Nghiên cứu tính đa hình protein trong một số loại dịch chọc dò của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS LƯƠNG THỊ HỒNG VÂN

2 TS NGUYỄN GIA BÌNH

Thái Nguyên - 2013

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cơ thể người có khoảng 40 lít dịch trong đó 25 lít nằm trong các tế bào gọi là dịch nội bào, 15 lít nằm bên ngoài tế bào gọi là dịch ngoại bào Dịch ngoại bào gồm có huyết tương, dịch kẽ, dịch bạch huyết, dịch ổ mắt, dịch tiêu hóa, dịch não tủy (DNT)… Dịch ngoại bào được vận chuyển trong máu tuần hoàn, có

sự trao đổi giữa máu và các mô qua thành mao mạch [6]

Trong các dịch cơ thể nói trên đều chứa các chất vô cơ và hữu cơ hòa tan như protein, glucose, canxi, photpho, kali Khi các trị số về hàm lượng của những chất này vượt khỏi giới hạn sinh lý cho phép (cao hoặc thấp hơn) thì chúng phản ánh những trạng thái bệnh lý nào đó của cơ thể con người [2], [6]

Ngoài các dịch cơ thể bình thường kể trên, có một số dịch xuất hiện với lượng nhiều hơn bình thường biểu hiện bệnh lý như dịch màng phổi (DMP), dịch màng bụng (DMB), dịch màng tim… gây hiện tượng tràn dịch Dựa trên chỉ số protein là chính và các chất khác có trong dịch mà phân biệt là dịch thấm (transsudat) hoặc dịch tiết (exsudat) Dịch thấm gặp trong các trường hợp thận

hư, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim Dịch tiết thường do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thư Vì vậy khi chẩn đoán một bệnh nào đó có dựa vào xét nghiệm dịch chọc dò (là các dịch được lấy ra từ màng phổi, màng tim, dịch khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn), người ta thường quan tâm nhiều đến chỉ số protein trong đó có hay không có và có bao nhiêu trong một đơn vị tính (ví dụ g/l hoặc mg/dl)

Trước đây các nhà chuyên môn chỉ sử dụng phương pháp định tính trong quy trình xét nghiệm dịch chọc dò, những phương pháp này chỉ cho phép trả lời câu hỏi có hay không có protein trong dịch chọc dò mà thôi Hơn nữa, chỉ một nhiễm tạp nhỏ trong quá trình xét nghiệm cũng sẽ dẫn tới làm sai lệch kết quả, làm mất thời gian, gây tâm lý lo ngại cho bệnh nhân Hiện nay, với nhiều thành

tựu của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật xét nghiệm nói riêng đã cho phép các nhà sinh học có thể định lượng protein nhằm xác định chính xác hàm lượng protein có mặt trong bất cứ một sinh phẩm nào, trong đó có các dịch chọc

dò của người Hay việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu các chỉ thị protein bệnh trong chẩn đoán Các kỹ thuật này nếu được nghiên cứu thành công và áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm của các bệnh viện sẽ giúp các bác sĩ chẩn đoán bệnh chính xác hơn và từ đó đưa ra biện pháp điều trị bệnh phù hợp, kịp thời có hiệu quả hơn

Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình protein trong một số loại dịch chọc dò

của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Xác định được tính đa hình của hệ protein trong từng loại dịch chọc dò nhằm hướng tới chỉ thị protein trong chẩn đoán bệnh

- Xác định được giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lượng protein trong các dịch chọc dò nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính protein đang dùng tại các bệnh viện của Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu:

- Phân tích hàm lượng protein trong các loại dịch chọc dò: DNT, DMP và DMB của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu

- Định tính protein trong DNT bằng phản ứng Pandy, trong DMP và DMB bằng phản ứng Rivalta

- Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lượng protein trong DNT nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Pandy

- Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DMP và DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Rivalta

- Xác định tính đa hình của protein trong các loại dịch chọc dò đƣợc nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Sử dụng đặc điểm hóa sinh về protein trong các dịch chọc dò làm cơ sở khoa học cho các chẩn đoán cận lâm sàng của các bệnh liên quan đến dịch chọc

dò

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về các dịch chọc dò nghiên cứu

1.1.1 Khái niệm về dịch chọc dò

Dịch chọc dò là các dịch được lấy ra từ màng phổi, màng tim, khoang của não và tủy, khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn Có 2 loại dịch khác nhau về bản chất là dịch tiết và dịch thấm Dịch thấm gặp trong các trường hợp thận hư, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim Dịch tiết thường do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thư [2]

1.1.2 Dịch não tủy

- Nguồn gốc DNT

Toàn bộ các khoang của não và tủy có thể tích vào khoảng 1600 ml và khoảng 150 ml thể tích này chứa DNT DNT có trong các não thất, trong các bể chứa quanh não, trong các khoang chứa màng nhện của não và tủy [6]

DNT được bài tiết bởi các đám rối màng mạch của các não thất, chủ yếu

là hai não thất bên Ngoài ra DNT cũng được bài tiết bởi màng ống nội tủy, màng nhện và một phần do não bài tiết qua các khoang mạch đi vào trong não Các đám rối màng mạch bài tiết DNT thông qua sự vận chuyển tích cực ion Na+qua các tế bào biểu mô nằm ở phía ngoài của đám rối [6]

- Đặc điểm, tính chất, chức năng của DNT

DNT là dịch không màu DNT có hàm lượng protein rất thấp khoảng 20 đến 30 mg/dl và hầu như không có tế bào (5 bạch cầu lympho/mm3), nồng độ ion Na+ bằng nồng độ ion Na+ của huyết tương, nồng độ ion Cl- cao hơn 15%, nồng độ K+

thấp hơn 40% và nồng độ glucose thấp hơn 30% Bình thường áp suất DNT của người ở tư thế nằm nghiêng là 100 đến 200 mm H2O, ở tư thế ngồi là 200 mm H2O [6]

