Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm

Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

LỜI CẢM ƠN 2

3 Đối tượng nghiên cứu 4

Hình1 Mẫu nấm 660 5

Hình 2 Mẫu nấm 661 5

3.5.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 29

3.5.3.3 Phân loại 30

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: 30

Bình đựng dung môi 31

Bộ khử khí Degasse 32

Bơm (Pump) 32

Bộ phận tiêm mẫu (injection) 32

Cột sắc ký 32

Đầu dò (Detector) 33

Bộ phận ghi tín hiệu 34

In kết quả 34

3.5.3.6 Cách đo HPLC 34

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 Kết luận 52

4.2.Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa, Trường Đại

học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện, hướng dẫn cách pha hóa chất và cách sử dụng máy HPLC

Đề tài được hoàn thành nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thư hợp tác

Việt Nam - Đài Loan của PGS.TS Trần Đình Thắng - khoa Hóa học, trường Đại Học

Vinh

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong khoa Hoá, trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức vững vàng trước khi bước vào đời

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè – đặc biệt là các bạn trong cùng nhóm đồ án thầy Trung hướng dẫn đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Vinh, ngày tháng năm 2012

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Khánh Hòa

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài.

Ngày nay các sản phẩm được chế xuất từ thực vật, thảo dược được đánh giá cao và được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều Ngoài công dụng tốt cho sức khỏe con người, giúp phòng chống bệnh tật ….thì các sản phẩm hầu như không có tác dụng phụ ảnh hưởng về sau Một trong các đề tài được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu đưa vào ứng dụng trong thực tế là sản phẩm của các loài nấm Hiện nay nấm trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của người dân, bên cạnh mùi vị thơm ngon, dễ chế biến và giàu dinh dưỡng, nấm còn được xem như là một loài “rau sạch” và có giá trị dược liệu Trong số đó có một số loài đã được biết rõ về thành phần dinh dưỡng Tuy nhiên một số loài còn lại thành phần này vẫn chưa được công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino axit Vì thế, việc xác định thành phần amino axit trên nấm đối với Việt Nam là điều cần thiết, góp phần phục vụ cho việc khảo sát nguồn thực phẩm giàu axit amin ở Việt Nam

Việc xác định amino axit đã được thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau như: sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng… Phân tích amino axit trên các công cụ truyền thống này đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp Ngày nay với sự phát triển của kĩ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino axit trong mẫu sinh hóa đã được đơn giản hơn rất nhiều bởi hầu hết các công cụ đã được tự động hóa và được nối trực tiếp bộ phận xử lí số liệu Hiện nay trên thị trường đang tồn tại rất nhiều kĩ thuật phân tích như sắc kí lỏng cao áp HPLC, sắc kí trao đổi ion … Trong đó HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký Với những tiến bộ kỷ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Xác định hàm lượng axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng sắc ký lỏng HPLC ”.

2 Nhiệm vụ đồ án.

Trong khóa luận này, tôi có các nhiệm vụ sau:

- Nghiên cứu tổng quan về Nấm, giá trị và thành phần dinh dưỡng của Nấm

- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và các phương pháp xác định các loại protein và axitamin

- Tách và xác định đồng thời các loại axitamin bằng phương pháp HPLC

- Kiểm tra, đánh giá phương pháp và các điều kiện phân tích với quá trình thực hiện và kết quả thu được

- Xử lý kết quả và một số đề xuất kiến nghị

Tôi hy vọng rằng luận văn sẽ góp phần bổ sung, hoàn thiện số liệu của bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng

về Nấm

3 Đối tượng nghiên cứu.

Mẫu nấm được thu thập từ các rừng ở địa bàn Bắc Trung Bộ Mỗi mẫu được lấy 50g, đựng vào túi nilông sạch Bao gồm các họ nấm:

- Coriolaceae

- Ganodermataceae

- Lentinaceae

1.1 Giới thiệu về giới nấm.

Nấm là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả được 69.000 loài (theo Hawksworth,1991), sống khắp nơi trên Trái đất từ hốc tường đến thực vật, động vật, con người; bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn

Ban đầu nấm được xếp vào giới thực vật Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một

giới riêng, gọi là giới nấm Sở dĩ nấm được xếp vào giới riêng mà không được xếp vào giới thực vật hay động vật vì nấm có nhiều điểm khác thực vật như:

- Không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp nên không thể tự tổng hợp các chất hữu cơ cho cơ thể từ các cơ thể khác như thực vật, động vật

