Các phương pháp phân tích trong hóa sinh

Thực phẩm hay nói đơn giản đó là thức ăn, chủ yếu bao gồm các chất như: carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), các vitamin, khoáng chất, và nước, mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạp các chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích. Tuy nhiên, các chất trong thực phẩm dễ bị chuyển hóa bởi nhiều yếu tố khác nhau trong quá trình chế biến và bảo quản.Một trong những yếu tố đó là enzyme.Do phản ứng enzyme mà chất lượng của các nguyên liệu trong quá trình chế biến và bảo quản tăng lên, hoặc giảm sút.Các biện pháp công nghệ trong sản xuất thực phẩm hoặc là kìm hãm hoạt độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cách tối đa.

MỤC LỤC

Contents

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3 ……… 11

Hình 2: Phương trình đường chuẩn………12

Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry……….13

Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm……… 16

Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet………33

Hình 6:.Chai badcook……….37

Hình 7: Hệ thống micromanometre……… 70

Hình 8: Đồ thị đường chuẩn………74

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1: Bảng thực nghiệm của luxisun……… 19

Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu………30

Bảng 3: Một số Vitamin và các phương pháp phân tích……… 43

Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với các nồng độ và độ pha loãng khác nhau……….60

Bảng 5:Chuẩn bị ống nghiệm……… 62

Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu………65

Bảng 7: Kết quả thí nghiệm………65

Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm……….66

Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì………72

là kìm hãm hoạt độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cáchtối đa.

Tất cả các thuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế đođược, biểu diễn được dưới dạng các thông số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc và địnhlượng các thành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chấtlượng sản phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới.Cùng với sự phát triển nhanhchóng của khoa học kỹ thuật, các phương pháp phân tích ngày càng phát triển hơn,hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chấtlượng và quản lý sản xuất

Yêu cầu đặt ra là phải xác định được hàm lượng các chất có trong thực phẩm,cũng như hoạt độ xúc tác của enzyme trong sản xuất thực phẩm.Trên cơ sở biết đượchàm lượng của các nguyên liệu hay các chất có trong thực phẩm, người ta xác địnhđược giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm.Việc xác định được hoạt độ xúc táccủa các enzyme trong thực phẩm nhằm biết được các biến đổi diễn ra trong chế biến,

từ đó có những cách thức sản xuất cho phù hợp

Hóa sinh thực phẩm là môn học quan trọng trong ngành thực phẩm, cung cấpcho chúng ta những kiến thức cần thiết về cấu tạo cũng như sự chuyển hóa của cácchất có trong thực phẩm khi đi vào cơ thể

Ngày nay, có rất nhiều phương pháp phân tích trong hóa sinh thực phẩm.Trongbài tiểu luận này, chúng em xin trình bày một số phương pháp phân tích phổ biến tronghóa sinh thực phẩm

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phan Minh Anh Thư đã giúp chúng em hoàn thiệnbài báo cáo này.Vì kiến thức chuyên môn chưa tốt nên trong quá trình tìm hiểu khôngtránh khỏi thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến cô và các bạn

PHẦN I: PROTEIN

Protein là polymer của các amino acid

Protein có nhiều chức năng quan trọng

• Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme)

• Cấu trúc vật lý: phô mát, bánh mì, các chất tạo bọt, tạo gel…

Các phương pháp xác định hàm lượng protein

1 Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng

1.1 Nguyên tắc:

Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chấthữu cơ bị oxy hóa Carbon và hydro tham gia tạo thành CO2 và H2O Còn nitơ saukhi được giải phóng ra dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tantrong dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng dung dịch NaOH, đồng thời cất và thu

NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N Định lượng H2SO4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH0.1N chuẩn, qua đó ta tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu cần phân tích

1.2 Quy trình thực hiện

• Vô cơ hóa mẫu

Quá trình này được tiến hành hoàn toàn trong tủ Hotte.Mẫu được cho vào bìnhKjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay ít chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g,mẫu lỏng lấy từ 2 đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL) Thêm vào từ từ 10mL

H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh quá trình vơ cơ hóa (đốt cháy) cần phảicho thêm chất xúc tác Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng 0.5g hỗn hợpCuSO4 :K2SO4 (1:3) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốcquá trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO4, giải phóng oxy chophản ứng oxy hóa.Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉđun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch Lưu ý: nếu quá trình vô cơhóa được thực hiện đơn giản bằng cách đun trực tiếp bình Kjendahl trên bếp điện thìtrong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đennào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun chotới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng

Hướng dẫn sử dụng bộ vô cơ hóa mẫu

- Bật công tắc (1) và gia nhiệt trước khoảng 5 phút

- Mang găng tay bảo hộ và nhẹ nhàng lắp bộ giữ (2) chứa các bình vô cơ hóa mẫu (4)vào.

- Cho dung dịch mẫu và chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vô cơ hóa mẫu

- Đóng chặt hệ thống bằng bộ Gaskets

- Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun

Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt.Cần làm nguội trước khilắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit 4

• Cất đạm

Chuẩn bị máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi màn

hình hiện lên thì máy đã sẵn sàng làm việc Lấy vào erlen 10ml dung dịch H2SO4, lắpvào máy Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sụchơi: 50%, thể tích NaOH 40%: 5 – 10mL, thời gian cất: 15 – 30 phút)

Tiến hành: Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl

vào bình định mức 100, thêm nước cho đến vạch định mức Lưu ý acid H2SO4 đậm đặcrất háo nước và tỏa nhiệt mạnh khi tiếp xúc với nước nên có thể làm bay hơi mộtphần.Vì vậy, cần làm nguội và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ raerlen

Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống,chú ý không lắp lệch, khí sẽ thoát ra ngoài, mất mẫu

Tiến hành cất đạm trên máy cho đến khi NH3 được giải phóng hoàn toàn khỏi bìnhKjendahl

Thủ tục hiệu chỉnh như sau:

- Gọi K là tỷ số giữa nồng độ thực tế (Ct) và nồng độ cần pha (Cp) của NaOH.

- Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân bằng V (mL) NaOH 0.1N đã phasẵn.Thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K

1.3 Tính kết quả:

Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có trong mẫu:

N = Trong đó:

N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng

a – số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3

b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ

m – khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, g

V – tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa (100mL)

v – thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất (10 mL)0.0014 – lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H2SO4 0.1N

• Đơn giản, chi phí thấp

• Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thô (AOAC945.01)

Nhược điểm của phương pháp

• Không phải tất cả N là protein, ngoài ra có thể xác định cả: Purine, PyrimidineDNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có > 50% N phi protein, Melamine

• Chỉ xác định được hàm lượng N tổng, không xác định được chính xác hàmlượng N protein

• Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu

2 Phương pháp biuret

2.1 Nguyên tắc

Biuret và peptide phản ứng với Cu2+ tạo thành một phức hợp có màu tím hấp thụánh sáng bước sóng 540nm.(Biuret là một hợp chất ngưng tụ của urea sau khi bị đốtnóng) Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu

• Cách pha thuốc thử Biuret

Thuốc thử biuret được pha từ 3 dung dịch thuốc thử là dung dịch A, B và C Các dungdịch này được chuẩn bị như sau:

- Dung dịch A: 05g CuSO4 5H2O hòa tan trong 495 mL nước ( dung dịch CuSO4.5H2O 1%)

- Dung dịch B: 10g NaKC4H4O6.4 H2O hòa tan trong 490 mL nước ( dung dịchNaKC4H4O6.4 H2O 2%)

- Dung dịch C: 20,5g Na2CO3 và 4g NaOH hòa tan và định mức thành 1 lít dung dịch(dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N)

Thuốc thử biuret = 1 mL dung dịch A + 1 mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C

Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3

Amino acid đơn và dipeptide không phản ứng

Vùng nồng độ tuyến tính là 1-5 mg/ml

Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin).

2.2 Quy trình thực hiện

• Dựng đường chuẩn

Pha 5 dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò ứng với 5 nồng độ khác nhau 2, 4,

6, 8 và 10 (mg protein/ mL).Lấy 1 mL từng dung dịch protein chuẩn và 5 mL thuốc thửbiuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp được lắc đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợpsau đó được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm

Vẽ đường chuẩn: trục hoành là nồng độ protein, trục tung là độ hấp thu

Hình 2: Phương trình đường chuẩn

• Nhanh (khoảng 30 phút), đơn giản, màu sắc ít biến đổi hơn so với các phươngpháp Lowry, UV, có ít hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret,không phát hiện N từ nguồn không phải peptide hoặc protein.

• Không sử dụng hó chất độc hại

Nhược điểm

• Không nhạy bằng phương pháp Lowry

• Cần 2 – 4 mg protein cho một lần đo

• Các muối ammoni nồng độ cao có thể gây ảnh hưởng

3 Phương pháp lowry

3.1 Nguyên tắc

Cu2+ trong môi trường kiềm sẽ tạo phức hợp với protein.Cu2+ xúc tác oxy hóa nhómphenol trong tyrosine và tryptophan bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic-phosphotungstic acid) => tạo ra hỗn hợp có màu

Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry

3.2 Quy trình thực hiện

Pha loãng mẫu (20 – 100 microgam protein)

Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na2CO3 10 phút ở nhiệt độ phòng

Phản ứng với CuSO4- KNa tartate-NaOH 10 ở nhiệt độ phòng

Tiếp đó cho phản ứng với Folin 10 phút ở 500C

Đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm

Ưu điểm:

• Tính chuyên biệt cao, nhanh và đơn giản (~1.5 giờ).

• Rất nhạy: 20-100 µg.– 50-100 x so với Biuret, 10-20 x so với UV 280 nm

Nhược điểm

• Rất nhạy cảm với thay đổi pH

• Màu dễ bị biến đổi bởi các loại protein khác nhau (nhiều hơn so với Biuret)

• Có nhiều hợp chất gây ảnh hưởng: sucrose, lipid, đường khử, hexoamine, aminosulfate…

• Không sử dụng hóa chất độc hại

• Có thể xác định lượng protein trong mẫu trong vòng 3 phút, có thể tiến hành mộtlúc 150 mẫu

5.2 Quy trình:

• Trộn protein, chất nhuộm, đệm pH 2

• Lọc hoặc ly tâm

• Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở 470 nm

Mật độ quang của chất nhuộm gắn kết protein ≈ nồng độ chất nhuộm ban đầu – nồng

độ chất nhuộm trong dịch lọc

Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm

Các yếu tố ảnh hưởng đến nhuộm màu ion âm:

• Oligosaccharide: thường 2-10 đường đơn

• Polysaccharide: polymer của đường đơn

Chức năng: Nguồn carbon và năng lượng

Một số phương pháp định lượng carbohydrate:

1 Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

1.1 Nguyên tắc

Trong môi trường kiềm các đường khử (glucoza, fructoza, mantoza ) khử oxitđồng (2) thành oxit đồng 1 (Cu+2→Cu+1).Để định lượng đường khử dùng thuốc thửFehling: dung dịch sunfat đồng (Fehling I) và dung dịch muối xecnhet: muối kali-natritartrate kép (Fehlinh II) hoặc gọi là Fehling A và Fehling B, theo tỉ lệ 1:1 Khi trộn Fehling

I và Fehling II, đầu tiên tạo thành Cu(OH)2 có màu xanh da trời

Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu+ trong môi trường kiềm không bị kết tủa dướidạng Cu(OH)2 Muối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehithoặc xeton dễ dàng khử Cu+2 thành Cu+ ra kết tủa oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ.

Để định lượng oxit đồng I được tạo thành trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt 3hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit sunfuric, Cu+ sẽ bị oxi hóa trở lại thành

Cu+2 , còn Fe+3 bị khử thành Fe+2

Cu 2 O + Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2H 2 SO 4 = 2 CuSO 4 + FeSO 4 + H 2 O

Tiếp đó lượng Fe+2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịchKMnO4 chuẩn độ trong môi trường axit

10FeSO 4 + 2 KMnO 4 + 8H 2 SO 4 = 5Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + H 2 O

Dựa vào lượng KMnO4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMnO4 1/30N vàlượng đường khử (bảng 1) để dễ sử dụng

• Hóa chất

Thuốc thử Fehling

+ Fehling I: 40g CuSO4.5H2O/1 lít

+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g NaOH/ 1 lít

• Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: 50g Fe2(SO4)3 + 200ml H2SO4 đậm đặc(d = 1,4)/lit Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni

• 86g (NH4)2SO4 Fe2(SO4)3.24H2O + 200g (108,7ml) H4SO4 d = 1,84/l

• KMnO4 1/30N; 1,06g KMnO4/1 lít nước cất đun sôi Nồng độ KMnO4 được xácđịnh bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha

1.2 Cách tiến hành

• Xử lí mẫu

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng

để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:

a Trong trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin:

Có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước.Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạthay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô đã được nghiền nhỏ(và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thìcân 5 – 10 g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70

80°C Chuyển toàn bộhổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít Đun cách thủy 70 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat[Pb(C2H2O2) 2.3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO3)2] 10%.Tránh dùng quá dư chì axetat(dùng 2 - 5ml chì axetat).Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na SO

-bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút.Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc quagiấy lọc vào cốc hay bình khô.Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.

b Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc

Cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy cólắp ống làm lạnh không khí.Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chìaxetat vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

c Trường hợp mẫu chứa nhiều protein

Kết tủa protein và các tạp chất dùng dung dịch tricloacetic 10 %, sau đó trung hòa bằngdung dịch NaOH 5 % với chỉ thị metyl đỏ (màu đỏ chuyển sang màu vàng).Thêm nướccất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc.Nước qua lọc là dung dịch đường khử cần địnhlượng

d Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ

Cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần

Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose Trước khi đun cách thủy hỗnhợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0

• Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị (xem ở trên) được lấy 10 ml (0,8 – 40mgđường) cho vào bình tam giác V 100ml, thêm 5ml Fehling I và 5 ml Fehling II Đun sôihỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên Sau khi đun sôi dung dịchvẫn giữ màu xanh biếc đặc trưng.Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Fehling chovào không đủ.Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Fehling hoặc giảmlượng mẫu.Để yên, lọc bằng phễu lọc đường (G-4) vào bình lọc chân khôngbenzen.Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 – 4 lần Chú ý giữ phần lớn lượngoxit đồng I nằm lại trong bình tam giác và lớp oxit đồng trong bình và trên phễu luônđược phủ một lớp nước nóng để Cu2O khỏi bị oxi hóa bởi O2 của không khí Hòa tankết tủa của oxit đồng I vào bình bunzen khác bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml)dung dịch sunfat sắt 3 trong môi trường H2SO4 vào bình có chứa kết tủa Cu2O vàchuyển sang phễu lọc.Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng.Nước tráng cũng thu vào bình Định phân dung dịch bằng KMnO4 1/30N cho đến khixuất hiện màu hồng nhạt không mất đi trong 20-30 giây.Biết lượng định phân, tra bảngsuy ra lượng đường trong dung dịch thí nghiệm Làm thí nghiệm kiểm chứng song songthay dung dịch đường bằng nước cất

1.3 Tính kết quả

Hàm lượng đường khửtính theo phần trăm (%):

RS% =Trong đó:

a: sốmg glucoza tra bảng ứng với sốml KMnO4 1/30N trừ đi sốml KMnO4 1/30Ncủa mẫu kiểm chứng;

1000: hệ số chuyển đổi sang mg

2 Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

2.1 Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm của đường khử (glucose,fructose, mantose ) có thể khử dễ dàng đồng (II) thành oxit đồng (I) (Cu+2 →Cu+1) dướidạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) tính đượclượng đường khử.Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:

Khi trộn hai dung dịch Fehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữachúng theo hai giai đoạn:

Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trời:

CuSO 4 +2NaOH = Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịchmàu xanh thẫm:

Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặcxeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thânđường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling:

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường

H2SO4 sẽ giải phóng ra iot tự do

CuSO 4 + 4KI + H 2 SO 4 I 2 + CuI 2 + 2K 2 SO 4

Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosunfat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính đượclượng đường khử có trong dung dịch

I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 = Na 2 S 4 O 6 +2NaI

• Hóa chất

Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO4.5H2O trong 500ml H2O

Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H2O

Dung dịch KI 30%, dung dịch H2SO4 25% , dung dịch Na2S2O3 0,1N

Bước 2: Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên) Sau khi đun sôi, dungdịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa đồng I oxit màu đỏ gạch

là được Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vàokhông đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm với dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dungdịch đường.Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng I oxit thì phải tăng lượng dungdịch đường, giảm nước cất (luôn đảm bảo thể tích là 5ml)

Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1ml H2SO4 25% và 1ml KI 30%, lắc đều

3 Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid

Trong nhiều loại rau, củ, quả các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khá lớnsaccarose cùng với đường khử.Saccarose không có tính khử nên không thể trực tiếp

xác định bằng phương pháp Bertrand.Để có thể xác định saccarose bằng phương phápnày phải thủy phân saccarose thành đường khử (glucozo và fructozo).

3.1 Nguyên tắc

Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử

là glucose và fructose.Định lượng đường khử tạo thành cho pháp tính được lượng

saccarose có trong mẫu thí nghiệm.

C 12 H 22 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6

(saccarose) (glucose) (fructose)

Hóa chất :

Dung dịch HCl 5%

Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa

Metyl đỏ 0,02% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo phương pháp Bertrand

3.2 Tiến hành

• Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xác địnhđường khử cho vào bình nón 250ml)

• Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%

• Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30 – 40 phút, làmnguội nhanh

• Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH 6,5 – 7,0 với chỉ thịmetyl đỏ(3 giọt)

• Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand

Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thểkết quả sẽ bị sai

khác, bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một sốphần hay hoàn toàn.Trong quá trình thủy phân những chất này cũng tạo thành cácmonosacarit.Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dungdịch đạt 75 – 80%

3.3 Tính kết quả

Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo công thức:

X = (a – b) 0,95Trong đó:

X: hàm lượng saccarose tính theo %

a: hàm lượng đường khử theo glucose của dịch đường sau khi thủy phân bằngaxit (%)

b: hàm lượng đường khửcủa dung dịch đường (trước khi thủy phân) (%)

0,95: hệ số chuyển từ glucose sang saccarose

4 Phương pháp định lượng saccarose

4.1 Nguyên tắc

Làm trong dung dịch trước khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có gócquay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo Các chất làm trongthường sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH3COO)2.3H2O và axetat chì kiềm tính2Pb(CH3COO)2.Pb(OH)2 ở dạng bột hoặc dung dịch Axetat chì lắng hàng loạt các chấtnhư axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màumelanoidin

Chú ý: không dùng quá lượng axetat chì vì một số kết tủa có khả năng hòa tan khi

dư axetat chì như các protein Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợpgồm hai dung dịch Pb(NO3)2 và NaOH 340 g Pb(NO3)2 /1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượngbằng nhau (5-10 ml) Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.Chú ý: Lượng chì dưtrong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH2PO4 hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc.Thước đo độ đường: theo quy định thước đo độ đường trong kế chỉ 100°S khi ta hòatan 26g đường saccaroza tinh khiết trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200

mm ở 20°C 26 g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn Khicân mẫu với lượng cân chuẩn và phân cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước

đo cho ta biết % đường trong mẫu.Trong thực tế phân tích ta có thể lấy bội số hoặc ước

số của chúng Ví dụ nếu lấy13g pha trong 100ml phân cực trong ống 200 mm thì thànhphần đường sẽ là P×2

Trong đó: P – số đọc trên máy Hoặc pha 26g trong mẫu 100 ml phân cực bằng ống

100 mm thì thành phần đường cũng bằng P×2

• Hóa chất

Dung dịch axetat chì trung tính 250g Pb(CH3COO)2.3H2O + 50 ml nước cất, khuấyđều, lọc Nước lọc trung hòa bằng axit yếu.Pha nước cất đến khấc 1 lít Dung dịchaxetat chì kiềm tính: 100g oxit chì (PbO)+ 230g axit chì trung tính +50 ml nước cất Đunsôi trong ½ giờ để thủy phân oxit Để nguội, lọc, pha bằng nước cất đến 1 lit (54Bx) Dung dịch nitrat chì: 340 g Pb(NO3)2 trong 1 lit; 32g NaOH trong 1 lit

HCl 24,85 Bx: 510,57 ml HCl đậm đặc trong 1 lít

NaCl: 231,5 g NaCl trong 1 lít

Than hoạt tính 5g/100ml, axit axetic đậm đặc, Ete etylic, bột kẽm,

4.2 Tiến hành: Xác định hàm lượng saccaroza trong đường kính

Cân 26 g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã cân trọnglượng cốc) Hòa tan đường trong cốc bằng khoảng 40 – 50 ml nước cất đã đun nóngdùng đũa thủy tinh khuấy cho đường tan hết

Rót toàn bộ dung dịch đường sang bình định mức, rửa sạch đường trong cốc, quethủy tinh và phễu bằng một ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức

Thêm nước cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng15-20 phút cho nhiệt độdung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng

Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 phút rồilọc.Khi lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng kính thủy tinh để tránh nước bay hơi làm thay đổinồng độ Mẻ lọc đầu đổ đi.Nước lọc phải trong suốt.Rót dung dịch vào ống phân cự 200mm; nhớ tráng ống bằng dung dịch nước lọc 1-2 lần và rót bằng cách đẩy nhẹ trênmiệng ống để tránh tạo bọt

Đậy nắp ống phân cực bằng nắp thủy tinh bằng cách đẩy nhẹ nắp trên miệngống.Giữ yên rồi vặn nút cao su vào miệng ống