Chức năng quan trọng nhất của DNT là đệm cho não ở trong hộp sọ cứng

Vì tỷ trọng của não và DNT tương tự nhau nên não nổi trong dịch, vì vậy một va chạm vào đầu sẽ làm toàn bộ não chuyển động đồng thời và không một phần nào của não bị xoắn lại vào lúc đó DNT cũng đóng vai trò của một bình chứa để thích nghi với những thay đổi thể tích của hộp sọ Trong một chừng mực nào đó, DNT cũng là nơi trao đổi chất dinh dưỡng của hệ thần kinh Tuy nhiên phần lớn quá trình trao đổi chuyển hóa của não được thực hiện trực tiếp với máu [6]

DMP có tác dụng bôi trơn hai lá màng phổi khi chúng trượt lên nhau trong chu kỳ thở Khi DMP có nhiều gọi là tràn dịch màng phổi (TDMP), xảy ra

do thay đổi chênh lệch thuỷ tĩnh hoặc do thay đổi tính thấm màng phổi [21]

- Hiện tượng TDMP

TDMP là sự tích tụ dịch bất thường trong khoang màng phổi TDMP được chia thành TDMP dịch thấm và TDMP dịch tiết TDMP dịch thấm xuất

hiện khi có sự thay đổi các yếu tố toàn thân có ảnh hưởng đến sự hình thành và hấp thu DMP làm cho DMP tích tụ TDMP dịch tiết xuất hiện khi có sự thay đổi

bề mặt của màng phổi hoặc thay đổi tại các mao mạch màng phổi làm tích tụ DMP [23]

1.1.4 Dịch màng bụng

- Nguồn gốc DMB

DMB hay còn gọi là dịch báng hoặc dịch phúc mạc Phúc mạc là một thanh mạc phủ tất cả các thành của ổ bụng, bao bọc các tạng thuộc bộ máy tiêu hoá và che phủ phía trước, hoặc phía trên các tạng tiết niệu và sinh dục Phúc mạc gồm có 2 lớp, lớp thanh mạc và lớp dưới thanh mạc Lớp thanh mạc là lớp

tế bào thượng mô trơn láng óng ánh và tiết ra một lớp dịch mỏng làm thấm ướt phúc mạc để trượt lên nhau dễ dàng DMB là loại dịch có được do sự tích tụ các chất lỏng tự do trong khoang phúc mạc [7], [28]

- Đặc điểm, tính chất và chức năng DMB

DMB có thể là dịch thấm hoặc dịch tiết DMB bình thường không vượt quá 5ml dịch thấm DMB thường có màu vàng rơm, xuất hiện vẩn đục là do sự hiện diện của các bạch cầu trung tính Ngoài ra trong dịch còn có các chất béo trung tính DMB là một chất lỏng có vai trò như một chất bôi trơn trong khoang bụng DMB có tác dụng làm ẩm bên ngoài của các cơ quan và giảm ma sát các nhu động của cơ quan trong quá trình tiêu hóa [7]

- Hiện tượng tràn dịch màng bụng (TDMB)

TDMB là một dấu hiệu lâm sàng phổ biến có nhiều nguyên nhân như: xơ gan (75%), các bệnh ác tính (10%), suy tim (5%) và các nguyên nhân khác (10%) [28]

1.2 Một số phương pháp nghiên cứu protein dịch chọc dò

1.2.1 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu định tính protein

- Định tính protein bằng phản ứng Xantoprotein

Dinitrotyrozin (màu vàng)

Thể quinoit của dinotrotyrozin Muối natri của dinitrotyrozin (màu da cam)

Hình 1.1 Sơ đồ cơ chế của phản ứng Xantoprotein [9]

Đây là những phản ứng đặc trƣng cho những protein có chứa acid amin vòng nhƣ phenilalanin, tirozin, tryptophan Khi đun nóng dung dịch protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng Khi thêm dung dịch kiềm vào

sẽ tạo thành muối có cấu tạo quinoit màu da cam Ngƣợc lại, các protein không chứa acid amin vòng nhƣ gelatin không cho phản ứng này [9]

- Định tính protein bằng phản ứng Millon

tyrozin Thủy ngân – nitrotyrozin(màu đỏ)

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế của phản ứng Millon [9]

Thuốc thử millon là hỗn hợp các muối nitrat và nitric thủy ngân được hòa tan trong HNO3 Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ Phản ứng Millon được dùng để phát hiện protein chứa tyrozin và các hợp chất phenol [9]

- Định tính protein bằng phản ứng Adamkievic

Tryptophan Bis – 2-tryptophanalilmetan

Hình 1.3 Sơ đồ cơ chế của phản ứng Adamkievic [9]

Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại andehit tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng Phản ứng Adamkievic được dùng để phát hiện protein chứa tryptophan [9]

- Định tính protein bằng phản ứng tủa với TCA (acid tricloacetic)

TCA là một acid hữu cơ có khả năng làm kết tủa protein trong dung dịch Khi cho TCA vào dung dịch thì nó làm kết tủa protein sau đó ta đem lọc và rửa kết tủa sẽ thu được protein Phương pháp này chỉ dùng cho các protein tan trong nước và có độ chính xác tương đối cao [9]

1.2.2 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu định lượng protein

- Định lượng protein theo phương pháp Lowry

Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử folin Phương pháp này

sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thủ folin tác dụng lên gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu

cực đại ở bước sóng 750 nm và dựa vào đường chuẩn protein để từ đó định lượng hàm lượng protein Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein

Hình 1.4 Mô hình phương pháp Lowry [5], [9]

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein/ml, thường nhạy trong khoảng từ 2 - 5 µg protein/ml [5], [9]

- Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Trong môi trường acid, Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với nhóm kỵ nước và nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh Dựa vào đường chuẩn của protein suy ra hàm lượng protein trong mẫu