- Không có sự phân hoá cơ quan thành thân, rễ, lá, hoa

- Phần lớn không có chứa cenllulose trong vách tế bào, mà chủ yếu là bằng chitin

và glucan Chitin là chất gặp nhiều ở động vật hơn thực vật, chủ yếu ở nhóm giáp xác và côn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các loài này

- Nấm dự trữ đường dưới dạng glycogen thay vì tinh bột như ở thực vật

- Nấm cũng không có một chu trình phát triển chung như các loài thực vật

Nấm cũng không được xếp vào giới động vật vì:

- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu tính hay vô tính) giống hạt phấn của thực vật

- Sự sinh dưỡng của nấm liên quan đến hệ sợi nấm Nấm lấy các chất dinh dưỡng thông qua màng tế bào của sợi nấm (tương tự như cơ chế ở rễ thực vật)

1.2 Phân loại nấm

Giới Nấm được chia làm 4 giới phụ: Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida; giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida; giới phụ Restomycetoida và giới phụ Nấm thật - Eumycetoida

 Giới phụ Nấm nhầy – Gymnomycetoida

Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida có đặc điểm cơ thể là một khối chất nguyên sinh lớn, dạng cộng bào, có màu vàng hoặc màu hồng, kích thước có thể tới vài

dm, di chuyển giống như di chuyển của amíp Nấm nhầy phân bố ở những nơi ẩm thấp, tối tăm (như hốc cây mục, vỏ cây )

 Giới phụ Nấm tảo – Phycomycetoida

Giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida có đặc điểm là giai đoạn dinh dưỡng dạng sợi không có vách ngăn, sống bám và chỉ hình thành vách ngăn khi tạo nên cơ quan sinh sản.

1.3 Các đặc điểm sinh học của nấm

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào

Cơ thể của nấm là một tản, tức là một cơ thể có bộ máy sinh dưỡng chưa phân hoá thành các cơ quan khác nhau

Hình 1: Cấu trúc tế bào nấm 1.3.2 Đặc điểm về dinh dưỡng: Có 3 nhóm chính

 Hoại sinh:

Là đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm trồng Thức ăn của chúng là xác bã thực vật hoặc động vật Chúng có khả năng biến đổi các chất này thành những thành phần đơn giản để có thể hấp thụ được.

 Ký sinh:

Bao gồm chủ yếu các loài nấm gây bệnh Chúng sống bám vào cơ thể các sinh vật khác (động vật, thực vật hoặc các loài nấm khác) Thức ăn của chúng cũng chính là các chất lấy từ cơ thể kí chủ và do đó làm suy yếu hoặc tổn thương cơ thể kí chủ

 Cộng sinh:

Đây là nhóm nấm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ và ngược lại chúng sẽ cung cấp các chất khác cho cơ thể chủ Đây là một hình thức quan hệ qua lại rất chặt chẽ và

có lợi giữa nhiều nhóm sinh vật, hỗ trợ cho nhau cùng phát triển

1.4 Thành phần dinh dưỡng của nấm.

Nấm được xem là một loại rau nhưng là loại rau cao cấp Nếu xét về hàm lượng đạm có thấp hơn thịt cá nhưng lại cao hơn bất kì một loại rau quả nào khác

Đặc biệt có sự hiện diện gần như đầy đủ các loại axit amin không thay thế, trong đó có 9 loại axit amin cần thiết cho con người Nấm rất giàu leusin và lysin là hai loại axit amin có ít trong ngũ cốc, do đó xét về chất lượng thì đạm ở nấm không thua gì đạm của động vật Việc bổ sung đạm trong nguyên liệu trồng nấm có thể làm biến đổi lượng axit amin nhưng gần như không thay đổi lượng đạm trong nấm

Nấm chứa ít chất đường và hàm lượng thay đổi từ 3-28% trọng lượng tươi, ở nấm rơm lượng đường tăng lên trong giai đoạn từ dạng nút sang dạng kéo dài nhưng lại giảm khi trưởng thành Đặc biệt nấm có nguồn đường dự trữ dưới dạng glucogen tương tự như động vật (thay vì tinh bột ở thực vật)

Nấm chứa rất nhiều loại sinh tố (vitamin) như sinh tố B,C,K,A,D,E trong đó nhiều nhất là sinh tố B như B1, B2, axit nicotinic, axit pantothenic Nếu so với rau rất nghèo sinh tố B12 thì chỉ cần ăn 3g nấm tươi đã đủ cung cấp lượng sinh tố B12 cho nhu cầu mỗi ngày