Lau khô hai đầu ống bằng một miếng giấy lọc

Đưa ống ra ánh sáng quan sát, ống phải được nhìn thông suốt và không có bọt, nếu

có bắt buộc phải làm lại Đặt ống phân cực vào máy, bật điện và bắt đầu đo.Ghi kết quả

và ghi nhiệt độ t

4.3 Tính kết quả

Hàm lượng đường saccaroza tính theo %; X

X = Pt [1 + 0,0003 (t – 20)]

Trong đó:

Pt : hàm lượng đường đọc được trên máy ;

t : nhiệt độ

5 Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác

Muốn biết riêng hàm lượng của glucose và fructose, người ta phải định lượngfructose.Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucosebằng hiệu hàm lượng đường khử và hàm lượng fructose.Trước hết phải xác định lượngđường khử tổng số, sau đó mới xác định lượng fructose

5.1 Nguyên tắc

Đầu tiên oxi hóa glucose và các đường khử khác bằng dung dịch kiềm của iôt

CH 2 OH(CHOH) 4 CHO+ I 2 + 3NaOH = CH 2 OH(CHOH) 4 COONa + 2NaI + H 2 O

Trong điều kiện này, fructose không bị oxi hóa Sau đó xác định fructose bằng phươngpháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng

• Hóa chất

Dung dịch iot 0,2N trong KI, dung dịch NaOH 0,2N, dung dịch NaOH 5%, dung dịch

H2SO4 5%, dung dịch Na2SO3 5%, dung dịch methyl 0,02% (0,02g metylđỏ(C15H15N3O2) 60 ml cồn, 40 ml nước)

Các thuốc thử dùng để xác định đường khử

5.2 Tiến hành

Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20 mgglucose Trung hòa đến pH 6,5 – 7,0 Cho thêm 5ml dung dịch iot 0,2N và 2,5ml dungdịch NaOH 0,2N (thêm từng giọt).Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng

Axit hóa dung dịch bằng 2ml H2SO4 5% và loại iot dư bằng dung dịch Na2SO35%(nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch mất màu vàng rơm)

Thêm vài giọt metyl đỏ và trung hòa hỗn hợp bằng NaOH 5%.Thể tích dung dịchthu được là Vđo Dịch thu được chỉ chứa fructose Phân tích fructose theo phương phápBertrand hoặc theo phương pháp vi lượng.

5.3 Tính kết quả

Nếu fructose được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường đượcxác định theo công thức sau:

X = 100 (%)Trong đó:

a - số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng,

b - hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,

f - hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N

3,3 - hệ số chuyển thành đường

V – tổng thể tích dịch chiết từm gam nguyên liệu (ml)

20 – lượng dung dịch thí nghiệm loại các đường khử khác (trừ fructose)

Dung dịch HCl 5%, dung dịch NaOH 5%, dung dịch Pb(CH3COO)2 10% hoặc Pb(NO3)2

10%, dung dịch Na2SO4 hoặc NaHPO4 bão hòa

Các thuốc thử dùng để xác định đường khử

6.2 Tiến hành

Cân 200-250g mẫu tinh bột đã nghiền nhỏ(đã biết độ ẩm), cho vào bình cầu dungtích 100ml Cho thêm vào bình 50ml nước cất, lắc đều, giữ yên 30-45 phút, lọc, bỏnước lọc để loại bỏ đường tan

Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần.Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vào bìnhcầu chứa 25ml dung dịch HCl 5%.Đậy kín bình bằng nút cao su có nắp ống làm lạnh hồilưu

Đun cách thủy hỗn hợp 3-5 giờ Thử sự thủy phân hoàn toàn của tinh bột bằngdung dịch iot.Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH 5,6-6,0(bỏ trực tiếp mẫu giấy quỳcho vào bình)

Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml Kết tủa protein bằng dung dịch chìaxetat 10% Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch Na2SO4 hoặc NaHPO4 bão hòa.Thêmnước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc

Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương phápBertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột

6.3 Tính kết quả

Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức sau:

X =Trong đó:

W – khối lượng mẫu thí nghiệm (mg)

100 – hệ số chuyển thành %;

0,9 – hệ số quy chuyển glucozo thành tinh bột

7 Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử DNS

7.1 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốcthử dinitrosalicylicacid (DNS).Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ được khử trong một phạm vi nhất định Dựa vào phương trình đườngchuẩn sẽ xác định được hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm

7.2 Quy trình thực hiện

• Quy trình xử lý mẫu:

Tương tự như phương pháp Bertand

• Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose

Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ốngnghiệm sau:

Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu

Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút Sau đó, làm nguội nhanh các ốngnghiệm đến nhiệt độ phòng.

Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với các mẫu chuẩn và mẫu trắng bằng máyquang phổ so màu

Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu: lấy 1mL phần dịch trong cho vào ốngnghiệm để xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp so màu Tùy vào nồng

độ đường khử có trong mẫu mà tiến hành pha loãng mẫu hoặc chuẩn theo tỷ lệ thíchhợp

Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R

7.3 Tính kết quả

Dựa trên độ hấp thu đở ở bước sóng 540nm, ta có thể xác định hàm lượngđường khử có trong 1mL mẫu.Từ đó, ta có thể xác định hàm lượng đường khử trongnguyên liệu ban đầu (G, %w/w) theo công thức:

G (%) = Trong đó:

X - nồng độ đường khử (theo glucose) trong dung dịch mẫu (mg/mL)

F - hệ số pha loãng từ bình định mức

Vđm - thể tích định mức dung dịch thí nghiệm

m - khối lượng mẫu (g)

