2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Khoa Sinh Hóa - Trung tâm kỹ thuật cao - Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108, Hà Nôi.
- Phòng Hóa sinh Protein - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
2.2.2. Thời gian nghiên cứu:
- Nghiêncứu đƣợc tiến hành từ 5/2012 đến 7/2013.
2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.3.1. Hóa chất 2.3.1. Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học phân tử và đƣợc sử dụng đúng theo những hƣớng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất. Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu
Hãng Hóa chất
Bio-Rad Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA)
Fermentas Thang protein chuẩn (Protein Marker # SM0431)
Sigma TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide, N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS)…
Merck Acetonitrile, muối NaCl...
2.3.2. Thiết bị
Máy sinh hóa tự động Olympus AU 400 và các trang thiết bị đi kèm tại Khoa Sinh Hóa - Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108.
Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE mua từ Bio-Rad (Hercules, CA, Mỹ). Các trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khác thuộc phòng Hóa sinh Protein - Viện Công nghệ Sinh học.
2.4.1. Định lƣợng protein trong dịch nghiên cứu
- Định lƣợng protein trong dịch huyết thanh, DMP, DMB
Nguyên tắc: Định lƣợng proten toàn phần theo phƣơng pháp so màu (phƣơng pháp biure). Protein trong dịch tác dụng với ion Cu2+
trong môi trƣờng kiềm tạo thành phức hợp màu xanh tím. Độ đậm màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dịch và đƣợc xác định trên máy sinh hóa tự động Olympus AU 400.
Protein + Cu2+ Phức hợp màu xanh tím
Tiến hành: Sử dụng mẫu huyết thanh kiểm tra chất lƣợng của Olympus để kiểm tra lại độ chuẩn xác của máy Olympus AU 400 2 lần trong ngày trên 2 mức (mức có giá trị bình thƣờng và mức có giá trị cao - bệnh lý). Xây dựng đƣờng chuẩn mới định kỳ sau thời gian 30 ngày hoặc khi sử dụng hóa chất mới. Mẫu dịch đã đƣợc bảo quản: DMP, DMB, dịch huyết thanh (chống đông bằng heparin hoặc Ethylendiamin Tetraacetic Acid ) đƣợc phân tích trên máy sinh hóa tự động Olympus AU 400 [2].
- Định lƣợng protein trong DNT
Nguyên tắc: Pyrogallol đỏ kết hợp với molypdate cho phức hợp có màu đỏ, phức hợp này kết hợp với các nhóm amin của phân tử protein tạo thành phức hợp có màu xanh tím.
Tiến hành:Sử dụng mẫu huyết thanh kiểm tra chất lƣợng của Olympus để kiểm tra lại độ chuẩn xác của máy Olympus AU 400 2 lần trong ngày trên 2 mức (mức có giá trị bình thƣờng và mức có giá trị cao - bệnh lý). Xây dựng đƣờng chuẩn mới định kỳ sau thời gian 90 ngày hoặc khi sử dụng hóa chất mới. Mẫu DNT đã đƣợc bảo quản đƣợc phân tích trên máy sinh hóa tự động Olympus AU 400 [2].
2.4.2. Định tính protein trong dịch nghiên cứu
Tiến hành xét nghiệm phản ứng Pandy đối với DNT, phản ứng Rivalta với DMP và DMB. Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu dịch nghiên cứu. Mẫu dịch đƣợc kết luận và đƣợc thống kê sử dụng trong nghiên cứu khi cả 3 lần lặp lại đều cho 1 kết quả (dƣơng tính hoặc âm tính).
- Phản ứng Pandy
Định nghĩa: Là phản ứng đánh giá sự rối loạn giữa tỷ lệ albumin và globulin trong DNT.
Nguyên lý: Khi lƣợng globulin trong DNT tăng sẽ bị kết tủa bởi thuốc thử Pandy (phenol bão hòa).
Chuẩn bị:
+ Dụng cụ: Lam kính, pipet nhỏ giọt, giá ống nghiệm, nền đen, ống nghiệm nhỏ, pipet 1ml, quả bóp.
+ Thuốc thử Pandy ( phenol bão hòa): Hòa tan 10 gam phenol (C6H5OH) trong 100 ml nƣớc cất. Lắc kỹ, để 2 - 3 ngày ở tủ ấm 37oC. Chuyển phần dịch trong sang 1 lọ khác để sử dụng.
Bệnh phẩm: DNT. Thao tác kỹ thuật:
Cho vào ống nghiệm nhỏ hoặc vào mặt lam kính 1ml thuốc thử Pandy, vài giọt DNT. Đọc trên nền đen:
+ Nếu hỗn hợp vẫn giữ nguyên màu trong suốt thì kết quả là âm tính. + Nếu có hiện tƣợng tủa khói trắng thì kết quả là dƣơng tính [2].
Định nghĩa: Phản ứng Rivalta là một trong những phản ứng dùng trong xét nghiệm sinh hoá để chẩn đoán phân biệt dịch với dịch tiết của một số loại dịch tràn nhƣ DMP, DMB.
Nguyên lý: Các dịch tiết có nhiều protein đặc biệt là fibrinogen bị kết tủa trong môi trƣờng acid acetic.