Tương tự như hầu hết các loài rau cải, nấm là nguồn khoáng rất tốt Nấm được ghi nhận là giàu K, Ca và Mg chúng chiếm từ 56- 70% lượng tro tổng cộng Phosphat

và sắt thường hiện diện ở phiến và nhủ nấm Ở quả thể trưởng thành thì lượng Na và P giảm trong khi K,Ca và Mg giữ nguyên,ăn nấm bảo đảm bổ sung đầy đủ cho nhu cầu

về khoáng mỗi ngày

Như vậy ngoài việc cung cấp đạm và đường nấm còn ghóp phần bồi bổ cơ thể nhờ vào sự dồi dào về khoáng và sinh tố

- Kháng ung thư và kháng virus: Trên thực nghiệm, hầu hết các loại nấm ăn đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Với nấm hương, nấm linh chi

và nấm trư linh, tác dụng này đã được khảo sát và khẳng định trên lâm sàng Nhiều loại nấm ăn có công năng kích thích cơ thể sản sinh interferon, nhờ đó ức chế được quá trình sinh trưởng và lưu chuyển của virut

- Dự phòng và trị liệu các bệnh tim mạch: Nấm ăn có tác dụng điều tiết công năng tim mạch, làm tăng lưu lượng máu động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim Các loại nấm như ngân nhĩ (mộc nhĩ trắng), mộc nhĩ đen, nấm đầu khỉ, nấm hương, đông trùng hạ thảo… đều có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu, làm hạ lượng cholesterol, triglycerid và beta-lipoprotein trong huyết thanh Ngoài ra, nấm linh chi, nấm mỡ, nấm rơm, nấm kim châm, ngân nhĩ, mộc nhĩ đen còn có tác dụng làm hạ huyết áp

- Giải độc và bảo vệ tế bào gan: Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại nấm

ăn có tác dụng giải độc và bảo vệ tế bào gan rất tốt Ví như nấm hương và nấm linh chi

có khả năng làm giảm thiểu tác hại đối với tế bào gan của các chất như carbon tetrachlorid, thioacetamide và prednisone, làm tăng hàm lượng glucogen trong gan và

hạ thấp men gan Nấm bạch linh và trư linh có tác dụng lợi niệu, kiện tỳ, an thần, thường được dùng trong những đơn thuốc Đông dược điều trị viêm gan cấp tính

- Kiện tỳ dưỡng vị: Nấm đầu khỉ có khả năng lợi tạng phủ, trợ tiêu hóa, có tác dụng rõ rệt trong trị liệu các chứng bệnh như chán ăn, rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ dày tá tràng Nấm bình có tác dụng ích khí sát trùng, phòng chống viêm gan, viêm loét

dạ dày tá tràng, sỏi mật Nấm kim châm và nấm kim phúc chứa nhiều arginine, có công dụng phòng chống viêm gan và loét dạ dày

- Hạ đường máu và chống phóng xạ: Khá nhiều loại nấm ăn có tác dụng làm hạ đường máu như ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo, nấm linh chi… Cơ chế làm giảm đường huyết của đông trùng hạ thảo là kích thích tuyến tụy bài tiết insulin Ngoài công dụng điều chỉnh đường máu, các polysaccharide B và C trong nấm linh chi còn có tác dụng chống phóng xạ

- Thanh trừ các gốc tự do và chống lão hóa: Gốc tự do là các sản phẩm có hại của quá trình chuyển hóa tế bào Nhiều loại nấm ăn như nấm linh chi, mộc nhĩ đen, ngân nhĩ… có tác dụng thanh trừ các sản phẩm này, làm giảm chất mỡ trong cơ thể, từ

đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ

Ngoài ra, nhiều loại nấm ăn còn có tác dụng an thần, trấn tĩnh, rất có lợi cho việc điều chỉnh hoạt động của hệ thần kinh trung ương Gần đây, nhiều nhà khoa học còn phát hiện thấy một số loại nấm ăn có tác dụng phòng chống AIDS ở mức độ nhất định, thông qua khả năng nâng cao năng lực miễn dịch của cơ thể

2 Tổng quan về Protein và axitamin.

2.1 Định nghĩa và phân loại protein

Protein là polyme sinh học của L-α - axitamin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit

Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hoá học vẫ chưa được làm

rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hoá học của chúng, mà chia ra thành hai loại là protein đơn giản và protein phức tạp

