialis chuyn gen 112 Hỡnh 3.40 Kt qu phõn tớch PCR cỏc dũng Wolffia australiana chuyn gen 112 Hỡnh 3.41. Kt qu lai DNA ca cỏc dũng bốo tm chuyn gen VP2 113 Hỡnh 3.42. Kt qu phõn tớch ELISA 6 dũng bốo tm chuyn gen VP2 116 Hỡnh 3.43: Mụ t thớ nghim th kh nng gõy ỏp ng min dch ca bốo tm chuyn gen trờn g 120 Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài DANH MC BNG Trang Bng 1.1.Thnh phn v hm lng cỏc hp cht hu c cú trong cỏnh bốo 8 Bng 2.1. Trỡnh t cỏc on mi s dng trong nghiờn cu 51 Bng 3.1: nh hng ca hm lng khoỏng khỏc nhau n kh nng sinh trng ca W. australiana 66 Bng 3.2: Nghiờn cu kh nng sinh trng v phỏt trin ca W. australiana trong cỏc iu kin nuụi khỏc nhau 67 Bng 3.3: nh hng ca pH n sinh trng ca W. australiana 68 Bng 3.4: To ngun vt liu khi u in vitro 69 Bng 3.5. Hiu qu kh trựng ca cỏc loi hoỏ cht khỏc nhau 70 Bng 3.6. nh hng ca hm lng khoỏng Hutner ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 71 Bng 3.7. nh hng ca pH mụi trng nuụi ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 72 Bng 3.8. nh hng ca sucrose ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 73 Bng 3.9. nh hng ca cỏc nn khoỏng v cht i u ho sinh trng khỏc nhau n s to callus 75 Bng 3.10. nh hng ca hm lng khoỏng trong mụi trng N6 n hiu qu to callus 76 Bng 3.11. nh hng ca 2,4D v BAP n hiu qu to callus (%) 77 Bng 3.12. nh hng ca hm lng ng (g/l) n t l to callus 78 Bng 3.13. nh hng ca hm lng CH n s hỡnh thnh callus 79 Bng 3.14. Kt qu to callus trờn cỏc mụi trng cú pH khỏc nhau 79 Bng 3.15. Kt qu to callus dng I t dng II 80 Bng 3.16. nh hng ca cỏc cht iu ho sinh trng n cht lng callus 81 Bng 3.17. Kt qu tỏi sinh callus dng II 82 Bng 3.18. Hiu qu tỏi sinh cỏc cụng thc cú hm lng BAP khỏc nhau 83 Bng 3.19. nh hng ca IAA v kinetin ti kh nng tỏi sinh cỏnh bốo 84 Bng 3.20. nh hng ca CH ti kh nng tỏi sinh cõy bốo t callus 85 Bng 3.21: Kt qu kho sỏt chng vi khun thớch hp cho chuy n gen vo W. australiana 86 Bng 3.22: Kt qu thớ nghim kho sỏt thi gian ly tõm hỳt chõn khụng 87 Bng 3.23. nh hng ca mt vi khun v thi gian ng nuụi cy 88 Bng 3.24. nh hng ca mt vi khun v thi gian ng nuụi cy 89 Bng 3.25. nh hng ca mụi trng ng nuụi cy 89 Bng 3.26: Kt qu thớ nghim vi geneticin 91 Bng 3.27: Kt qu thớ nghim v i paromomycin 91 Bng 3.28. Biu hin tm thi ca gen GUS trờn mu bốo vi cỏc chng vi khun khỏc nhau 93 Bng 3.29. T l biu hin tm thi ca cỏc bin phỏp tng cng tip xỳc (%) 94 Bng 3.30. nh hng ca thi gian hỳt chõn khụng ti biu hin tm thi 94 Bng 3.31. nh hng ca mt vi khun ti biu hin tm thi 95 Bng 3.32. nh hng c a AS ti t l biu hin tm thi ca gen GUS trờn mu bốo 96 Bng 3.33. nh hng ca kanamycin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 96 Bng 3.34. nh hng ca hygromycin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 97 Bng 3.35. nh hng ca geneticin ti h s nhõn v sc sng bốo tm LA 99 Bng 3.36. nh hng ca tui mu n biu hi n tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy. 100 Bng 3.37. nh hng ca tui mu n biu hin tm thi ca gen gus callus bốo tm. 100 Bng 3.38. nh hng ca khong cỏch bn v ỏp lc khớ n biu hin gen tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy 101 Bng 3.39. nh hng ca khong cỏch bn v ỏp lc khớ n biu hin gen tm thi ca gen gus callus. 101 B ng 3.40. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi bốo nguyờn cõy 102 Bng 3.41. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi callus 102 Bng 3.42. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy 103 Bng 3.43. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm th i ca gen gus callus 103 Bng 3.44. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm Wolffia australiana 105 Bng 3.45. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm L.aequinoctialis 106 Bng 3.46: Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen ch th vo bốo tm LA v W. australiana 110 Bng 3.47. Xỏc nh protein tng s trong dch chit bốo tm chuyn gen 114 Bng 3.48. Kt qu phõn tớch ELISA 6 dũng bốo tm chuyn gen VP2 115 Bng 3.49. Danh sỏch cỏc mu huyt thanh g thu c 116 Bng 3.50: Kt qu xột nghi m ELISA trờn cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng min dch 117 Bng 3.51: Kt qu xột nghim ELISA dng tớnh ca cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng min dch 118 Bng 3.52: ỏnh giỏ mc to khỏng th khỏng protein VP2 trong cỏc mu huyt thanh ca g n bốo tm chuyn gen 119 . 1 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI TT Họ và tên Cơ quan công tác A Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Lê Huy Hàm Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp B Cán bộ tham gia nghiên cứu 1 ThS. Trần Duy Dương Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp 2 Th.S. Vũ Văn Tiến nt 3 TS. Phạm Thị Lý Thu nt 4 TS. Nguyễn Thị Khánh Vân nt 5 PGS. TS. Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 6 PGS. TS. Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 7 PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp 8 CN. Trịnh Thị Minh Thuỳ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp 2 BÀI TÓM TẮT Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh. Việc phòng bệnh bằng vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành y tế và thú y của các nước. Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine cao, ngành chăn nuôi tại các nướ c đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các nước phát triển. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây. Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không nh ững góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học. Trong các loài thực vật được nghiên cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiệ n đặc biệt như: bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng. Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa họ c với Viện Sinh lý phân tử và Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khoẻ con người. Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i) Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá được khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên. Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả chính như sau: • Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu hiện ở thực vật Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam. Thiết kế vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu hiện ở thực v ật. 3 • Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.) Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện phương pháp tạo callus và tái sinh cây ở các loài bèo tấm Wolffia sp. và Lemna sp. Một số đặc điểm sinh học cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tạo callus và tái sinh cây đã được tối ưu. • Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hi ệu quả cao vào bèo tấm (Lemna/Wolffia) Quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp. và Wolfia sp. bằng súng bắn gen và thông qua Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối ưu hoá các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ AS, thời gian đồng nuôi cấy • Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna Các thí nghiệm chuyển gen VP2 đã được thực hiện trên loài bèo tấm Wolffia australina và Lemna aequinoctialis. Các dòng bèo tấm chuyển gen đ ã được duy trì và nhân sinh khối trên môi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc. • Phân tích cây chuyển gen. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen đã được phân tích bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern). Đã nhận được 06 dòng bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã được tách chiết từ các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo tấm chuyển gen có khả n ăng gây đáp ứng miễn dịch trên gà. Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biể u hiện của protein VP2 ở các dòng thông chuyển gen. Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được những kết quả rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và thực tiễn cao. Thành công của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thu ật di truyền thực vật. 4 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid 2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin AS: acetosyringone BAP: 6-Benzyl Amino Purin bp: base pair CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter CH: Casein Hydrolysate cs: cộng sự CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid ĐC: Đối chứng EC: Embryogenic Callus: mô sẹo phôi hoá EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et-Br: Ethidium Bromide GMC: Cây trồng chuyển gen GMO: Sinh vật chuyển gen gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase IAA: Indol-3-Acetic Acid IBA: Indol -3-Butyric Acid Kbp: Kilobase Km: Kanamycine KTST: Kích thích sinh trưởng LA: Lemna aequinoctialis LB: Luria and Bertani MCS: Multi-Cloning Site MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962) NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid NOS: Nopaline Synthetase NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase OD 600 : Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter PCR: Polymerase Chain Reaction T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển TDZ: Thidiazuron Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid 5 LỜI MỞ ĐẦU Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125 triệu ha. Một loạt các giống cây tr ồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008). Sự phát triển hứa hẹn sáng s ủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998). Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động v ật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ s ử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xu ất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal Disease -IBD) cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết và khả năng lây lan cao ở gà con. Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch do virus gây ra và sự liên - tạp nhi ễm các bệnh khác. Cũng do bị suy giảm miễn dịch, mọi chương trình vaccine phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị [...]... canxi và magie, nhiệt độ (Landolt, 1986) 1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính Hình thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi giống (Landolt, 1986; Landolt và Kandeler, 1987) *Sinh sản vô tính 8 Hình 1.1 Vòng sinh sản. .. dinh dưỡng của bèo tấm rất cao Bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2 và các axit amin không thay thế, trừ methionin Riêng protein của bèo tấm có thể đạt từ 15-45% trọng lượng khô tuỳ theo loài (Landolt E., 1986 ), tức là tương đương với đậu tương Theo tính toán, chỉ cần 1-3% trong số protein nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đã làm cho sản xuất protein bằng bèo tấm có hiệu quả cao Vì thế trên. .. phép thực hiện đề tài Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)” Đây là một trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và CHLB Đức, đề tài vừa có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ, xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ... miệng Có thể nói, tình hình nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp và vaccine dùng qua đường miệng bằng kỹ thuật di truyền thực vật, đặc biệt là vaccine dùng qua đường miệng trong thập niên vừa qua di n ra sôi động trên thế giới và đã gặt hái được những thành tựu đáng kể Những ứng dụng đầu tiên về vaccine dùng qua đường miệng sản xuất bằng công nghệ di truyền thực vật sẽ bắt đầu vào năm 2006 Trong. .. định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy, được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008) Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính. .. quá trình di chuyển, protein virE2 gắn với sợi T tạo thành phức hợp T dạng ống sợi nucleo -protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ Protein virB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Citovsky và cs, 1989; Durenberger và cs, 1989;... hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu tiến hành về vaccine dùng qua đường miệng sản xuất bằng thực vật chuyển gen Các nghiên cứu về chuyển gen vào thực vật để tạo giống cây chuyển gen mới chỉ thực sự bắt đầu từ những năm 2001 - 2002, khi chương trình công nghệ sinh học của Nhà nước chính thức phê duyệt một số đề tài chuyển gen vào một số cây nông nghiệp Các nghiên cứu này đang trong. .. chất có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật di truyền thực vật sẽ là một tương lai hứa hẹn nhất của công nghệ sinh học thực vật (RowlandSon & Tackaberry, 2003) Năm 2001, các nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc Bang Carolina đã áp dụng thành công phương pháp chuyển gen vào bèo tấm thông qua Agrobacterium tumefaciens ở giai đoạn nốt sần trước khi tái sinh cánh L.gibba G3 và L.minor 8744 (Yamamoto và cs,... tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào A tumefaciens (Walkerpeach và Velten, 1994) 1.3.4 Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm Trong các loài thực vật được nghiên cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: Họ bèo tấm (Lemnaceae) gồm có 5 chi và. .. thế trên thế giới, trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất hoạt chất bằng bèo tấm Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt chất khác nhau, trong đó có vaccine Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích ứng dụng công nghệ sinh học (www lemnagene . sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)”. Đây là một trong những đề tài. vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng. Đề tài: Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào. BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP