loại dịch
Sử dụng phƣơng pháp điện di biến tính (SDS-PAGE). Kỹ thuật SDS- PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 [39].
Nguyên tắc: Trong phƣơng pháp này, các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide ở nồng độ 12,6%. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc loại trừ.
Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein - SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc
vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành các băng, vạch khác nhau.
Thao tác kỹ thuật:
Mẫu DNT, DMP, DMB đƣợc tiến hành ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút để loại cặn tạp chất thu dịch nổi. Hút chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới. Mẫu dịch sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75o
C.
Đối với mẫu DNT, tiến hành tủa bằng aceton lạnh trong vòng 4 giờ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút để thu tủa và loại dịch nổi. Phần tủa chứa các protein đƣợc thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện di tiếp theo.
Đối với mẫu DMP và DMB tiếp tục đƣợc tiến hành thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein trong từng loại dịch. Các protein bền nhiệt từ hệ protein DMP, DMB đƣợc thu nhận lại theo phƣơng pháp của Goufman và cs năm 2006 [33].
Một thể tích (1V) đối với từng loại dịch đƣợc trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA pH 8,1; 0,2 M Tris-HCl pH 8,9; 7% (w/v) PEG 6000). Hỗn hợp đƣợc ủ 15 phút ở 98oC lắc 80 vòng/phút, 15 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó đƣợc ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch nổi chứa các protein bền nhiệt đƣợc thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện di tiếp theo.
Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE). Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970. Các thiết bị, hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với nồng độ 12,6%.
Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: 75V trong 30 phút và 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0,1% (v/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v)
methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy .
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần
Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6,8, 10 l 10% (w/v) SDS,
0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,6% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8,8, 45 l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED Đệm hòa mẫu 5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6,8
Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8,3