Nghiên cứu tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống
bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế Trờng đại học y h nội *** Phạm Đăng Khoa Nghiên cứu Tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống Chuyên ngành: miễn dịch học Mã số: 3.01.09 Tóm tắt Luận án tiến sĩ y học Hà nội - 2006 Công trình đợc hoàn thành tại: Trờng Đại học Y H Nội Ngời hớng dẫn khoa học: GS. Vũ Triệu An Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hiển Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Văn Nguyên Phản biện 3: PGS.TS. Phan Quang Đoàn Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại: Trờng đại học Y H Nội Vào hồi: 14 giờ 00, ngày 27 tháng 10 năm 2006 Có thể tìm luận án tại: - Th viện Quốc gia. - Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội. - Th viện Thông tin Y học Trung ơng. 24 Chữ viết tắt bp (base pair): cặp bazơ CD (cluster of differentiation): cụm biệt hoá CD40L (CD40 ligand): phối tử của CD40 DNA (desoxyribonucleic acid): axit deoxyribonucleic ds DNA (double-stranded DNA): DNA xoắn kép HLA (human leukocyte antigen): kháng nguyên bạch cầu ngời IL (interleukin): interleukin MHC (major histocompatibility complex): phức hợp hoà hợp mô chủ yếu NA (neutrophil antigen): kháng nguyên bạch cầu hạt trung tính PCR (polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi do polymerase SLE (systemic lupus erythematosus): bệnh lupus ban đỏ hệ thống SNP (single nucleotide polymorphism): tính đa hình thái của nucleotide đơn TNF (tumor necrosis factor): yếu tố gây hoại tử u 1 đặt vấn đề Tự miễn là một trong ba nhóm bệnh lí miễn dịch, đợc đặc trng bởi sự xuất hiện các tự kháng thể chống lại các cấu thành của chính bản thân. Bệnh tự miễn đợc phân ra bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan và bệnh tự miễn toàn thân, trong đó lupus ban đỏ hệ thống (SLE) là một bệnh tự miễn toàn thân điển hình. Lịch sử nghiên cứu về các bệnh tự miễn nói chung và SLE nói riêng có thể đợc chia thành 3 giai đoạn: (1) phát hiện ra các tự kháng thể hoà tan; (2) phát hiện ra các tế bào T và B tự phản ứng; (3) phát hiện mối liên quan với cơ địa và các gen nhạy cảm. Việc phát hiện ra các tự kháng thể hoà tan rồi các tế bào T và B tự phản ứng đã phần nào hé mở cơ chế bệnh sinh của bệnh tự miễn. Nhng một vấn đề cơ bản vẫn cha đợc lí giải đầy đủ, đó là vì sao các tế bào T và B đã bất hoạt nay lại đợc hoạt hoá trở lại. Vì vậy một hớng nghiên cứu mới đợc đặt ra là tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh ở mức độ gen học. Cho tới nay, ở Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của tự kháng thể hoà tan và vai trò của các lympho bào tự phản ứng trong cơ chế bệnh sinh của SLE. Nhng cha có tác giả nào nghiên cứu về SLE ở mức độ gen học. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2 mục tiêu sau đây: 1. Mô tả tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm trong bệnh lupus ban đỏ hệ thống ở ngời Kinh Việt nam. 2. Nhận xét sự phân bố tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm ở bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống ngời Kinh Việt nam. 2 Đóng góp mới của luận án 1. Là nghiên cứu đầu tiên về cơ chế bệnh sinh của SLE ở mức độ gen học. 2. Lần đầu tiên đa ra những số liệu về typ gen và alen của HLA- DRB1, FcRIIA, FcRIIIA, FcRIIIB, C4A, TNFRII và IL-10 promoter ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam. 3. Lần đầu tiên đa ra nhận xét về mối liên quan giữa tính đa hình thái của các gen nêu trên với SLE ở ngời Việt nam. Cấu trúc của luận án Luận án dài 104 trang, ngoài phần Đặt vấn đề, Kết luận và Kiến nghị, gồm 4 chơng. Chơng 1: Tổng quan (33 trang); Chơng 2: Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu (17 trang); Chơng 3: Kết quả (18 trang); Chơng 4: Bàn luận (32 trang). Luận án có 124 tài liệu tham khảo, 4 phụ lục, 21 bảng, 11 biểu đồ và 9 hình. Chơng 1: tổng quan ti liệu 1.1. Bệnh tự miễn Bệnh tự miễn là một trạng thái bệnh lí do có sự kết hợp của tự kháng thể với tự kháng nguyên mà gây ra viêm và dẫn đến tổn thơng thực thể và chức năng tại tế bào, mô hay cơ quan. Hiện nay để chẩn đoán xác định bệnh tự miễn, ngoài những kĩ thuật kinh điển trong miễn dịch học, những kĩ thuật hiện đại trong sinh học phân tử đã đợc áp dụng. Điều này không những đã giúp cho việc chẩn đoán xác định đợc chính xác hơn mà còn cho phép đi sâu tìm hiểu về cơ chế bệnh sinh của bệnh. Những kĩ thuật đó là: - Kĩ thuật phát hiện tự kháng thể dịch thể trong máu. - Kĩ thuật sinh thiết kết hợp với kĩ thuật sinh học, bao gồm: + Kĩ thuật hoá mô miễn dịch. 3 + Kĩ thuật lai bằng DNA. + Kĩ thuật phân tích DNA bằng PCR. Cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn cho đến nay vẫn cha hoàn toàn đợc sáng tỏ. Dù sao trong cơ chế bệnh sinh của các tổn thơng trong bệnh tự miễn, ngời ta nói nhiều tới vai trò của các tự kháng thể, vai trò của các tế bào T tự phản ứng và vai trò của cơ địa. 1.2. Rối loạn miễn dịch trong bệnh SLE SLE là một bệnh tự miễn toàn thân điển hình. Cùng với sự phát triển của miễn dịch học, việc chẩn đoán và điều trị SLE cũng có nhiều tiến bộ trong mấy thập niên gần đây. Các xét nghiệm, đặc biệt là các xét nghiệm miễn dịch lâm sàng, đóng một vai trò cực kì quan trọng trong việc chẩn đoán và theo dõi SLE. Các xét nghiệm này nhằm phát hiện những kháng thể kinh điển và một số kháng thể khác mới đợc đề cập tới trong ít năm gần đây. Những nghiên cứu về phơng diện tự kháng thể hoà tan và tế bào tự phản ứng trong SLE đã phần nào làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của bệnh. Để có thể tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh ở mức độ phân tử, những khảo sát về gen học là hết sức cần thiết. 1.3. Gen học trong nghiên cứu SLE SLE là bệnh đa yếu tố và có đặc tính gen học phức tạp với sự tham gia của các gen thuộc phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (MHC) và nhiều gen khác không thuộc MHC. Các gen đã đợc biết trong bệnh này chỉ xác định tính nhạy cảm, không một gen riêng biệt nào là cần thiết hoặc đủ để làm xuất hiện bệnh. 1.3.1. Phơng pháp nghiên cứu về gen học. Bao gồm: - Phơng pháp điều tra tỉ lệ theo phả hệ, dịch tễ. - Phơng pháp nghiên cứu tính đa hình thái của gen nhạy cảm. Có 4 3 phơng pháp, đó là: nghiên cứu bệnh chứng dựa vào quần thể, phân tích sự liên kết dựa vào gia đình và phân tích sự mất cân bằng liên kết dựa vào gia đình. Nhờ các phơng pháp phân tích gen học nêu trên, những hiểu biết về vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE ngày một đầy đủ hơn. 1.3.2. Vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE 1.3.2.1. Vai trò của cơ địa trong SLE Cơ địa là tổng hợp tất cả các đặc điểm hình thái và chức năng của cơ thể, những đặc điểm đó khá bền vững, có tính di truyền và quyết định mức độ phản ứng của cơ thể trớc những yếu tố xâm nhập. Ngày nay, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực miễn dịch gen học, càng ngày ngời ta càng thấy rõ vai trò của cơ địa trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh, trong đó có các bệnh tự miễn nói chung và SLE nói riêng. Trong các locus gen tạo nên cơ địa của một cá thể, ngời ta nói nhiều tới vai trò của hệ thống MHC. Những mô tả đầu tiên về mối liên quan của các alen thuộc MHC lớp