 Protein đơn giản: được tạo thành chỉ từ các α-amino axit , polypeptid gồm hai hay vài chục amino acid liên kết với nhau

 Protein phức tạp: được tạo thành từ các protein đơn giản kết hợp với các phân tử không phải protein (phi protein) như axit nucleic, lipit, cacbohiđrat…

Nếu dựa vào tính chất lý hoá, protein còn có thể được chia thành 7 loại là anbumin, globulin, prolamin, histon, protamin và scleroprotein

Về mặt dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chia protein thức ăn ra thành: Protein hoàn toàn, protein nửa hoàn toàn, protein không hoàn toàn

2.2 Cấu tạo phân tử protein

2.2.1 Thành phần nguyên tố của protein.

Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N Một số còn chứa một lượng nhỏ S Tỷ lệ % khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau:

2.2.2 Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein – axit amin.

Tuy protein rất đa dạng về cấu trúc và đảm nhận nhiều chức năng như vậy song hầu như đều xây dựng nên các đại phân tử của mình chủ yếu từ 20 L-α- axitamin bằng liên kết peptit Do vậy, cũng có thể xem các axitamin này là sản phẩm cuối cùng của

sự thuỷ phân peptit và protein

Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử

có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH)

Các axit amin thường gặp trong các protein (trong tự nhiên) là những L-αaxitamin có nhóm amin dính vào nguyên tử cacbon α đứng cạnh nhóm cacboxyl.

-Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:

R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau ở mạch R

Đa số các protein được cấu tạo từ 20 L-α - axitamin và 2 amit tương ứng.

2.2.2.1 Phân loại axitamin

- Dựa vào khả năng tổng hợp protein trong cơ thể, người ta chia axitamin làm hai loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu

Acid amin thiết yếu

- Hoàn toàn phụ thuộc vào sự cung cấp

từ thức ăn bên ngoài đưa vào cơ thể

- Có 10 loại acid amin thiết yếu:

Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin,

Phenillalanin, Threonin, Tryptophan và

Valin

- Cơ thể có thể tổng hợp chúng với số lượng đầy đủ từ các phân tử khác trong cơ thể

- Không bắt buộc hiện diện trong chế độ

ăn

- Các loại acid amin không thiết yếu : Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin, Cystein, Cystin

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm Một trong các cách phân loại là 20 axit amin được phân thành 5 nhóm như sau:

Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6

axit amin : Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)

Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin :

Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)

Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3

axit amin : Lys (K), Arg (R), His (H)

Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có

6 axit amin : Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)

Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit amin : Asp (D), Glu (E)

Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl – COOH

và nhóm amin – NH2 đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí α , còn khác nhau ở cấu tạo mạch bên R

2.2.2.2 Peptid

Là những phân tử sinh học cấu tạo từ một cho tới vài chục axit amin.Peptid tạo thành từ những axit amin thông qua phản ứng nối đầu – NH2 của phân tử này với đầu – COOH của phân tử kia tạo nên liên kết peptid

Ngoài liên kết peptid, đôi khi giữa các axit amin xìn có liên kết disunfua nối 2 gốc xystein với nhau Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúc không gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh học quan trọng như hocmon, immunoglobulin và kháng thể

Các peptid bị thủy phân hoàn toàn bởi dung dịch HCL 6M ở 110oC trong 24h, hoặc bởi dung dịch kiềm để cho các axit amin tự do

Liên kết peptid còn bị thủy phân bởi enzym proteazơ Chúng có mặt ở tất cả các

tế bào và mô tế bào để thực hiện nhiệm vụ chủ yếu là phân giải protein

2.3 Cấu trúc phân tử protein

2.3.1 Cấu trúc bậc một của protein

Cấu trúc bậc 1 của protein là sự liên kết giữa các axit amin với nhau thành chuỗi thông qua liên kết peptit (-CO - NH-), Mạch liên kết này hình thành giữa nhóm COOH của axit amin trước với nhóm NH2 của axit amin bên cạnh

2.3.2 Cấu trúc bậc hai của protein

Cấu trúc bậc 2 của protein là cấu trúc có chu kỳ của chuỗi polypeptit Chuỗi polypeptit được sắp xếp gọn lại trong không gian nhất là trong môi trường sinh vật, trong mô bào theo những hình thù nhất định, bền vững hơn phù hợp với chức năng của chúng

Trong cơ thể, xét về cấu trúc bậc 2, protein có thể chia ra làm 3 loại:

- Loại hoàn toàn cấu tạo từ xoắn α

- Loại hoàn toàn cấu tạo từ gấp nếp β

- Loại chứa cả xoắn α và gấp nếp β

2.3.3 Cấu trúc bậc ba của protein

Là cấu hình không gian phức tạp của chuỗi polypeptit do sự gấp khúc, cuộn lại của cấu trúc bậc 2 tạo cho protein có hình thù nhất định đặc trưng cho từng loại protein

và hình thù đặc trưng này được quyết định từ cấu trúc bậc 1 Sự sắp xếp gọn lại trong không gian của phân tử protein khi đã có cấu trúc bậc 2 này giúp cho phân tử protein

ổn định trong môi trường sống

2.3.4 Cấu trúc bậc bốn của protein

Các protein chứa trong phân tử từ 2 chuỗi polypeptit trở lên thể hiện sự phức tạp hơn về mức độ cấu trúc phân tử được gọi là cấu trúc bậc 4 Protein có trạng thái tổ hợp hình thành từ nhiều tiểu phần protein gọi là protein olygomeric Mỗi chuỗi polypeptit trong một protein như vậy được gọi là là tiểu đơn vị (sub unit) hay là một protomer Mỗi tiểu đơn vị đều có cấu trúc bậc 1, 2, 3 riêng của nó

2.4 Một số tính chất hóa lý của protein và axit amin.

2.4.1 Tính chất biến tính.

Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cài, áp suất lớn hoặc các tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay axit), ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+,… làm cho cấu trúc bậc 2,3,4 bị phá hủy cón cấu trúc bậc 1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng protein bị biến tính

Tính chất của protein sau khi bị biến tính như sau:

 Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các

đó là điểm đẳng điện của axit amin

Như vậy, protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axit amin

2.4.3 Tính kị nước:

Dựa vào độ kỵ nước trung bình của một protein có thể biết trước được mức độ đắng của dịch thủy phân (hydrolyzat) từ protein đó, hoặc biết trước được vị trí của một protein màng nào đó là ở trong hay ngoài màng phospholipit

2.5 Tính chất hóa học của protein và axit amin.

Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polypeptid nên ta có thể chia thành các nhóm phản ứng sau:

- Phản ứng của nhóm liên kết peptid.

- Phản ứng thủy phân bởi enzym

- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axit amin trong phân tử

- Phản ứng của nhóm α - amin tự do của chuỗi polypeptid.

Phản ứng Biure:

Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, tất cả các chất có chứa từ hai liên kết peptid trở lên đều cho phản ứng này (axit amin và dipeptid đều không có phản ứng này) Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc tím đỏ

Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng protein Độ nhạy của phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử Folin – ciocalteau

Phản ứng với thuốc thử Folin – ciocalteau:

Thuốc thử Folin – ciocalteau có chứa axit phosphomolipdic và axit phosphovolframic Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein Các gốc axit amin mày tham gia trong quá trình tạo phức chất màu Phức được tạo thành có màu xanh da trời, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong một giới hạn nhất định và có thể đo được bằng máy đo quang và dựa vào đường chuẩn ta có thể xác định được hàm lượng của protein thành phần

Phản ứng thủy phân với enzym:

Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành axit amin và mỗi phản ứng cần một enzym đặc hiệu cho phản ứng đó

Phản ứng với ninhidrin:

Phản ứng màu đặc trưng và quan trọng để định tính và định lượng axit amin.Tất cả các α - axit amin của protein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng aminoaxit như prolin tạo thành màu vàng Phản ứng này rất

nhạy, có thể phát hiện đến ppm, vì vậy được dùng nhiều trong phân tích định tính và định lượng axit amin Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất

Phản ứng của nhóm α - axit amin với formaldehit:

Đây là phản ứng quan trọng thường dùng để đánh giá mức độ thủy phân protein Formaldehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metilen của axit amin theo phản ứng sau:

Phương pháp xác định nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp đinh lượng nitơ formol

Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất khác như sau:

• Axit amin có khả năng kết tinh

• Bền với nhiệt độ khoảng 1000C đến 2000C trong 2 giờ

• Khá bền trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm (trong môi trường axit chỉ có trytophan bị phá hủy)

• Tính chất đồng phân quang học

• Tất cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)

• Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L – axit amin (chỉ ở dạng này thì các axit amin mới có giá tị dinh dưỡng cho con người và động vật)

2.6 Chức năng, vai trò của protein và axit amin.

2.6.1 Chức năng của protein.

Protein là nền tảng của mọi quá trình sống, điều này được thể hiện ở các chức năng của nó đối với sự sống, cụ thể như sau:

 Chức năng tạo hình

Protein là thành phần cấu tạo của các tế bào kể từ siêu vi khuẩn đến tế bào có nhân, các mô và dịch sinh vật Nhờ chức năng tạo hình của protein mà sinh vật có hình dáng ổn định đặc trưng, đặc biệt trong các cấu trúc nâng đỡ

 Chức năng xúc tác sinh học

Hầu hết các quá trình trao đổi chất đặc trưng đối với cơ thể sống đều tiến hành dưới sự xúc tác bởi những chất có hoạt tính sinh học đặc biệt đó là các enzym có bản chất là protein

 Chức năng điều hòa chuyển hóa:

Một số peptit hoặc protein có khả năng tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động của enzym,tham gia điều hòa tốc độ và sự cân bằng các quá trình sinh học trong cơ thể

 Chức năng vận chuyển các chất:

Nnhiều phân tử nhỏ và các ion được vận chuyển bởi các protein đặc hiệu

 Protein có vai trò trong việc co duỗi, vận động

Protein là thành phần chủ yếu của cơ Sự co cơ được thực hiện bởi chuyển động trượt của 2 loại protein sợi: actin và miosin

 Chức năng bảo vệ:

Cơ thể sống có khả năng tổng hợp những protein đặc hiệu, biệt hóa cao gọi là các kháng thể, chúng có khả năng nhận biết và kết hợp với các yếu tố ngoại lai (các kháng nguyên) như các vi rút, vi khuẩn, độc tố vi khuẩn, trombin, fibrin là các yếu tố đông máu, một số protein chống đông

 Chức năng dẫn truyền thông tin

Protein là chất thụ cảm của hocmon và các phân tử báo hiệu khác

 Chức năng cung cấp năng lượng và dự trữ

Sự chuyển hóa của một bộ khung cacbon của axit amin trong chu trình Krebs cũng đóng góp một phần năng lượng cho cơ thể

2.6.2 Vai trò của axit amin.

Axitamin là cấu tử cơ bản của protein, hay nói một cách khác, axitamin là

những “viên gạch” để xây nên “các toà lâu đài muôn hình vẽ” của phân tử protein Vai trò cụ thể của một số axit amin như sau :

 PHENYLALANINE: Có chức năng bồi bổ cho não, tăng cường trí nhớ, tác

động trực tiếp đến não bộ, tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da

 LEUCINE: Rất quan trọng trong quá trình điều chỉnh hàm lượng đường

trong máu; tốt cho bệnh nhân mắc chứng “hyperglycemia” hoặc những người mong muốn đốt cháy chất béo nhanh chóng Hơn nữa, loại acid amin này còn có chức năng

duy trì lượng hormone tăng trưởng để thúc đẩy quá trình phát triển mô cơ

 ISOLEUCINE: Đóng vai trò sống còn trong quá trình phục hồi sức khỏe sau

thời gian luyện tập thể dục thể thao Đồng thời giúp điều tiết lượng đường glucose

trong máu, hỗ trợ quá trình hình thành hemoglobin và đông máu

 THREONINE: Chức năng chính là hỗ trợ hình thành collagen và elastin -

hai chất liên kết các tế bào trong cơ thể Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất

 VALINE: Loại acid amin này chữa lành tế bào cơ và hình thành tế bào mới,

đồng thời giúp cân bằng nitơ cần thiết Ngoài ra, nó còn phân hủy đường glucose trong

cơ thể

 TRYPTOPHAN: Có hai chức năng quan trọng, một là được gan chuyển hóa

thành niacin (vitamin B3), hai là cung cấp tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ và tâm trạng

 METHIONINE: chứa lưu huỳnh có tác dụng bảo vệ đặc hiệu tế bào gan,

chống nhiễm độc Methionine còn được dùng như một yếu tố ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ

2.7 Lượng nhu cầu của các axit amin cần thiết đối với con người.

Bảng 1: Trị số ước lượng về đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày):

1 tuổi tuổi tuổi

Bảng 2: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu:

thiết yếu ở người lớn Hàm lượng

20 – 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức ăn từ thực vật; các loại quả cứng như hồ đào, hạt sen… cũng chứa 15 – 30% protein; hạt cố các loại thường chỉ chứa 6 – 10% protein; khoai lang chiếm 2 – 3%.

Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều

về số lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao Thực phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô, các loại đậu khác ) là nguồn protein quan trọng Hàm lượng axit amin cần thiết cao trong đậu tương còn cácloại khác thì hàm lượng axit amin cần thiết không cao, tỉ lệ các axit amin kém cân đối hơn so với nhu cầu cơ thể Nhưng việc có sẵn trong thiên nhiên một khối lượng lớn với giá rẻ nên protein thực vật có vai trò quan trọng đối với khẩu phần ăn của con người

2.8.2 Protein và axit amin trong trong nấm.

Nấm được xem là một loại rau nhưng là loại rau cao cấp Nếu xét về hàm lượng đạm có thấp hơn thịt cá nhưng lại cao hơn bất kì một loại rau quả nào khác

Đặc biệt có sự hiện diện gần như đầy đủ các loại axit amin không thay thế Nấm rất giàu leusin và lysin là hai loại axit amin có ít trong ngũ cốc, do đó xét về chất lượng

thì đạm ở nấm không thua gì đạm của động vật Việc bổ sung đạm trong nguyên liệu trồng nấm có thể làm biến đổi lượng axit amin nhưng gần như không thay đổi lượng đạm trong nấm.

3 Tổng quan về phương pháp định lượng protein và axit amin

Các phương pháp thông thường chủ yếu dựa vào sự có mặt của nitơ trong phân

tử axit amin Vì khối lượng phân tử của các axit amin khác nhau nên kết quả thường biểu thị bằng nitơ axit amin

3.1 Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl

Phương pháp định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl đơn giản

và dễ thực hiện

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein Nitơ không có trong thành phần của protein như các muối vô cơ, axit nitric, các amin tự do, các peptit, urê

và các dẫn suất của urê, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimidin… là nitơ phi protein…

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

Để định lượng nitơ protein người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhân với hệ số tương ứng

3.1.1 Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

O H SO

H2 4 2 2

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ như các protein bị thủy phân thành

các axit amin, cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.

Từ số ml axit dùng để chuẩn độ tính ra được nitơ toàn phần trong mẫu thử

3.1.2 Xác định nitơ phi protein

Để xác định nitơ phi protein cần dùng dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%) Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tan trong quá trình chiết rút Sau khi đã loại bỏ kết tủa dịch lọc chỉ còn dạng nitơ phi protein Đem vô cơ hóa dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl

3.1.3 Định lượng protein trong nguyên liệu

Nitơ tổng số bao gồm nitơ phi protein và nitơ protein Muốn xác định hàm lượng nitơ trong nguyên liệu cần xác định nitơ phi protein và nitơ tổng số

Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau:

Protein (mg) = (N tổng số - N phi protein ) 6,25

Hoặc

Protein (mg) = (N tổng số - N phi protein ) 5,95

3.2 Định lượng protein hòa tan:

Phương pháp định lượng protein hòa tan dựa vào việc tách và kết tủa protein ra khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa protein bằng phương pháp Kjeldahl.

3.2.1 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường

 Phương pháp Stutzer-Barnstein

Chiết protein từ thực phẩm bằng cách đun sôi với nước Kết tủa protein bằng CuSO4 trong môi trường kiềm Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết tủa bằng nước cất Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjedahl

 Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald)

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi Kết tủa protein bằng axit tricloacatic để qua đêm Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sach kết tủa bằng axit tricloacetic loãng Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjendahl

 Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes)

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi Kết tủa protein bằng tananh Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết tủa bằng nước cất Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjendahl

 Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit

Kết tủa protein bằng dung dịch ntrisulfat bão hòa và cồn 78oC ở trong môi trường axit Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp Kjedahn nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ đi nitơ phi protein

3.2.2 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu

Trong môi trường kiềm protein kết hợp với Cu2+ thành phức chất màu tím (phản ứng Biure)

Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin Dựa vào việc

so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra khỏi thực phẩm bằng máy quang kế ở bước sóng λ= 550 nm tính được hàm lượng protein hòa tan trong thực phẩm

3.3 Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin

Mẫu thực phẩm được trộn trực tiếp với men pepsin trong một cốc thủy tinh, ủ trong tủ ấm 37 – 400C trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc Lọc lấy phần không hòa tan loại protein không tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hóa tan bằng phương pháp Kjeldahl Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu nitơ toàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan

3.4 Định lượng nitơ axit amin bằng phương pháp chuẩn độ

3.4.1 Định lượng nitơ formol (hóa sinh học)

Axit amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và cacboxyl trung hòa lẫn nhau Nhóm –COO- của axit amin bị cản trở bởi nhóm amin nên không thể chuẩn độ trực tiếp được Trong formandehit, nhóm amin của axit amin phản ứng với nhóm andehit cho metylen Kết quả của phản ứng là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ

Số nhóm cacboxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với fomandehit, khi chuẩn

độ nhóm cacboxyl thì xác định được nhóm amin Vì vậy cho phép định lượng được axit amin có trong dung dịch nghiên cứu

3.4.2 Định lượng nitơ axit amin bằng Iốt

Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axit amin phản ứng với muối đồng tạo thành một phức chất “axit amin – đồng” hòa tan, theo phản ứng:

Định lượng Cu2+ trong phức chất keo theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng Iốt.