Hình 1.5 Mô hình phương pháp Bradford [5], [9]

Phương pháp này dùng cho protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng Phương pháp này nhạy hơn 2 - 3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml, đồng thời làm giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử [5], [9]

- Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280 nm do các acid amin tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin Sự hấp thu ở bước sóng

280 nm của chúng cũng thay đổi tùy loại protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch

Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thường ổn định hóa phần lớn protein [9]

- Định lượng protein bằng phương pháp Biure

Dựa vào phản ứng tạo màu giữa protein và Cu+2

trong môi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540 nm Cường

độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết peptid trong chuỗi polypeptid

Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn (2 - 20 µg/ml) [9]

1.2.3 Phương pháp sinh học phân tử nghiên cứu protein

- Điện di biến tính protein (SDS-PAGE)

Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide không

liên tục và mẫu protein được gây biến tính SDS là một tác nhân làm biến tính và

âm tính hóa các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2-mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay DTT thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S-S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc 1 và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, dưới tác động của điện trường sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp là lớp gel

cô và gel tách [12]

Lớp gel cô: Thông thường lớp gel này có nồng độ gel thấp (4 - 5%), và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu Khi có tác động của điện trường các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này Nhờ đó, các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein [12]

Lớp gel tách: Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel cô, và nằm phía dưới Có tác dụng trong việc tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu [12]

Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10000 - 200000 Da (daltons) Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200000 Da thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide

ít hơn 2,5% [12]

Hình 1.6 Cấu trúc protein trước và sau khi biến tính bởi SDS [12]

- Điện di hai chiều protein (2-DE)

Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những công cụ phân tách protein và được sử dụng trong nghiên cứu

về hệ protein [32] Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lượng phân tử và có thể phát hiện vệt protein có hàm lượng < 1 ng Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel

và giải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [27] Nhờ đó mà nó ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [34]

Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một trong các phương pháp sau: điện di gradien pH cố định, điện di hội tụ theo điểm đẳng điện hoặc điện di gradien pH không cân bằng [4] Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp

phân tách protein theo 2 chiều, chiều thứ nhất theo điện tích và chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử

Hình 1.7 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE [4]

Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp lại tương đối của thí nghiệm điện di Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch giữa các lần chạy khác nhau [41], [42] Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [41]

- Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE–MS)

Khối phổ (Mass spectrometry - MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z Dữ liệu được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học [4]

Hình 1.8 Sơ đồ kết hợp 2-DE và MS/MS trong xác định protein [4]

Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu proteomics [32], [33]

1.3 Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò và ý nghĩa của việc nghiên cứu protein dịch chọc dò

1.3.1 Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò dùng trong chẩn đoán

Xét nghiệm đạm và LDH (lactic dehydrogenase): Đây là một trong

những xét nghiệm sinh hóa ban đầu giúp phân biệt dịch thấm và dịch tiết đối với dịch chọc dò Hàm lượng urê trong DNT người bình thường dao động trong khoảng 2,5 - 6,7 mmol/l Xét nghiệm LDH thường được quan tâm nhiều đối với DMP và DMB Đối với hai loại dịch này, dịch tiết thường có LDH và đạm tăng nên đạm và LDH được sử dụng trong việc phân biệt dịch thấm và dịch tiết [2], [17], [21], [23]

Xét nghiệm glucose: Glucose DNT bằng 2/3 nồng độ glucose máu Sự

tăng hay giảm glucose DNT phụ thuộc vào nồng độ của glucose máu Glucose

DNT tăng ở những bệnh nhân hôn mê đái tháo đường Ngoài ra, glucose còn tăng ít trong viêm não, tăng áp lực sọ não, động kinh, uốn ván, trong các cơn co giật khác, nhưng sự tăng này ít có ý nghĩa trong việc chẩn đoán Sự tăng bạch cầu và sự xuất hiện của các vi khuẩn trong DNT là nguyên nhân làm giảm nồng

độ glucose có trong DNT Glucose giảm nhiều trong viêm màng não mủ, đôi khi chỉ còn ở dạng vết, trong khí đó glucose máu vẫn ở mức bình thường Glucose cũng giảm trong viêm não do lao Glucose trong DMP, DMB bình thường hoặc dịch thấm tương đương glucose huyết tương Glucose < 60 mg/dl có thể gặp trong viêm đa khớp dạng thấp, tràn mủ màng phổi, ác tính, lao, lupus Nếu glucose rất thấp (< 30 mg/dl) nguyên nhân thường là viêm đa khớp dạng thấp, tràn mủ màng phổi, ác tính [2], [17], [21], [23]

Xét nghiệm hàm lượng protein: Trong DNT của người bình thường,

hàm lượng protein dao động trong khoảng 0,25 - 0,4 g/l Protein DNT tăng trong viêm màng não do lao, viêm màng não mủ, viêm màng não, ép tuỷ, viêm đa rễ thần kinh, viêm màng nhện tuỷ Đối với DMP và DMB, ở những trường hợp dịch tiết nhận thấy hàm lượng protein tăng cao [2], [17], [21], [23]

Xét nghiệm clorua: Trong DNT của người bình thường, hàm lượng

clorua dao động trong khoảng 120 -130 mmol/l Clorua giảm nhiều trong viêm màng não do lao, kèm theo sự thay đổi của protein và glucose trong DNT

Clorua còn có thể giảm trong viêm màng não, u não [2], [17], [23]

Xét nghiệm tế bào học: Nếu trong DMP có 5000 - 10000 hồng cầu/mm3dịch có màu hồng đỏ Nếu > 100000 hồng cầu/mm3: chấn thương lồng ngực, ác tính, nhồi máu phổi Dịch thấm thường có bạch cầu < 1000 tế bào/mm3 Dịch tiết thường có bạch cầu > 1000 tế bào/mm3 Nếu > 10000 tế bào/mm3

thường do TDMP cận viêm phổi nhưng cũng gặp trong viêm tụy cấp, nhồi máu phổi Nếu