II với SLE đã đợc công bố khoảng 20 năm trớc đây. Những nhận xét này sau đó đã đợc xác nhận và thấy là HLA-DR2 và HLA-DR3 gây ra một cách riêng rẽ với nguy cơ tơng đối 2-3 lần cao hơn đối với sự xuất hiện SLE ở ngời Âu Mĩ. ở những bệnh nhân ngời Mĩ gốc Phi (là chủng ngời HLA-DR3 không phổ biến), HLA-DR2 và HLA- DR7 đợc thấy có liên quan với SLE. 1.3.2.2. Vai trò của đột biến gen trong SLE Tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE, ngoài vai trò cơ địa (hệ thống MHC) nh đã nói ở trên, trong những năm gần đây, ngời ta nói nhiều và tập trung tìm hiểu về vai trò của các gen nhạy cảm với bệnh. Đó là các gen mã cho các thành phần tham gia trong một số khâu then chốt thuộc cơ chế bệnh sinh của bệnh, ví dụ receptor với phần Fc của 5 IgG (FcR), các cấu thành của hệ thống bổ thể, các cytokin liên quan trong phản ứng viêm (TNF, IL-10 ). Khi các gen này có đột biến sẽ ảnh hởng tới chức năng các sản phẩm do chúng mã hoá và do vậy có ảnh hởng tới các bệnh có liên quan. *Mối liên quan của gen m hoá cho Fc R và SLE Receptor do các gen này mã hoá dùng để gắn phần Fc của IgG. Đó là các gen nằm trên nhiễm sắc thể 1q21-24 ở ngời. FcR đợc chia thành 3 nhóm: FcRI, FcRII và FcRIII. Các receptor này có chức năng quan trọng trong việc kết nối đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào bằng việc chuyển phức hợp miễn dịch tới các tế bào hiệu ứng. Vì vậy, tính đa hình thái đợc xác định về mặt gen học có ảnh hởng tới cấu trúc và chức năng của các FcR này có thể góp phần tạo nguy cơ đối với SLE. ở ngời, FcRII và FcRIII đợc chú ý nghiên cứu nhiều hơn vì đó là những receptor có ái lực cao đối với IgG. Cho tới nay, ngời ta đã xác định đợc 6 biến thể khác nhau của FcRII, chúng đợc mã hoá bởi 3 gen (FcRIIA, IIB và IIC) và 2 biến thể gần giống nhau của FcRIII (FcRIIIA và IIIB) đợc mã hoá bởi 2 gen khác nhau. Tính đa hình thái về gen chỉ đợc thấy ở các gen mã hoá cho FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB. FcRIIA đợc biểu lộ trên màng của tế bào mono, đại thực bào, bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu. FcRIIA có 2 alen biểu lộ đồng trội, đó là do FcRIIA có một thay đổi ở exon 4 (A hoặc G ở vị trí nucleotide 494) dẫn đến việc thay đổi 1 amino acid (Histidine [H] hoặc Arginine [R] ở vị trí amino acid 131). Alen FcRIIA-R131 gắn với IgG2 kém hiệu quả hơn so với alen H131, do vậy gây cản trở việc thanh thải phức hợp miễn dịch. 6 FcRIIIA đợc biểu lộ trên bề mặt tế bào NK và đại thực bào, có khả năng gắn với cả 2 dới lớp IgG1 và IgG3, giúp cho chức năng gây độc tế bào và thực bào. Tính đa hình thái thờng gặp nhất của FcRIIIA là một đột biến điểm với sự thay thế T cho G ở vị trí nucleotide 559 dẫn đến sự thay thế tơng ứng của Phenylalanine (F) cho Valine (V) ở vị trí 158. Tính đa hình thái này gây ra sự thay đổi về chức năng, cá thể đồng hợp V/V có khả năng gắn IgG1 và IgG3 tốt hơn cá thể đồng hợp F/F. FcRIIIB có hai dạng xác định bằng huyết thanh (NA1 và NA2) do có 5 điểm khác nhau về nucleotide (G/C, C/T, A/G, G/A và G/A lần lợt ở các vị trí nucleotide 141, 147, 227, 277 và 349) và dẫn đến 4 điểm khác nhau trong chuỗi amino acid (R/N, N/S, D/N và V/I lần lợt ở các vị trí amino acid 36, 65, 82 và 106; có một đột biến câm C/T- 147). Tính đa hình thái này có ý nghĩa đối với chức năng sinh lí, khả năng thực bào ở các cá thể có NA2 kém hơn ở các cá thể có NA1. *Mối liên quan của gen m hoá cho bổ thể và SLE Bổ thể bao gồm khoảng 20 protein huyết tơng có chức năng gây ra đáp ứng viêm, xử lí phức hợp miễn dịch và thải loại các vi khuẩn gây bệnh. Trong nhiều năm gần đây, ngời ta đã chú ý đến