3. Đối tượng nghiên cứu
3.5.3.3 Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). • Sắc ký phân bố (partition chromatography).
• Sắc ký ion (ion chromatography).
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực. - Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
3.5.3.4. Cấu tạo của hệ thống HPLC
Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:
• Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích. • Phần tách: phần trung gian của hệ sắc ký, gốm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ. • Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detecter, phần khuếch tán, computer và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Trong đó:
1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4- Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)
5- Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt) 6- Detector (nhận tín hiệu)
7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu.
Bình đựng dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp. Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định.
1 2 3 5 6 7 8 4
Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn.
Bộ khử khí Degasse
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động.
Bơm (Pump)
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến 500 at (1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar).
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút.
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
Bộ phận tiêm mẫu (injection)
Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động(Autosample).
Cột sắc ký
Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường. Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất. Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10- 30cm, đường kính trong 1-10mm.
Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
Đầu dò (Detector)
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A = k.C Trong đó: A: là tín hiệu đo được
C : Nồng độ chất phân tích
K : là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:
- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV.
- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.
- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang và là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất.
- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là:
- Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường).
- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…
Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang.
Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao…
Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD...
In kết quả
Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện.
3.5.3.5. Các đại lượng đặc trưng của HPLC
- Thời gian lưu
- Hệ số phân bố
- Thừa số dung lượng K’
- Sự loãng pic và hình dáng pic
- Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết
- Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc.
3.5.3.6. Cách đo HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: Cấu hình máy, tỷ lệ các dung môi pha động, bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. Thiết bị.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. - Cân phân tích độ chính xác 0,0001g. - Tủ sấy có thể đặt nhiệt độ lên 2800C. - Máy cất quay chân không.
- Máy đo pH. - Máy nghiền mẫu.
- Máy lắc Vortex.
2. Dụng cụ.
- Pipet 0.5, 1, 2, 5 ,10 ml
- Ống nghiệm có nắp xoáy chịu nhiệt đến 2800C. - Vial (lọ đựng mẫu 1,5 ml có nắp) - Các bình định mức: 2, 5, 10, 20, 50, 100 ml - Các cốc 25, 50, 250, 500, 1000 ml - Ống đong 50, 100, 200, 250 ml - Giấy lọc - Thang đo pH 3. Hoá chất.
- Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại tinh khiết
- Dung dịch chuẩn: amino acid nồng độ 25pmol/µl, 100pmol/µ l, 250pmol/µl,
1000pmol/µl
- Chất tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd (OPA) and 3 – mercaptopropionic acid in borate bufer
- Dung dịch axit acetic 1 – 2%
- Sodium acetate trihydrate NaCH3COO - Dung dịch HCl đặc
- Borate buffer 0.4N in water, pH = 10,2
- FMOC reagent ( 9- fluorenylmethylchloro for mate in acetonitrile) - Dung dịch acid clohydic HCl đậm đặc.
4.1. Chất tạo dẫn xuất.
Để xác định được một số axit amin trong thực phẩm dựa trên những điều kiện cơ sở phòng thí nghiệm tôi đã tiến hành dẫn xuất trước cột các axit amin bằng dẫn suất OPA. Cơ chế phản ứng như sau:
Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2 trong sự hiện diện của hợp chất thiol để tạo thành isoindolo nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindolo có vòng kín 5 cạnh và phát huỳnh quang. Xác định axit amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có mặt của axit 3-mercapto proionic (3-MPA)- có tác dung thay thế hợp chất thiol, cơ chế:
Để xác định được axit amin bậc 2 ta cần sử dụng thêm dẫn suất FMOC:
Để chọn thời gian thủy phân các axit amin có hiệu suất cao, tôi tiến hành thí nghiệm ở 5 thời gian khác nhau: 10 giờ, 14 giờ, 18 giờ, 22 giờ, 24 giờ. Tiến hành thủy phân song song một dãy mẫu thực và một dãy mẫu thực có thêm 50µl chất chuẩn axit amin nồng độ 25
ppm.
4.3. Chuẩn bị hóa chất phân tích.
Axit acetic 1 – 2%: Dùng pipet hút 0.2 ml axit acetic cho vào bình định mức 10 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất đề ion
Natri tetraborat ( Na2B4O7) 0.25M: Cân 47.75g Na2B4O7.10H2O hòa tan trong nước cất đề ion, định mức về 500 ml bằng nước cất đề ion.
Pha động A
− Cân 1.36 ± 0.025 g NaCH3COO cho vào cốc 1000 ml
− Thêm 500 ml H2O, khuấy cho tan NaCH3COO − Thêm 90µl triethylamine (TEA) khuấy đều
− Điều chỉnh pH về pH = 7.2 ± 0.05 bằng vài giọt axit acetic 1 – 2%
− Thêm 1.5 ml tetragydrofuran (THF). Sau đó khuấy đều
Pha động B
− Cân 1.36 ± 0.025 g NaCH3COO cho vào cốc 500 ml
− Thêm 100 ml H2O, khuấy cho tan NaCH3COO
− Điều chỉnh pH về pH = 7.2 ± 0.05 bằng vài giọt axit acetic 1 – 2%
− Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitinl và 200 ml methanol. Sau đó khuấy đều.
4.4. Chuẩn bị và xử lí mẫu.
Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.
- Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001. Cho vào ống chịu nhiệt có nắp đậy kín có khả năng chịu nhiệt.
- Pha dung dịch HCl 15% (6M), cho vào ống chịu nhiệt 11,5 ml dung dịch HCl.
Sau đó cho vào ống đựng mẫu lắc đều và làm hòa tan mẫu bằng cách đặt ống vào máy siêu âm trong vòng 10 phút.
− Cho các ống nghiệm vào máy hút chân không để loại bỏ không khí trong vòng 15 phút. Đậy nắp ống nghiệm ngay sau khi tắt máy.
- Thủy phân mẫu bằng cách cho vào tủ sấy và đặt nhiệt độ tủ sấy ở 1500C giữ nhiệt độ đó trong thời gian là 10h, 14h, 18h, 20h, 22h, 24h.
− Lấy mẫu ra khỏ tủ sấy.
− Để nguội, mở ống nghiệm, điều chỉnh về pH = 5 ÷ 6 bằng Na2B4O7 0.25M.
− Định mức vào bình 100ml với nước cất đề ion.
− Lọc qua giấy lọc thường sau đó lọc qua màng lọc 0.45µm.
− Điều chỉnh về pH = 9 ÷10 bằng Na2B4O7 0.25M
− Cho mẫu vào vail tiến hành chạy mẫu theo trình tự đã cài sẵn. Quá trình chẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ sau:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 39
Lọc qua màng lọc 0,45µl,điều chỉnh
Chạy mẫu
Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy ống nghiệm
Loại bỏ không khí bằng tủ hút chân không
Thủy phân ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Để nguội, mở ống, điều chỉnh về pH = 5 6 bằng Na2B4O7 Định mức vào bình 100 ml
Lọc qua giấy lọc thường
Lọc màng lọc 0.45m Điều chỉnh về pH = 9 10 bằng Na2B4O7 Chạy mẫu Cân 1g mẫu HCl 15% (6M)
4.5. Tiến hành phân tích trên máy
− Cột sắc ký: cột C18 150 × 4,6mm, kích thước hạt 5μm (Hoặc tương đương).
− Nhiệt độ cột: 400C.
− Tốc độ dòng: 0,45ml/phút.