> 50000 tế bào/mm3 thường là tràn mủ màng phổi Nếu là lao, viêm mạn tính, bệnh lý ác tính thường < 5000 tế bào/mm3 Lymphocyte nhỏ > 50% thường là

viêm mạn tính như lao hoặc ung thư Bạch cầu đa nhân trung tính ưu thế thường

là viêm cấp như viêm phổi, viêm tụy cấp, nhồi máu phổi, lao giai đoạn sớm Bạch cầu đa nhân ái toan tăng > 10% thì 2/3 trường hợp là do có khí hoặc máu trong màng phổi dẫn tới tràn máu màng phổi, tràn khí màng phổi, TDMP cận viêm phổi Bạch cầu ái toan thường không tăng trong ung thư và lao DMB bình thường chứa < 500 bạch cầu/µl và < 250 bạch cầu đa nhân/µl Bất kỳ tình trạng nhiễm trùng nào cũng có thể gây tăng bạch cầu Lượng bạch cầu đa nhân > 250 /µl gợi ý viêm phúc mạc do vi trùng Bạch cầu lympho thường chiếm ưu thế trong viêm phúc mạc do lao và ung thư di căn phúc mạc [2], [21], [23]

1.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu protein dịch chọc dò

Nghiên cứu về hệ protein trong các dịch của cơ thể là một hướng nghiên cứu mới và nhiều triển vọng trong việc tìm ra những protein chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [3].DNT, DMP và DMB là những loại dịch của cơ thể đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong việc chẩn đoán nguyên nhân bệnh lý Các loại dịch chọc dò này mang hai đặc trưng quan trọng giúp cho quá trình nghiên cứu thuận lợi đó là các thủ thuật chọc dò hiện nay rất phổ biến trong ngành y nên việc lấy mẫu rất dễ dàng và an toàn, mẫu được lấy phản ánh trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào

đó (thời điểm biểu hiện bệnh lý) [4]

Trong các loại dịch chọc dò kể trên, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể Chính vì thành phần protein phức tạp của dịch chọc dò bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein dịch chọc dò hứa hẹn

sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau Những thay đổi bất thường về thành phần protein trong từng loại dịch chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh

lý Nói cách khác, dịch chọc dò là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin

cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng các loại dịch chọc dò cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua

Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về protein dịch chọc dò thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh

y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu sinh hóa các dịch chọc dò ở Việt Nam và trên thế giới

1.4.1 Tình hình nghiên cứu sinh hóa DNT ở Việt Nam và trên thế giới

DNT là một trong số các dịch chọc dò được nhiều nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu Hầu hết các nghiên cứu đều coi đây là một đối tượng cần phân tích để đưa ra những dấu hiệu trong chẩn đoán

DNT là thành phần liên quan tới hầu hết các hoạt động của hệ thống thần kinh trung ương Hiện nay, DNT được sử dụng để nghiên cứu các bệnh liên quan tới việc mất cân bằng các thành phần phân tử đặc biệt là các thành phần ngoại bào [45] Các nhà khoa học Phần Lan đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí kết hợp khối phổ trong việc xác định những tính chất của DNT Nghiên cứu cho thấy nồng độ 21 acid amin và hydroxyl thay đổi từ 0,04 - 77 ng/µl Nhờ kỹ thuật khối phổ đã xác định được 91 chất chuyển hóa thuộc các nhóm chức năng khác nhau Các chức năng này liên quan mật thiết tới chức năng của DNT [36]

Năm 2011, các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành nghiên cứu sự khác biệt về thành phần protein trong DNT của nhóm bệnh nhân mắc hội chứng mệt mỏi mạn tính và nhóm bệnh nhân bị bệnh Lyme đang điều trị giai đoạn cuối so với

những người bình thường Kết quả nghiên cứu cho thấy trong DNT của nhóm bệnh nhân mắc hội chứng mệt mỏi mạn tính phát hiện 2783 loại protein, nhóm bệnh nhân mắc bệnh Lyme phát hiện 2768 loại protein và những người khỏe mạnh thì thấy 2630 loại protein Đây là những cơ sở dữ liệu hữu ích để đưa ra những giả thiết về cơ chế sinh bệnh, cho phép tiến hành những nghiên cứu tiếp theo trong việc chẩn đoán sớm và can thiệp điều trị kịp thời [48]

Xét nghiệm DNT là một trong những căn cứ quan trọng trong việc chẩn đoán viêm màng não Hàm lượng protein, hàm lượng đường, lượng bạch cầu và lượng neutrophil trong DNT là những tiêu chí quan trọng của tiêu chuẩn Thome trong việc phân biệt viêm màng não mủ hay viêm màng não siêu vi [30]

Các nhà khoa học của Mỹ gần đây đã tập trung nghiên cứu phân tích DNT nhằm hướng tới xây dựng cơ sở dữ liệu về protein DNT phục vụ chẩn đoán bệnh Bước đầu đã có những kết quả nhất định chứng tỏ protein DNT có liên quan tới nhiều bệnh như Parkinson, bệnh Alzheimer, chấn thương sọ não, teo

cơ Phát hiện nhiều loại protein chỉ có ở DNT, do vậy đây được coi là một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho việc tìm ra các protein chỉ thị bệnh [54]

Cùng nghiên cứu về DNT của bệnh nhân Alzheimer, tại phòng thí nghiệm Đại học Toronto Canada, các nhà khoa học đã bước đầu nghiên cứu chỉ thị phân

tử protein trong DNT trong chẩn đoán sớm bệnh Alzheimer Kết quả đã xác định được 40 loại protein có liên quan tới bệnh Alzheimer có mặt trong DNT Hầu hết chúng là các protein ngoại bào [29]

