Nghiên cứu giải mã trình tự hệ Genome của chủng Virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC CAO DUY PHÚC NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Phạm Thị Vân, Ks. Nguyễn Thị Thu Hiền, CN. Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể cán bộ Phòng công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian làm khoá luận. Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận. Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./ Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Cao Duy Phúc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT µg microgam µl microlitre bp Base pair CP Coat protein (protein vỏ) DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine tetra-acetate acid EtBr Ethidium Bromide et al Đồng tác giả Kb Kilobase LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus polymerase v/p vòng/phút Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã đƣợc xác định có ở Việt Nam …………………………………… 4 1.2 Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra…………………… 11 2.1 Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu………………………… 23 2.2 Trình tự và thông số của hai mồi………………………………… 25 2.3 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N…………. 26 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N……. 26 2.5 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R……………… 27 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………… 27 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối……………………………………. 29 2.8 Thành phần phản ứng colony-PCR……………………………… 31 2.9 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR………………………… 31 2.10 Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI 32 2.11 Mã số, nguồn gốc đất nƣớc và cây chủ của một số thể phân lập, chủng Begomovirus trên GenBank………………… 33 3.1 Kích thƣớc và vị trí các gen trên vòng DNA-A………………… 41 3.2 Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit vòng DNA-A của 3 thể phân lập HN, BG, LS với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới ………………… 47 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và cấu trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)……… 14 1.2 Cấu trúc vòng DNA-β …………………………………………… 17 1.3 Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá ………………………………. 18 1.4 Bọ phấn Bemisia tabaci 20 2.1 Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV…………… 25 2.2 Cấu tạo vector pBT ……………………………………………… 28 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ lá bị bệnh xoăn lá 35 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân vòng DNA-A ……….……… 36 3.3 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α……………………………………………………… 38 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR……………………………. 38 3.5 Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự ………………….……… 39 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng BamHI 40 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotit vòng DNA-A giữa 3 thể phân lập HN, BG, LS … 44 3.8 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập HN…… 45 3.9 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG…… 46 3.10 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập LS……… 46 3.11 Cây phát sinh chủng loại ………………………………………… 49 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ii Danh mục các bảng iii Danh mục các hình iv Mục lục v MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. VIRUS THỰC VẬT 3 1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay 3 1.1.2. Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra 5 1.1.3. Cấu trúc của virus thực vật 7 1.2. MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ 8 1.2.1. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)……… 8 1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)… 9 1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV) 10 1.3. VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV) 12 1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại 12 1.3.2. Cấu trúc genome và chức năng của các protein 14 1.3.3. Triệu chứng và cơ chế lây bệnh 18 1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây trồng chuyển gen kháng Begomovirus 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.1.1. Nguồn vật liệu 23 2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit 23 2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị 23 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 24 2.2.2. Phản ứng PCR 25 2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose 27 2.2.4. Phƣơng pháp thôi gel 28 2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT 28 2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 29 2.2.7. Phản ứng colony-PCR 30 2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid 31 2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI 32 2.2.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE …………………………………………………………………. 35 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 35 3.1.2. Kết quả nhân gen bằng phản ứng PCR 36 3.1.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37 3.1.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR 38 3.1.5. Tách plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra sự có mặt của gen tách dòng 39 3.1.6. Kết quả xác định trình tự 41 3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 44 3.2.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide 44 3.2.2. Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua cây phát sinh chủng loại 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày đƣợc trồng nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Không chỉ để sản xuất thuốc lá, nó còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gen ngoại lai thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng cây thuốc lá. Trong đó có bệnh xoăn lá do virus xoăn lá thuốc lá (Tobacco leaf curl virus, TLCV) gây nên. Khi cây mắc bệnh virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100%. Cho đến nay chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus gây ra trên cây trồng. Con ngƣời chỉ có thể hạn chế tác hại của virus và kiểm soát nó ở mức độ nhất định. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đang đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ và đƣợc đánh giá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Song bệnh hại (đặc biệt là bệnh do virus) cũng đang đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây thuốc lá. Nghiên cứu hiểu rõ vật liệu di truyền của virus tác nhân gây bệnh trên cây thuốc lá là vấn đề rất cần thiết, kết quả này sẽ có định hƣớng trong phòng chống đúng loại virus bằng việc tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh. Hiện nay, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học, ngƣời ta đã tạo ra đƣợc một số loại cây trồng kháng đƣợc bệnh do virus gây ra thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh [15]. Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 Vì vậy, giải trình tự toàn bộ genome của TLCV cho từng vùng khác nhau là cần thiết. Genome của nhiều chủng TLCV đƣợc phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới nhƣ Hawaii, Mexico, Brazil, Thái Lan, Đài Loan, đã đƣợc công bố chi tiết. Tuy nhiên thông tin về toàn bộ trình tự genome TLCV gây bệnh trên cây thuốc lá ở Việt Nam chƣa nhiều, mà chủ yếu tập trung trên các loài cây cà chua, ớt [20]. Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải mã trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định trình tự toàn bộ genome của virus xoăn lá thuốc lá (TLCV). Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số của TLCV - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Tách dòng gen - Đọc trình tự gen và phân tích trình tự Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VIRUS THỰC VẬT 1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay Cho tới nay, hơn 2000 virus đã đƣợc phát hiện và công nhận, trong đó khoảng 1000 là các virus gây hại thực vật. Các virus thực vật nhìn chung không làm chết cây nhƣng chúng ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng, phát triển của cây, năng suất và chất lƣợng nông phẩm. Nhiều trƣờng hợp, bệnh do virus gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất của một cây trồng nào đó. Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa khi có thời tiết và nhiệt độ ôn hòa, nhƣng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thƣờng gây nên hiện tƣợng mất triệu chứng (latent period) làm cho ngƣời sản xuất bị nhầm lẫn, không phát hiện đƣợc cây bị bệnh và mức nguy hiểm của bệnh, chỉ đến lúc nào đó cây không còn khả năng phục hồi theo chu kỳ bệnh nữa, hoàn toàn tàn lụi, khi đó mới biết thì đã quá muộn.Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây thƣờng năm nhƣ Rice grassy stunt virus gây bệnh lùn lúa cỏ, Rice tungro spherical virus và Rice tungro bacilliform virus gây bệnh tungro (hại lúa), Tomato yellow leaf curl virus gây bệnh xoăn vàng lá (hại cà chua) [44]. Các virus hại khoai mì đã từng hủy diệt hàng chục vạn hecta ở châu Á và châu Phi [43] trong một thời gian ngắn chƣa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tƣơi trở thành vàng úa, chết lụi. Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng của bệnh tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Hạt lúa bị bệnh virus thƣờng bị lép không cho thu hoạch, trong trƣờng hợp đƣợc thu hoạch hạt thƣờng rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lƣợng tinh bột và các chất dinh dƣỡng đều thấp. Có trƣờng hợp bệnh do một chủng đặc biệt của virus làm vỏ quả, củ có vết loét, bẩn giảm giá trị thƣơng phẩm, nhƣ khi khoai tây bị nhiễm một chủng Potato virus Y [7]. Ở cà chua bị xoăn lá, quả bé, múi khô và hoa rụng, năng suất và phẩm chất đều rất thấp. Comment [SCD1]: VIRUS [...]... khảm thuốc lá) và Satellite tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh) 11 Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá) 12 Bung hạt thuốc lá Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá) 13 Đốm vòng thuốc lá Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) 14 Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) 15 Còi cọc thuốc lá Tobacco... stunt virus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 12 7 Bệnh hình hoa hồng 8 Kỵ axit thuốc lá Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây bệnh biến dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus (virus gây đốm thuốc lá) Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) 9 Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá) 10 Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus (virus. .. stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) 16 Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) 17 Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua) 18 Viền gân lá Potato virus (virus Y khoai tây) 19 U vết thƣơng Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thƣơng) (Nguồn: http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp) 1.3 VIRUS XOĂN LÁ THUỐC... những vùng trình tự overlap Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn Từ các nghiên cứu ở CaMV [22], [30] cho rằng sao chép CaMV liên quan với phiên mã ngƣợc qua trung gian RNA của bộ gene Chu trình sao chép giống với retrovirus và hepatitis B virus Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây một lá mầm và 2 lá mầm .Virus sọc vằn lá ngô (Maize... streak virus, MSV) là một gemini virus lây nhiễm qua lá, đƣợc truyền do côn trùng Bộ gene của geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn Sao chép DNA virus đƣợc nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh Virus gây ra sự ức chế sinh trƣởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm 1.2 MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC... chua, thuốc lá Việc sử dụng các giống thuốc lá kháng Begomovirus là cách tiếp cận tốt nhất để giảm thiệt hại do Begomovirus Tuy nhiên, cho đến nay việc tạo ra cây thuốc lá chuyển gen kháng TLCV còn hạn chế Mặt khác đã có rất nhiều nghiên cứu về loài Begomovirus khác nhƣ TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) - virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Giống cà chua kháng TYLCV đầu tiên đƣợc tạo ra là kết quả của. .. THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV) 1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại Virus xoăn lá thuốc lá- Tobacco leaf curl virus (TLCV) là một trong những virus gây bệnh trên các cây họ cà ở nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Đƣợc Storey phát hiện đầu tiên vào năm 1931 TLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này gồm có 4 chi lớn đó là Begomovirus, Curtovirus, Mastrevirus... gen virus theo cả hai hƣớng Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình tự bảo thủ lặp lại đảo ngƣợc của TAATATT/AC đƣợc định vị trên một cấu trúc vòng có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep trong quá trình phiên mã [25] (A) (B) Hình 1.1 Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và cấu trúc genome của. .. phận non của một cây Chính vì vậy khi nhân giống vô tính trong phòng thí nghiệm, virus có khả năng lây lan rất lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng trồng trọt công nghệ cao Cho tới nay, 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã đƣợc xác định ở Việt Nam (Bảng 1.1), phần lớn đã đƣợc giải trình tự Trong số này, đa số là các virus thuộc 2 chi Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus) Đây... bệnh Tên virus gây bệnh 1 Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus (virus khảm linh lăng) 2 Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus (virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần) 3 Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân STT thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá) 4 Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dƣa chuột) 5 Vàng hoại tử rau diếp . Nghiên cứu giải mã trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam . Mục tiêu nghiên cứu - Xác định trình tự toàn bộ genome của virus xoăn lá thuốc lá (TLCV). . NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ. mottle virus (virus gây đốm thuốc lá) 8 Kỵ axit thuốc lá Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) 9 Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá) 10