8 Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với KALIFERRYCYANURE

8.1 Nguyên tắc:

Khi cho ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được làferrocyanure Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt trongdung dịch cần xác định Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm NaOH,khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen (methylen blue)

Phương trình phản ứng:

Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiềm của sulfat đồng

do không tạo tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng.Kết quả tính toán không dựa vàophương trình lý thuyết, mà dùng công thức thực nghiệm.Độ chính xác của kết quả phụthuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác là quan trọng nhất

8.2 Quy trình thực hiện

• Quy trình xử lý mẫu: tương tự như phương pháp Bertrand

• Chuẩn độ xác định hàm lượng đường khử

Từ m gam (hoặc mL nếu mẫu lỏng) mẫu ban đầu, chúng ta tiến hành trích ly đườngkhử và định mức thành 100 mL (dung dịch chứa đường khử thô).Cho vào burette dungdịch mẫu chứa đường khử đã được lọc tách tạp chất

Cho vào erlen 10mL dung dịch K3Fe(CN)61% và 2,5mL dung dịch NaOH 2,5N Đunsôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử hoặc đường tổng từ burette,cho từng giọt một, lắc mạnh.Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferrycyanure.Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốtkhông màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt củaferrocyanure Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kếtthúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue và một giọt đường thừa đầu tiên sẽlàm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc

Lưu ý:

• Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai.Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theokết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1mL để chuẩn độ tiếp tìmchính xác điểm cuối

• Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi

• Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 0,5%

Lượng đường khử được tính bằng công thức:

Xk = Trong đó:

Xk– lượng đường khử, g/100g hay g/100mL

Vg– thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ, mL

Vk– thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, mL

V – thể tích bình định mức, mL (100 mL)

m – lượng mẫu thí nghiệm, g hoặc Ml

PHẦN III: LIPID (CHẤT BÉO)

Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol.Lipid thường gặp là dầu thựcvật và mỡ động vật.Ở động vật, lipid phân bố chủ yếu trong mô mỡ, não, sữa…; còn ở thựcvật thường tập trung ở hạt (nành, phộng, oliu, hướng dương, cám,…)

Chất béo có thể hoà tan trong ether, chloroform, hoặc các dung môi hữu cơ khác, khônghòa tan trong nước

Các phương pháp định lượng lipid:

1 Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet

1.1 Nguyên tắc

Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ.Một

số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamintan trong chất béo, các chất mùi.Tuy nhiên, hàm lượng của chúng tương đối thấp Do có lẫntạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô

Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cấtloại sạch dung môi hoặc tính gián tiếp tư khối lượng bã còn lại sau khi trích ly hoàn toànlipid bằng dung môi

1.2 Quy trình thực hiện:

Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi.Cân khoảng 5g nguyên liệu đã đượcnghiền nhỏ, cho vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet đã được sấy khô và biết khốilượng Đặt túi giấy vào trụchiết.Lắp cốc chứa dung môi vào các vị trí cố định trên thiết bị.

Mở van cho nước lạnh vào ống sinh hàn.Bất công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độtrích ly Quá trình trích ly có thể tiến hành theo 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: nhúng toàn bộ trụ chiết chứa nguyên liệu vào cốc chứa dung môi, thời giantiến hành là 2 – 3 giờ

- Giai đoạn 2: kéo trụ chiết lên khỏi cốc dung môi và tiếp tục trích ly bằng dung môi đã hoànlưu

Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet

1.3 Tính kết quả

Hàm lượng phần trăm chất béo tính theo công thức:

X = (M1– M2)*100/m Trong đó:

M1 là khối lượng túi giấy và mẫu ban đầu, gM2: khối lượng túi giấy và mẫu sau khi trích lipid và sấy khô, gM: khối lượng mẫu ban đầu, g

2 Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam Rose-Gottlieb 2.1 Nguyên tắc

Chất béo trong mẫu sữa được trích ly bằng cách bổ sung lần lược 4 dung môi khácnhau: amoniac, cồn, diethy ether và petroleum ether.Cồn và amoniac được dùng để kết tủa

và loại protein ra khỏi các hạt cầu béo Diethy ether được dùng để trích ly béo và các thànhphần tan trong béo Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và một lượng nhỏ các

thành phần tan trong béo do petroleum ether là dung môi trích ly có tính chọn lọc cao hơn

so với diethyl ether

Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ởtrên gồm dung môi và béo, pha nặng nằm dưới gồm nước và các chất hòa tan trong nước

Ta thu pha nhẹ gồm dung môi và béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tổng béo trongmẫu sữa

2.2 Quy trình thực hiện

Lấy 10mL dịch sữa cho vào erlen 250mL.Sau đó bổ sung lần lược 1.5 mL dung dịch NH3

và 10mL cồn.Lắc đều hỗn hợp trong 1 phút.Thêm từ từ 25mL diethy ether và lắc đều hỗn hợp trong 10 phút.Cuối cùng, 25mL diethy ether được bổ sung và hỗn hợp được lắc đều trong 10 phút

Chuyển toàn bộ hỗn hợp sữa và dung môi vào phễu chiết.Tráng erlen bằng petroleumether nhiều lần nhằm trích ly hết béo còn sót lại trên thành erlen.Cho toàn bộ hỗn hợp nàyvào phễu chiết và để quá trình tách lớp diễn ra tự nhiên trong 30 phút.Hỗn hợp sẽ táchthành 2 pha Pha nhẹ là hỗn hợp gồm dung môi diethy ether, petroleum ether và béo, phanặng gồm protein kết tủa, cồn, NH3và các thành phần còn lại trong sữa Thu pha nhẹ vàcho vào đĩa petri Đạt đĩa petri vào trong tủ hút cho đến khi dung môi bay hơi gần hết, sau