Nghiên cứu phân tích protein trong DNT của bệnh nhân Parkinson cho thấy 21 protein được xác định có liên quan tới cơ chế của bệnh Đây là những kết quả do các nhà khoa học Đại học Fudan Trung Quốc mới công bố, nó mở ra những hướng nghiên cứu mới trong chữa trị bệnh Parkinson [53]

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về DNT còn nhiều hạn chế so với thế giới Hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam chỉ hướng tới xác định sự thay đổi các

chỉ tiêu sinh hóa đối với DNT mà không có phát hiện những thành phần mới trong đó

Năm 2000, Nguyễn Thu Hà đã tiến hành nghiên cứu DNT trên bệnh nhân lao màng não tại bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, nhận thấy protein trong DNT của các bệnh nhân luôn tăng Mức tăng thường nằm trong khoảng 5,79 μmol/l - 28,98 μmol/l, đặc biệt là xung quanh mức 14,49 μmol/l [8]

Cùng nghiên cứu trên DNT của bệnh nhân lao màng não, Ngô Ngọc Am (2006) đã chỉ ra lượng đường trong DNT của các bệnh nhân lao màng não thường giảm ở mức 1,39 μmol/l - 1,94 μmol/l so với bình thường Một số ít trường hợp nhất là ở giai đoạn sớm không giảm, những trường hợp nặng thường giảm nhiều Số lượng tế bào trong DNT thường tăng [1]

Nguyễn Văn Tuấn và cộng sự (cs) (2009) đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng creatine phosphokinase trong DNT của các bệnh nhân viêm màng não thuộc các nhóm vi trùng sinh mủ, lao, nấm, virus, nhận thấy có khác biệt về nồng độ và biến thiên giữa các nhóm viêm màng não Bệnh nhân viêm màng não vi trùng sinh mủ có creatine phosphokinase DNT ≥ 20 U/l biểu hiện lâm sàng nặng nề và nguy cơ có di chứng lúc xuất viện cao hơn những bệnh nhân có creatine phosphokinase DNT < 20 U/l Đây là những căn cứ quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh viêm màng não [24]

Dương Thanh Long và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm DNT của các bệnh nhi trên 1 tháng tuổi đến 15 tuổi đến khám và điều trị tại khoa Nhi bệnh viện An Giang Trong 45 trường hợp viêm não, tuổi trung vị 3 (6 tháng -

13 tuổi) Có 12 ca (26,6%) xác định được tác nhân gây viêm não bao gồm enterovirus, herpes simplex và viêm não Nhật Bản B 33 ca (73,3%) không xác định tác nhân viêm não Đặc điểm về DNT của các bệnh nhi nghiên cứu cho thấy trung bình mật độ tế bào là 39 tế bào/mm3, tỉ lệ neutro là 67%, tỉ lệ lympho

là 31%, hàm lượng protein là 0,43 g/l, hàm lượng glucose là 4,18 mg/dl, lactat là

2 mmol/l Như vậy, về xét nghiệm DNT, số tế bào tăng vừa (39 tế bào), lượng protein tăng vừa (30mg%), đường trong giới hạn bình thường, lactate DNT < 3mmol/l [14] Điều này tương tự với mô tả trong nghiên cứu của Phạm Văn Kiểm và cs 2003 [11]

Nghiên cứu sự thay đổi của nồng độ beta amyloid 1-40 và beta amyloid 1-42 trong DNT của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer, Trần Viết Lực (2011) đã chỉ ra nồng độ beta amyloid 1-40 và beta amyloid 1-42 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Nồng độ beta amyloid 1-

42 giữa các giai đoạn bệnh cũng khác biệt rõ ràng (p < 0,001) Có sự khác biệt

về tỷ số beta amyloid 1-42/beta amyloid 1-40 giữa hai nhóm nghiên cứu và giữa các giai đoạn của bệnh (p < 0,001) [15]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu sinh hóa DMP ở Việt Nam và trên thế giới

Việc phân biệt dịch tiết và dịch thấm đối với DMP có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định nguyên nhân gây tràn dịch như suy tim, lao, các bệnh ác tính, nhiễm khuẩn…Việc phân biệt các loại dịch trên thường phải dựa theo các tiêu chuẩn thường quy trong y tế, nhưng hiện nay các nhà khoa học đang tập trung tìm ra những chỉ thị sinh học giúp ích cho việc phân biệt giữa dịch thấm và dịch tiết Việc nghiên cứu chỉ thị phân tử thay cho các xét nghiệm thường quy được coi như một hướng đi đầy triển vọng của việc ứng dụng công nghệ cao trong chẩn đoán [44]

Phân tích DMP đã được các nhà khoa học trên thế giới khẳng định có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm nguyên nhân gây TDMP [31] Các nhà khoa học tại Đại học Y khoa Wonkwang Hàn Quốc (2013) đã tiến hành nghiên cứu DMP của bệnh nhân ung thư phổi ác tính phát hiện protein phản ứng C có liên quan mật thiết tới quá trình viêm ác tính Định lượng protein phản ứng C trong DMP

có thể hoàn thiện để trở thành một xét nghiệm chẩn đoán sớm ung thư phổi ác tính [43]

Hamal và cs (2013) đã phát hiện sự khác biệt về hàm lƣợng cholesterol trong DMP đối với 2 loại dịch tiết và dịch thấm Nghiên cứu này cũng đã chỉ ra cholesterol có giá trị lớn để phân biệt dịch tiết và dịch thấm [35]

Januzzi và cs (2004) đã chỉ ra giá trị lâm sàng của xét nghiệm định lƣợng NT-proBNP (N-terminal pro B-type natriuretic peptide) trong DMP có ý nghĩa quan trọng về chẩn đoán, theo dõi điều trị, tiên lƣợng và sàng lọc TDMP do suy tim Vì NT-proBNP có thời gian bán hủy khá dài (khoảng 60 - 120 phút), có độ