− Pha động: Pha động A: Pha động B theo gradient:
TT Time (min) A % B % Flow (ml/min) 1 0 100 0 0.45 2 17 40 60 0.45 3 18 0 100 0.45 4 18.1 0 100 0.45 5 18.5 0 100 0.8 6 23.9 0 100 0.8 7 24 0 100 0.45 8 25 100 0 0.45
− Chương trình bơm mẫu:
TT Chương trình
1 Lấy 5µltừ vial 10 – Đệm borate
2 Lấy 1µl từ vial 11 – Dẫn suất OPA
3 Lấy 0µl từ vial 12 – Nước
4 Lấy 1µl từ vial chứa mẫu
5 Lấy 0µl từ vial 11 – Nước
6 Trộn mẫu
7 Lấy 1µl từ vial 14 – FMOC
8 Lấy 0µl từ vial 12 – Nước 9 Trộn mẫu
10 Bơm mẫu
− Dầu dò: UV hấp thụ tại bước sóng 338 nm
Huỳnh quang từ bước sóng 340 – 450 nm.
CHƯƠNG 3:
3.1. Kết quả
3.1.1. Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ.
Để xác định đường chuẩn ta chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn đã biết chính xác nồng độ. Cụ thể chuẩn bị 3 mẫu rồi đo kết quả như sau:
Hình 3.2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 16 axit amin ở nồng độ 100ppm
Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 16 axit amin ở nồng độ 250 ppm
Ta có kết quả của từng axit amin:
Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của axits Aspitic:
Tên axit amin Nồng độ (pmol) Diện tích Nồng độ/ diện tích
100 96.51773 1.03608
250 219.93652 1.13669
Để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng axit Aspatic như sau:
Phương trình hồi qui của đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = mx +b x là nồng độ, y là diện tích pic
m = 0,89098 b = 4,55551 Hệ số hồi quy tuyến tính là R2 = 0,99931
Tương tự ta có phương trình đường chuẩn của 15 axit amin còn lại: Asp: Y= 0,89098x+ 4,55551
Glu: Y= 0,76091x + 0,74798, R2=0,99947
His : Y= 0,51795x – 1,63340, R2= 0,99912
Ser : Y= 0,85431x + 0,43613, R2= 0,99999
Thr: Y= 0,83348x +3,02754, R2= 0,99961
Arg : Y= 0,9487x – 0,50827, R2= 0,99956
Ala: Y= 0,88472x + 0,405289, R2= 0,99998
Met : Y= 1,04410x- 1,63336, R2= 0,99994 Val : Y= 0,83699x – 0,469066, R2= 0,99998
3.1.2. Xử lý kết quả.
Dựa vào kết quả sắc ký ta có:
- Hàm lượng axit amin (µg/g) có trong mẫu được tính theo công thức:
C =
1000
A
x f x 10-6
- Hiệu suất thu hồi: %H = x 100%
3.1.3. Khảo sát thời gian thủy phân tối ưu ( khảo sát mẫu nấm 661 )
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi
TT Axit amin Nồng độ (ppm) Cs+mẫu - Cmẫu Cso (ppm) %H
Cs+ mẫu Cmẫu 1 Arg 10 h 2111.67692 2083.67417 28.00275 25 112.01 Arg 14 h 1958.1691 1930.18349 27.98561 25 111.94 Arg 18 h 1932.90032 1909.10327 23.79705 25 93.70 Arg 22h 1497.76057 1473.06645 24.69412 25 98.77 Arg 24h 1168.75591 1146.80841 21.94750 25 87.79 2 Thr 10 h 414.875641 386.73473 28.14091 25 112.56 Trong đó: %H là hiệu suất thu hồi
Cs+ mẫu là nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đó được Cmẫu là nồng độ mẫu thực đo được
Cso là nồng độ chuẩn biết trước
Trong đó: C là nồng độ axit amin có trong mẫu tính bằng µg/g A là hàm lượng axit amin đo được tính bằng ppm. f là hệ số pha loãng.
Thr 14 h 102.76968 76.60643 26.16325 25 104.64 Thr 18 h 142.02404 114.00910 28.014931 25 94.25 Thr 22 h 335.94266 311.51909 24.42357 25 97.65 Thr 24 h 390.30064 367.34333 22.95731 25 91.82