đó cho đĩa petri này vào tủ sấy đang ở chế độ sấy 102 ± 1 0C.Sấy đến khối lượng không đổi(khoảng 1h) Sau đó đĩa petri chứa béo được làm nguội về nhiệt độ phòng và cân địnhlượng

2.3 Tính toán kết quả

Hàm lượng chất béo có trong 100mL dịch sữa được tính theo công thức sau:

TF = Trong đó:

TF (total fat): hàm lượng béo trong 100mL dịch sữa(g/100mL)M: khối lượng đĩa petri và béo sau khi sấy

m: khối lượng đĩa petri ban đầuv: thể tích sữa đem phân tích (10mL)

3 Phương pháp Chloroform- Methanol

3.1 Nguyên tắc

Sử dụng methanol, chloroform hòa tan chất béo trong mẫu thực phẩm.Hỗn hợp mẫu và

dung môi sẽ được tách thành hai lớp Tách lấy lớp chất béo đem đi sấy khô đến khối lượngkhông đổi và đi cân định lượng

• Trộn 1g mẫu và 10ml Methanol và đồng hóa bằng cấy đảo trộn trong 1 phút

• Bổ sung 20ml Chloroform và đồng hóa trong 2 phút

• Lọc hỗn hợp qua giấy lọc ( dung môi hòa tan chất béo hoặc xác chất rắn )

• Bổ sung dịch lọc với 30ml hỗn hợp Chloroform-Methanol với tỷ lệ 2:1 và lọc lần haivới giấy lọc

• Xác định thể tích dịch lọc và bổ sung dung dịch KCL 0.88 % vào dịch lọc với thể tíchbằng 25% thể tích dịch lọc

• Lúc này, hỗn hợp tách làm hai lớp: lớp dưới là dung môi hòa tan béo,lớp trên chứaKCL.Ta thu nhận lớp dung môi hòa tan béo

• Xác định thể tích dịch trích và bổ sung nước với thể tích bằng 25% thể tích dịch trích

• Bổ sung Na2SO4 vào hỗn hợp để loại nước.lọc hỗn hợp qua giấy lọc, Sử dụngchloroform để rửa natri sunfat trên giấy lọc

Đặt hỗn hợp chloroform - lipid trong một bình đáy tròn và loại bỏ chloroform từ lipid bằngcách sử dụng một thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ nước dưới 50°C, ta thu được lượng lipidtrong mẫu

4 Phương pháp Babcook.

4.1 Nguyên tắc

Sử dụng H2SO4 để kết tủa protein, tạo ra nhiệt và giải phóng chất béo => hỗn hợp tựtách làm hai lớp: lớp trên là chất béo, lớp dưới là những chất hào tan => đo thể tích lớp trênchứa chất béo => % chất béo trong hỗn hợp

4.2 Quy trình:

• Cho mẫu vào chai badcook và cho acid vào,cho phép acid chạy nhẹ nhàng xuống cổchai,acid sẽ làm protein kết tủa,sinh nhiệt và giúp giải phóng chất béo Ly tâm hỗnhợp bằng cách lắc mạnh hỗn hợp trong 5 phút

• Bổ sung nước vào chai để đẩy chất béo lên trên cổ chai.Thắt chặt các nút và kết hợplắc trong 4 phút

• Đặt chai trong cốc nước 60-63°C trong 5 phút rồi xác định thể tích chất béo bằngvạch đo trên cổ chai

2,5-2

Sau khi loại bỏ phần trên, phần còn lại cho vào phễu chiết, thêm vào đómột ít CHCl3, và nước cất lắc mạnh để lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bìnhcầu đã cân sẵn để biết trọng lượng Lại cho thêm CHCl , và nước vào phần còn lại ở

Phần dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cấtchân không để cất đuổi CHCl3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất chođốn khô Phần còn lại trong binh cầu chi là chất béo Để bình cầu vào bình hút

ẩm rồi cân (nếu trường hợp thấy trong bình cầu đục hoặc có cặn thì cho vào

đó ít CHCl3, và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hếtCHCl3)

5.2 Tính kết quả

Hàm lượng chất béo theo % tính bằng công thức sau:

X% = Trong đó:

G1: trọng lượng bình cầu chứa chất béo (g)

G2: trọng lượng bình không (g)

G: trọng lượng mẫu phân tích (g)

PHẦN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN

Vitamin, còn gọi là sinh tố, là một yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu của mọi sinh vật, đó là những hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ, có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nhưng đều có hoạt tính sinh học đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa trong cơ thể hoạt động bình thường, và có ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của sinh vật.Khi nói đến chất dinh dưỡng thì không ai lại không nghĩ đến vitamin, nó được coi

là một chất dinh dưỡng không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày Nó có vai trò rấtquan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của con người, nếu thiếu Vitamin thì conngười sẽ mắc một số bệnh như thiếu vitamin A thường có triệu chứng quáng gà, thiếuvitamin B12 dễ teo não, thiếu vitamin D có liên quan đến bệnh phổi tự miễn, Ngoài ra,chúng ta cần phải quan tâm đến hàm lượng vitamin trong thực phẩm để lựa chọn cácthực phẩm sao cho phù hợp với cơ thể để tránh tình trạng thừa vitamin

Phương pháp xác định một số vitamin:

 Vitamin tan trong dầu

1 Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột.