ổn định nên NT-proBNP có độ nhạy cao và hiện nay nó đƣợc sử dụng nhiều trong chẩn đoán lâm sàng [38]

Cùng nghiên cứu về NT-proBNP, các nhà khoa học tại Đại học British Columbia (2010) đã chỉ ra NT-proBNP trong DMP là chỉ thị sinh học rất hữu ích cho chẩn đoán TDMP do suy tim Theo kết quả nghiên cứu trên 1120 bệnh nhân TDMP do suy tim nhận thấy hàm lƣợng NT-proBNP trong DMP trung bình là 6140 pg/ml [37]

Tại Việt Nam đã có rất nhiều các nghiên cứu trên đối tƣợng DMP phục vụ chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh lý Quang Văn Trí (2008) đã chỉ ra trong DMP của nhóm bệnh nhân lao nhận thấy số lƣợng bạch cầu trung bình là 649 tế bào/mm3, tỉ lệ bạch cầu mono chiếm 1,18%, tỉ lệ bạch cầu lympho chiếm 93%, hàm lƣợng protein trung bình là 46,56 g/l, LDH là 815,31 IU/l, hàm lƣợng glucose là 5,31 mmol/l Trong DMP của nhóm bệnh nhân ung thƣ nhận thấy số lƣợng bạch cầu trung bình là 806 tế bào/mm3

, tỉ lệ bạch cầu mono chiếm 20,8%,

tỉ lệ bạch cầu lympho chiếm 71,6%, hàm lƣợng protein trung bình là 46,56 g/l, LDH là 815,32 IU/l, hàm lƣợng glucose là 5,43 mmol/l [22]

Nguyễn Xuân Bích Huyên và cs (2008) nghiên cứu interferron gamma (IFNγ) trong DMP dịch tiết và nhận định IFNγ có giá trị cao trong chẩn đoán lao Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 84 bệnh nhân TDMP do lao, ung thƣ, viêm phổi tại bệnh viện Chợ Rẫy, IFNγ đƣợc định lƣợng trong DMP Kết quả nghiên cứu cho thấy

điểm cắt tối ưu 33 pg/ml cho phép đạt được độ chính xác cao nhất (độ nhạy 94,4%, độ đặc hiệu 89,6%) Xét nghiệm IFNγ trong DMP là một xét nghiệm khả thi, chính xác

để chẩn đoán nguyên nhân lao của TDMP dịch tiết [10]

Cùng nghiên cứu về IFNγ trong DMP, Nguyễn Thị Bích Ngọc và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu giá trị của nồng độ tumor necrosis factor anpha (TNFα) và IFNγ trong chẩn đoán TDMP do lao và ung thư Nghiên cứu tiến hành định lượng TNFα và IFNγ của hai nhóm bệnh nhân TDMP do lao và TDMP do dung thư Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ TNFα giữa hai nhóm khác biệt không có ý nghĩa thống kê Có sự khác biệt đáng kể về nồng độ IFNγ giữa hai nhóm Nồng độ IFNγ trong DMP bệnh nhân lao cao hơn rất nhiều so với của bệnh nhân ung thư màng phổi [18]

Tại Học viện Quân Y, Đặng Xuân Lâm và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân TDMP do u trung biểu mô màng phổi

ác tính Các tác giả đã phát hiện ở nhóm bệnh nhân này, DMP màu đỏ máu chiếm đa số (64,8%), tế bào lympho tăng trong DMP Đây là những căn cứ quan trong chẩn đoán lâm sàng phát hiện nguyên nhân gây tràn dịch sớm [13]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu sinh hóa DMB ở Việt Nam và trên thế giới

DMB cũng là một trong những loại dịch chọc dò của người nhưng các nghiên cứu về loại dịch này trên thế giới và cũng như ở Việt Nam không được công bố nhiều như DNT và DMP

Các nhà khoa học Thái Lan và Đài Loan (2007) đã tiến hành nghiên cứu

sử dụng các kỹ thuật proteomic phân tích thành phần protein DMB của 44 bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối Kết quả cho thấy hệ protein trong DMB rất phong phú Những protein này hoàn toàn có khả năng phân tách bởi điện di 2 chiều, nhận diện bằng khối phổ MALDI-Q-TOF kết hợp khối phổ MS và song khối khổ MS/MS Điều này mở ra một hướng mới cho việc tiếp cận nghiên cứu protein trong DMB [51]

Ở những bệnh nhân TDMB do suy tim, Sheer và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm DMB của nhóm bệnh nhân này nhận thấy hàm lượng protein thường cao hơn 2,5 g/dl [49]

Riquelme và cs (2006) đã chỉ ra rằng Adenosine deaminase (ADA) rất có giá trị trong chẩn đoán các trường hợp TDMB do lao ADA DMB trong chẩn đoán lao màng bụng đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới, nhất là những nước có tần suất mắc lao cao vì đó là một xét nghiệm nhanh, kỹ thuật khá đơn giản, chi phí thấp, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao từ 92 - 100% [46]

Sanai và cs (2005) đã tiến hành nghiên cứu phân tích DMB của những bệnh nhân lao màng bụng, kết quả cho thấy DMB thu được có màu vàng chanh,

tế bào lympho chiếm ưu thế, hàm lượng protein > 3 g/dl, hàm lượng ADA ≥ 39 U/l Nghiên cứu cho thấy xét nghiệm định lượng ADA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu là 97,2% trong chẩn đoán lao màng bụng [47]

Các nhà khoa học Việt Nam cũng tập trung nghiên cứu ADA trong dịch DMB, bởi đây là chỉ tiêu quan trọng và có độ chính xác cao trong chẩn đoán