mối liên quan chặt chẽ giữa sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể đầu của con đờng đặc hiệu (C1, C4, C2) với sự xuất hiện của SLE. SLE xuất hiện ở gần 100% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C1 và C4, ở khoảng 30- 50% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C2. Cấu thành C4 đợc mã hoá bởi 2 gen, C4A và C4B. C4A null có liên quan với SLE ở một số tộc ngời khác nhau. Sự thiếu hụt thờng gặp nhất là hiện tợng xoá trên diện rộng (28kb) làm mất cả gen C4A và gen 21-OH. Sự thiếu hụt thờng gặp thứ hai là hiện tợng ken thêm vào 2 bp ở codon 1213 7 thuộc exon 29 dẫn đến việc tạo thành bộ ba mã hoá stop, làm ngừng quá trình tổng hợp chuỗi protein C4A. Sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể khác (từ C3 tới C9) ít liên quan đến SLE. *Mối liên quan của gen m hoá cho TNF và SLE Yếu tố gây hoại tử u (TNF) là yếu tố bảo vệ chống lại SLE. Chức năng của TNF thông qua 2 receptor: TNFRI và TNFRII, trong đó TNFRII liên quan nhiều tới SLE. Tính đa hình thái 2 alen dẫn đến sự thay đổi amino acid đã đợc thấy trong vùng exon 4 (sự thay đổi Arginine thành Proline ở vị trí 143), exon 6 (sự thay đổi Methionine thành Arginine ở vị trí 196) và exon 9 (sự thay đổi Alanine thành Threonine ở vị trí 363) của gen mã hoá cho TNFRII. Trong đó chỉ có tính đa hình thái ở exon 6 là có liên quan với SLE. *Mối liên quan của gen m hoá cho IL-10 và SLE Interleukin-10 (IL-10) là một cytokin điều hoà đợc tạo ra bởi tế bào T, tế bào B, tế bào mono, đại thực bào, tế bào sừng, tế bào bạch cầu ái toan, tế bào mast. IL-10 có vai trò điều hoà đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể. Tăng mức IL-10 đợc thấy có liên quan với một số bệnh tự miễn, trong đó có SLE. Tính đa hình thái của gen IL-10 thể hiện ở 2 dạng microsatellit (AC) n và thay đổi nucleotid đơn (SNP). Vùng promoter của gen IL-10 có 3 SNP đáng quan tâm ở các vị trí - 819 (C/T), -592 (C/A) và -1082 (G/A). Ngời ta đã nói đến mối liên quan giữa typ gen và sự sản xuất IL-10; đặc biệt alen G của tính đa hình thái G/A ở vị trí -1082 thấy có liên quan với kiểu hình sản xuất IL-10 cao so với alen A. Các SNP ở vị trí -819 và -592 xuất hiện [...]... quan giữa tính đa hình thái của FcRIIA với bệnh lupus ban đỏ hệ thống Tạp chí Y học thực hành, 11, tr 38-39 3 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An (2004) Mối liên quan của HLADR và bệnh lupus ban đỏ hệ thống Tạp chí Y học thực hành, 9, tr 54-55 4 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An (2004) Mối liên quan giữa tính đa hình thái của FcRIIIA và FcRIIIB với bệnh lupus ban đỏ hệ thống Tạp chí Y học thực hành, 9, tr 59-60... trong sự phân bố tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcRIIIA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng Vậy, phải chăng tính đa hình thái của gen mã hoá cho FcRIIIA không có vai trò trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam 4.2.3 Gen mã hoá cho FcRIIIB Tính đa hình thái của FcRIIIB có ý nghĩa đối với chức năng sinh lý, cá thể mang NA2 có khả năng thực bào kém hơn cá thể mang NA1 Kết quả nghiên cứu của. .. các bệnh tự miễn khác 2.1.2 Nhóm chứng Gồm 93 ngời cho máu tình nguyện tại Viện huyết học và Truyền máu TW, không mắc các bệnh tự miễn và một số bệnh khác có liên quan đến cơ địa, có sự phù hợp với nhóm bệnh về giới và tuổi 2.2 Phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp nghiên cứu là phơng pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang Phơng pháp khảo sát tính đa hình thái của các gen nhạy cảm là phơng pháp nghiên cứu bệnh. .. đổi cơ địa bằng truyền tế bào gốc