Định lượng Cu2+ trong phức theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng Iốt

2Cu2+ + 4KI → 2CuI + I2

I2 + Na2S2O3 → Na2S4O6 + 2NaI

Từ đó tính được hàm lượng axit amin trong mẫu thử

3.4.3 Định lượng axit amin theo phương pháp Van Slyke

Axit amin trong môi trường axit nitric sẽ tạo ra khí N2 ở thể tự do theo phản ứng

Khí N2 giải phóng một nửa là từ axit amin, một nửa từ axit nitric Xác định thể tích N2 ở điều kiện nhiệt độ và áp suất, tra bảng tính sẵn, sẽ có trọng lượng nitơ từ đó tính ra hàm lượng nito axit amin có trong mẫu thử

3.5 Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin

Nhược điểm của các phương pháp xác định axit amin và protein đã đề cập ở trên chỉ là xác định được tổng số nitơ mà không thể xác định được riêng rẽ từng axit amin Để khắc phục nhược điểm này thì phải tách từng chất nhóm axit amin trước khi xác định chúng Điều này ngoài việc xác định được từng axit amin riêng biệt còn tránh được sự ảnh hưởng của các nitơ khác đến việc xác định axit amin Có nhiều phương pháp để định lượng axit amin, mỗi phương pháp có độ nhạy và khả năng phân tích khác nhau Phần lớn các phương pháp phân tích định lượng riêng biệt từng axit amin dựa trên việc tách axit amin thành dạng tự do bằng sắc ký trao đổi ion sau đó phát hiện bằng dẫn suất trước cột hoặc sau cột

và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do

sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho việc phân tích lượng lớn

Phương pháp sắc ký cột với dẫn suất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axit amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn suất bằng OPA tạo phức chất

có tính phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ 450nm Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit amin bậc

1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phát hiện được các axit amin bậc 2

Phương pháp sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được phép áp dụng trong cac đối tượng tách đơn giản

3.5.1.3 Phương pháp chuẩn độ điện thế

Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách axit amin ra khỏi nền mẫu là loại các chất ảnh hưởng, các axit amin sẽ được tách trên cột sắc ký: 500 – 22

mm, 30ml, Dowex 50W –X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách

Từ lượng NaOH 0.1M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mẫu trắng tính được hàm lượng các axit amin bằng bẳng quy đổi

3.5.2 Phương pháp sắc ký khí

Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát triển trong những năm gần đây, sử dụng để phân tích định tính và định lượng các chất hữu

cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp

GC dựa trên nguyên tắc: khi một hỗn hợp các chất bay hơi được khí mang (pha động) vận chuyển qua cột chứa một chất hấp phụ rắn hoặc thông thường hơn là qua một pha lỏng hấp phụ lên một chất rắn (pha tĩnh), mỗi thành phần hơi đó được phân bố trong khí mang và chất rắn hoặc chất lỏng

Tùy theo thời gian lưu, mỗi thành phần hơi sẽ thoát ra khỏi cột sắc ký ở các thời gian khác nhau và được xác định bởi detector thích hợp, có thể xác định định tính cũng như định lượng

Ưu điểm của phương pháp là có khả năng phân tách rất cao, ngay cả đối với những hỗn hợp phức tạp; Độ nhạy, độ chính xác và độ tin cậy rất cao; Thời gian phân tích ngắn, có thể phân tích hàng loạt

3.5.3 P hương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.5.3.1 Cơ sở lý thuyết.

HPLC là viết tắc của 4 chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng

cao áp (high pressure liquid chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi

bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin Sau khi thủy phân các axit amin sẽ được dẫn suất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang Các dẫn suất này được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detecter UV và detecter huỳnh quang

Ưu điểm của phương pháp HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn suất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô cơ không tốn kém Chính vì những

ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin

3.5.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần

có một pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3

Chất phân tích A + B + C F1 F2

Pha tĩnh F3 Pha động