Nguyễn Thúy Vi (2010) đã nghiên cứu đặc điểm DMB trên nhóm bệnh nhân lao màng bụng cho thấy đa số DMB có màu vàng chanh, nồng độ protein trung bình 56 g/l Trung bình nồng độ protein, trung bình bạch cầu trong DMB trong nhóm lao màng bụng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm không phải lao màng bụng 90% bệnh nhân lao màng bụng có ADA DMB ≥ 31,7 U/l

so với 3,28% bệnh nhân không phải lao màng bụng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Nghiên cứu đã chỉ ra rằng với giá trị điểm cắt ADA trong nghiên cứu

là 31,7 U/l cho độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 96,72% [26] Giá trị ngưỡng, độ nhạy,

độ đặc hiệu của ADA trong nghiên cứu này tương đương với nghiên cứu của Tarcoveanu và cs (2009)[52] Tuy nhiên, theo Riqielme và cs (2006) phân tích

số liệu của 264 BN từ 12 nghiên cứu tiền cứu thực hiện tại nhiều quốc gia đã ghi nhận, với giá trị ngưỡng ADA là 39 U/l cho độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 97,2%

[46] Như vậy, có sự khác biệt về giá trị ngưỡng, độ nhạy, độ đặc hiệu của ADA trong nghiên cứu của Nguyễn Thúy Vi (2010) và của Riqielme và cs (2006) Nghiên cứu của Nguyễn Thúy Vi (2010) và các tác giả trên khác nhau về số lượng bệnh nhân, khác nhau về tiêu chuẩn chẩn đoán lao màng bụng trong mỗi nghiên cứu, cũng như khác nhau về phương pháp xác định ADA Tác giả Riqielme và cs dùng phương pháp Giusti để xác định ADA, ngược lại nghiên cứu của Nguyễn Thúy Vi (2010) dùng phương pháp Non Giusti để xác định ADA Nguyên lý của phương pháp Giusti dựa trên việc đo những thay đổi màu sắc được tạo ra sau khi NH3 hình thành trong quá trình chuyển hóa của Adenosine Nguyên lý hoạt động của phương pháp Non Giusti ngược với phương pháp Giusti Chính từ những khác biệt đó đã dẫn đến sự khác nhau về giá trị điểm cắt, độ nhạy, độ đặc hiệu của ADA trong nghiên cứu của Nguyễn Thúy Vi (2010) và của các tác giả đã đề cập ở trên

Cũng nhiều nhà khoa học Việt Nam khác đề cập tới vấn đề độ nhạy và độ đặc hiệu của ADA trong chẩn đoán TDMB Nguyễn Ngọc Sơn (2011) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm DMB phục vụ cho chẩn đoán lao màng bụng Kết quả nghiên cứu DMB cho thấy 70% màu vàng chanh, 23,33% màu đỏ hoặc hồng, 6,07% màu vàng đục với tỷ lệ bạch cầu đơn nhiễm trên 70% là 66,67% ADA có vai trò quan trọng trong chẩn đoán lao màng bụng Phân tích ADA có độ nhạy 90% và độ đặc hiệu 96,72% trong chẩn đoán lao màng bụng [19]

Trần Thị Khánh Tường và cs (2011) đã đưa ra những đánh giá ban đầu về chẩn đoán lao màng bụng thông qua định lượng ADA trong DMB Nghiên cứu được tiến hành trên DMB của 23 bệnh nhân, trong đó 9 bệnh nhân được chẩn đoán xác định lao màng bụng bằng kết quả giải phẫu bệnh Hàm lượng ADA trong DMB của bệnh nhân lao là 51 U/l so với 9,7 U/l trong DMB do nguyên nhân khác Định lượng ngưỡng ADA DMB là một xét nghiệm đơn giản, rẻ tiền,

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán phân biệt báng bụng do lao hay

do nguyên nhân khác [25]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nhóm chứng

100 mẫu dịch huyết thanh thu được từ 100 mẫu máu người bình thường Máu được thu trong đợt khám sức khỏe tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108,

Hà Nội Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng, có hồ

sơ, bệnh án rõ ràng và có kết luận là mẫu bình thường từ các bác sĩ chuyên khoa của bệnh viện Máu toàn phần sau khi xử lý, thu huyết thanh và chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -25oC cho đến khi sử dụng

2.1.2 Nhóm bệnh nhân

100 mẫu DNT được thu từ những bệnh nhân làm xét nghiệm chọc dò DNT mắc các bệnh về não hoặc tủy sống.DMP, DMB (mỗi loại 100 mẫu) được thu từ những bệnh nhân làm xét nghiệm chọc dò DMP, DMB mắc các bệnh về lao, ung thư, xơ gan, suy tim xuất hiện TDMP, TDMB đến khám và điều trị tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Hà Nội Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng theo hồ sơ, bệnh án Đối với xét nghiệm định tính, định lượng mẫu dịch được tiến hành làm ngay trong ngày Đối với thí nghiệm khác mẫu dịch được chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -25oC cho đến khi sử dụng

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Khoa Sinh Hóa - Trung tâm kỹ thuật cao - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Hà Nôi

- Phòng Hóa sinh Protein - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.2.2 Thời gian nghiên cứu:

- Nghiên cứu được tiến hành từ 5/2012 đến 7/2013

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học phân tử và được sử dụng đúng theo những hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất Một

số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu

Bio-Rad Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA)

Fermentas Thang protein chuẩn (Protein Marker # SM0431)

Sigma TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide,

N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS)…

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Định lượng protein trong dịch nghiên cứu

- Định lượng protein trong dịch huyết thanh, DMP, DMB

Nguyên tắc: Định lượng proten toàn phần theo phương pháp so màu

(phương pháp biure) Protein trong dịch tác dụng với ion Cu2+

trong môi trường kiềm tạo thành phức hợp màu xanh tím Độ đậm màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dịch và được xác định trên máy sinh hóa tự động Olympus AU 400