là một vấn đề thời sự hiện nay, không những đợc áp dụng trong các bệnh tự miễn (trong đó có SLE) mà còn đợc áp dụng trong nhiều bệnh khác 23 Kết luận Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về phơng diện gen học trên bệnh nhân SLE ngời Kinh Việt nam cho phép rút ra một số kết luận nh sau 1 Tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm ở bệnh nhân SLE ngời Kinh Việt nam đợc... quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân SLE ngời Việt nam, không có sự khác biệt có ý nghĩa trong sự phân bố tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho TNFRII giữa nhóm bệnh và nhóm chứng Vậy, phải chăng tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII không có vai trò trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam 4.5 Gen mã hoá cho IL-10 promoter Tăng sản xuất IL-10 có thể tham gia trong cơ chế bệnh. .. hoạt tính tế bào B là khâu then chốt trong cơ chế bệnh sinh của SLE thông qua việc tăng sản xuất các tự kháng thể Vì vậy, tính đa hình thái của gen mã hoá cho IL-10 promoter có tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam 4.6 Bàn luận về sự phân bố tần suất khác nhau giữa các dân tộc Sự khác nhau trong các nghiên cứu trên có thể đợc lý giải theo một số cách nh sau Thứ nhất, SLE là một bệnh. .. tần suất alen 196R tăng một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng Trái lại, ngời ta không thấy sự khác biệt có ý nghĩa nào trong tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII ở hai nhóm bệnh và chứng ở ngời Tây ban nha, ngời Anh và ngời Hàn quốc Trong nghiên cứu này, khi khảo sát ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam chúng tôi cũng nhận thấy không có mối liên quan giữa tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với... kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy không có tình trạng thiếu hụt C4A do hiện tợng chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc exon 29 Vậy, phải chăng trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam không có vai trò của tình trạng thiếu hụt C4A 19 4.4 Gen mã hoá cho TNFRII Cho tới nay đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với bệnh SLE Khi khảo sát ở bệnh nhân... IL10 trong cơ chế bệnh sinh của SLE Trớc đây, ngời ta đã chỉ ra sự tăng một cách có ý nghĩa tần suất IL-10 G microsatellit nằm trong vùng promoter của gen mã hoá cho IL-10 ở bệnh nhân SLE ngời Italia Tơng tự nh vậy, ngời ta cũng nhận thấy có mối liên quan 20 giữa tính đa hình thái do thay đổi một nucleotid của gen mã hoá cho IL-10 promoter và bệnh nhân SLE ngời Mĩ gốc Phi Trái với kết quả nghiên cứu của. .. chung 4.2 Các gen mã hoá cho FcR Gần đây nhiều nghiên cứu đã nhận thấy tính đa hình thái của FcR có vai trò nh những yếu tố di truyền ảnh hởng đến tính nhạy cảm đối với SLE và nhiều bệnh tự miễn khác 4.2.1 Gen mã hoá cho FcRIIA FcRII ở ngời là một glycoprotein có khối lợng phân tử 40 kD, chỉ gắn IgG dới dạng phức hợp và có sự phân bố rộng rãi nhất trên bề mặt tế bào Cho đến nay, tính đa hình thái chỉ đợc . typ gen và alen của một số gen nhạy cảm trong bệnh lupus ban đỏ hệ thống ở ngời Kinh Việt nam. 2. Nhận xét sự phân bố tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm ở bệnh nhân lupus ban đỏ. Phạm Đăng Khoa Nghiên cứu Tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống Chuyên ngành: miễn dịch học Mã số: 3.01.09 Tóm tắt Luận án. với nhóm bệnh về giới và tuổi. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp nghiên cứu là phơng pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang. Phơng pháp khảo sát tính đa hình thái của các gen nhạy cảm là phơng