1.1 Nguyên tắc

Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem

so màu.Đầu tiên cho một lượng nhỏ chất phân tích vào đầu cột, cho tiếp xúc với vật liệuhấp thụ, cho pha động chạy qua cột do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nênchất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh thì sẽ bị giữ lại lâu hơn còn những chất có áilực yếu hơn sẽ bị pha động cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau.Sau đó lấy các cấu

tử đã được tách ra đem so sánh với mẫu chuẩn

Hóa chất:

• Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm Rửa cát qua rây bằngnước máy, rồi dùng HCl( tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm Rủa cátcho tới hết axit Rủa lại bằng nước cất, sấy khô

• Benzen: nhiệt độ sôi 70 – 80 0C

• Chất hấp phụ: nhôm oxit (Al2O3)

• Natrisunfat khan (Na2SO4)

• Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn

1.2 Cách tiến hành.

Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ nghiền kỹ với 5g cát sạchtrong 30 phút Để làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10g Na2SO4 khan nghiền tiếp hỗnhợp trong 30 phút nữa

Phần dưới của cột sắc ký kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút.Để làm khô kỹ, ta chothêm được nhồi bông thấm nước.Sau đó cột được nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột.Dùngđũa thủy tinh nén nhôm oxyt cho chặt.Trên cùng lại đặt 1 lớp bông dày 1cm

Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký.Cho bezen vào cột đếnkhi thấy lớp bột không thấm benzen nữa.Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rữachầm chậm bằng benzen đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cộtsắc ký vào bình hứng cần chú ý cho bezen phủ ngập lớp bột vì caroten dễ bị oxy hóabởi không khí

Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc100ml (tùy thể tích nước hứng được) và thêm bezen đến vạch mức, lắc nhẹ Dung dịchcaroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng

10 lần) Trong 1ml dung dịch có màu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa0,00235 mg caroten

Vitamin A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hóa học như hình sau vàthường kết hợp với axit béo (palmitic và stearic) tạo thành este phức tạp Vì vậy khimuốn xác định vitamin A phải xà phòng hóa cácsản phẩm, ròi xác định vitamin A trongphần không xà phòng hóa.Vitamin A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hóabằng chloroform khan và nó cho phản ứng với antimony (III) clorua tạo sản phẩm màuxanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn.

2.2 Cách tiến hành

Cần 10 đến 20g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung dịch kalihydroxit 20% trong rượu etylic Đậy bình bằng nút bất có gắn ống làm lạnh và đun hồilưu trên nồi cách thủy ở nhiệt đọ 85-90oC trong 2 giờ để xà phòng hóa Dung dịch đã xàphòng hóa được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu chiết thêm vàophễu chiết 50ml ete etylic và lắc kĩ ( để tránh huyền phù cần chiết dịch lúc nguội và lắcmạnh ) chiết phần không xà phòng hóa ra, tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễuchiết thứ 2 Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3-4 lần mỗi lần 20ml nước cất cho đếnkhi nước rửa có phản ứng trung tính ( thử bằng giấy quỳ) Làm khô nước chiết đã rửabằng 6gam natrisunfat khan trong 30 phút Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đunđuổi este trên nồi cách thủy

Hòa tan cặn không xà phòng hóa thu được bằng cloroform ( sau khi đã đuổi hếteste) và chuyển vào bình định mức dung tích 25ml, thêm cloroform cho đến vạch, lắcnhẹ

Cho vào ống nghiệm ( khô,sạch,cùng màu ,cùng kích thước như ống nghiệm chứadung dịch tiêu chuẩn) đúng 0,2ml dung dịch trong bình định mức trên, thêm 1-3 giọtanhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl3 bão hòa lắc nhanh và để không quá 10 giây đem

đo màu với ống tiêu chuẩn trong 20 giây

 Vitamin tan trong nước

3 Xác định vitamin C

3.1 Nguyên tắc

Vitamin C(axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật Trong phân tửascorbic chứa nhóm dienol (-COH=COH-) có tính khử mạnh vitamin C dễ bị oxy hóathành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch

Dựa trên tính khử mạnh của acid ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt phươngpháp hóa học để định lượng nó.Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và hay dùng nhất

là phương pháp cho acid ascorbic khử muối natri của 2,6 diclophenolindophenol

Xác định vitamin C dựa trên nguyên tắc: vitamin C được chiết ra khỏi lương thực,thực phẩm bằng acid acetic hoặc acid clohydric Sau đó chuẩn độ nước chiết trong môitrường axit (pH=3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra lượng vitamin C

3.2 Phương thức thực hiện

• Chuẩn bị mẫu thử

• Lượng cân sản phẩm lấy tùy thuộc vào hàm lượng vitamin C của nó

• Có thể dùng acid oxalic 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức, hoặc dùngacetat chì 5%(5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố

• Dùng pipet hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin C, thêm5ml dung dịch oxalat amoni bão hòa, 10ml nước cất và định phân bằng dungdịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburet cho tới xuất hiện màu hồngbền (không mất màu trong 1 phút )

4 Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang

4.1 Nguyên tắc

Vitamin B1 (thiamin) có công thức cấu tạo như sau:

Vitamin B1 bền trong môi trường axit, ở pH = 3 nó không bị phân hủy khi đun nóngtới 120 0C Thiamin dễ tan trong trong nước, trong rượu etylic loãng, rượu metylic,trong axit axetic và không tan trong cloroform, rượu butylic, isobutylic, isoamylic ete