Protein + Cu2+ Phức hợp màu xanh tím

Tiến hành: Sử dụng mẫu huyết thanh kiểm tra chất lượng của Olympus để kiểm tra lại độ chuẩn xác của máy Olympus AU 400 2 lần trong ngày trên 2 mức (mức có giá trị bình thường và mức có giá trị cao - bệnh lý) Xây dựng đường chuẩn mới định kỳ sau thời gian 30 ngày hoặc khi sử dụng hóa chất mới Mẫu dịch đã được bảo quản: DMP, DMB, dịch huyết thanh (chống đông bằng heparin hoặc Ethylendiamin Tetraacetic Acid ) được phân tích trên máy sinh hóa

Tiến hành: Sử dụng mẫu huyết thanh kiểm tra chất lượng của Olympus để

kiểm tra lại độ chuẩn xác của máy Olympus AU 400 2 lần trong ngày trên 2 mức (mức có giá trị bình thường và mức có giá trị cao - bệnh lý) Xây dựng đường chuẩn mới định kỳ sau thời gian 90 ngày hoặc khi sử dụng hóa chất mới Mẫu DNT đã được bảo quản được phân tích trên máy sinh hóa tự động Olympus AU

400 [2]

2.4.2 Định tính protein trong dịch nghiên cứu

Tiến hành xét nghiệm phản ứng Pandy đối với DNT, phản ứng Rivalta với DMP và DMB Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu dịch nghiên cứu Mẫu dịch được kết luận và được thống kê sử dụng trong nghiên cứu khi cả 3 lần lặp lại đều cho 1 kết quả (dương tính hoặc âm tính)

Định nghĩa: Phản ứng Rivalta là một trong những phản ứng dùng trong

xét nghiệm sinh hoá để chẩn đoán phân biệt dịch với dịch tiết của một số loại

+ Nếu những giọt dịch chọc dò chìm xuống đáy cốc, vẩn đục trắng như khói thuốc lá thì phản ứng dương tính

+ Nếu dung dịch acid acetic vẫn trong thì phản ứng âm tính [2]

2.4.3 Điện di biến tính SDS-PAGE xác định sự đa hình protein trong từng loại dịch

Sử dụng phương pháp điện di biến tính (PAGE) Kỹ thuật PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 [39]

SDS-Nguyên tắc: Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không đổi Protein được phân tách trong gel polyacrylamide ở nồng độ 12,6% Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích được loại trừ

Khi protein được chạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein - SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc

vào hình dáng, kích thước phân tử Khi đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác nhau

Thao tác kỹ thuật:

Mẫu DNT, DMP, DMB được tiến hành ly tâm 12000 vòng/phút trong 30

phút để loại cặn tạp chất thu dịch nổi Hút chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới Mẫu dịch sau đó được giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75o

C

Đối với mẫu DNT, tiến hành tủa bằng aceton lạnh trong vòng 4 giờ, ly

tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút để thu tủa và loại dịch nổi Phần tủa chứa

các protein được thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện di tiếp theo

Đối với mẫu DMP và DMB tiếp tục được tiến hành thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein trong từng loại dịch Các protein bền nhiệt từ hệ protein DMP, DMB được thu nhận lại theo phương pháp của Goufman và cs năm 2006 [33]

Một thể tích (1V) đối với từng loại dịch được trộn đều với 1V đệm ETP

(20 mM EDTA pH 8,1; 0,2 M Tris-HCl pH 8,9; 7% (w/v) PEG 6000) Hỗn hợp

được ủ 15 phút ở 98oC lắc 80 vòng/phút, 15 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau

đó được ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút Phần dịch nổi chứa các protein bền nhiệt được thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện

di tiếp theo

Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) Kỹ thuật SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 Các thiết bị, hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với nồng độ 12,6%

Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: 75V trong 30 phút và 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel Kết thúc quá trình điện di, bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250

methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả định tính và định lượng protein trong các dịch chọc dò nghiên cứu

3.1.1 Thu nhận các loại dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu

Hình 3.1 Các mẫu dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu

Ghi chú: Mẫu 1: DMP; mẫu 2: DMB; Mẫu 3, 4: DNT

Đánh giá cảm quan các loại dịch trong nghiên cứu (hình 3.1) chúng tôi nhận thấy các mẫu DNT thu được không màu và trong suốt Các mẫu DMP và DMB thu được thấy có màu vàng rơm đậm hoặc nhạt, trong suốt hoặc vẩn đục Kết quả đánh giá cảm quan của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã công bố về các loại dịch trên của một số tác giả như Trịnh Bỉnh Dy

và cs (2006) [6], Nguyễn Gia Bình (2010) [2], Balfe và cs (2009) [28]

Để xác định hàm lượng protein tổng số và tìm ra giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lượng protein trong DNT, DMP, DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính Pandy và Rivalta chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein tổng số trong các loại dịch chọc dò kể trên và đồng thời tiến hành xét nghiệm Pandy đối với DNT, xét nghiệm Rivalta với DMP và DMB

3.1.2 Kết quả định tính và định lượng protein trong DNT

Bảng 3.1 Định tính protein trong DNT bằng xét nghiệm Pandy

protein tổng số (g/l)

Kết quả phản ứng Pandy

Số mẫu dương tính

% dương tính

Số mẫu

âm tính

%

âm tính

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện kết quả xét nghiệm Pandy DNT

Kết quả phân tích hàm lượng protein và xét nghiệm Pandy 100 mẫu DNT

ở bảng 3.1 và hình 3.2 nhận thấy: Hàm lượng protein tổng số của các bệnh nhân lấy mẫu DNT phân tích dao động trong khoảng 0,1 g/l đến 8,6 g/l Các mẫu DNT phân tích cho kết quả cả dương tính và âm tính đối với xét nghiệm Pandy