Thuốc thử: Acid acetic đậm đặc. Kỹ thuật tiến hành:
Cho vào cốc có chân hoặc ống đong 100 ml nƣớc cất, 1 giọt acid acetic đặc, trộn đều. Dùng pipet nhỏ nhẹ nhàng lên mặt dung dịch acid acetic vừa pha một vài giọt dịch chọc dò (DMP, DMB). Quan sát hiện tƣợng:
+ Nếu những giọt dịch chọc dò chìm xuống đáy cốc, vẩn đục trắng nhƣ khói thuốc lá thì phản ứng dƣơng tính.
+ Nếu dung dịch acid acetic vẫn trong thì phản ứng âm tính [2].
2.4.3. Điện di biến tính SDS-PAGE xác định sự đa hình protein trong từng loại dịch loại dịch
Sử dụng phƣơng pháp điện di biến tính (SDS-PAGE). Kỹ thuật SDS- PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 [39].
Nguyên tắc: Trong phƣơng pháp này, các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide ở nồng độ 12,6%. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc loại trừ.
Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein - SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc
vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành các băng, vạch khác nhau.
Thao tác kỹ thuật:
Mẫu DNT, DMP, DMB đƣợc tiến hành ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút để loại cặn tạp chất thu dịch nổi. Hút chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới. Mẫu dịch sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75o
C.
Đối với mẫu DNT, tiến hành tủa bằng aceton lạnh trong vòng 4 giờ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút để thu tủa và loại dịch nổi. Phần tủa chứa các protein đƣợc thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện di tiếp theo.
Đối với mẫu DMP và DMB tiếp tục đƣợc tiến hành thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein trong từng loại dịch. Các protein bền nhiệt từ hệ protein DMP, DMB đƣợc thu nhận lại theo phƣơng pháp của Goufman và cs năm 2006 [33].
Một thể tích (1V) đối với từng loại dịch đƣợc trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA pH 8,1; 0,2 M Tris-HCl pH 8,9; 7% (w/v) PEG 6000). Hỗn hợp đƣợc ủ 15 phút ở 98oC lắc 80 vòng/phút, 15 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó đƣợc ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch nổi chứa các protein bền nhiệt đƣợc thu nhận lại và sử dụng cho thí nghiệm điện di tiếp theo.
Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE). Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970. Các thiết bị, hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với nồng độ 12,6%.
Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: 75V trong 30 phút và 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0,1% (v/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v)
methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy .
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần
Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6,8, 10 l 10% (w/v) SDS,
0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,6% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8,8, 45 l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED Đệm hòa mẫu 5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6,8
Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8,3
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính và định lƣợng protein trong các dịch chọc dò nghiên cứu cứu
3.1.1. Thu nhận các loại dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu
Hình 3.1. Các mẫu dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu
Ghi chú: Mẫu 1: DMP; mẫu 2: DMB; Mẫu 3, 4: DNT
Đánh giá cảm quan các loại dịch trong nghiên cứu (hình 3.1) chúng tôi nhận thấy các mẫu DNT thu đƣợc không màu và trong suốt. Các mẫu DMP và DMB thu đƣợc thấy có màu vàng rơm đậm hoặc nhạt, trong suốt hoặc vẩn đục. Kết quả đánh giá cảm quan của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã công bố về các loại dịch trên của một số tác giả nhƣ Trịnh Bỉnh Dy và cs (2006) [6], Nguyễn Gia Bình (2010) [2], Balfe và cs (2009) [28].
Để xác định hàm lƣợng protein tổng số và tìm ra giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DNT, DMP, DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính Pandy và Rivalta chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng protein tổng số trong các loại dịch chọc dò kể trên và đồng thời tiến hành xét nghiệm Pandy đối với DNT, xét nghiệm Rivalta với DMP và DMB.
3.1.2. Kết quả định tính và định lƣợng protein trong DNT
Bảng 3.1. Định tính protein trong DNT bằng xét nghiệm Pandy
Mẫu bệnh phẩm Hàm lƣợng protein tổng số (g/l) Kết quả phản ứng Pandy Số mẫu dƣơng tính % dƣơng tính Số mẫu âm tính % âm tính DNT chung (n = 100) 0,1 - 8,6 69 69 31 31 DNT nhóm 1 (n = 31) 0,1 - 0,4 0 0 31 100 DNT nhóm 2 (n = 69) 0,5 - 8,6 69 100 0 0
Ghi chú: Nhóm chung: 100 mẫu DNT dùng trong nghiên cứu có hàm lượng protein 0,1 - 8,6 g/l; nhóm 1: Mẫu DNT có hàm lượng protein 0,1 - 0,4 g/l; nhóm 2: Mẫu DNT có hàm lượng protein 0,5 - 8,6 g/l.
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện kết quả xét nghiệm Pandy DNT
Kết quả phân tích hàm lƣợng protein và xét nghiệm Pandy 100 mẫu DNT ở bảng 3.1 và hình 3.2 nhận thấy: Hàm lƣợng protein tổng số của các bệnh nhân lấy mẫu DNT phân tích dao động trong khoảng 0,1 g/l đến 8,6 g/l. Các mẫu DNT phân tích cho kết quả cả dƣơng tính và âm tính đối với xét nghiệm Pandy.
Trong đó số mẫu cho kết quả âm tính là 31 mẫu chiếm 31%, số mẫu cho kết quả dƣơng tính là 69 mẫu chiếm 69%. Các mẫu DNT có hàm lƣợng protein tổng số từ 0,1 g/l đến 0,4 g/l là 31 mẫu và cả 31 mẫu (chiếm 100%) đều cho kết quả xét nghiệm Pandy âm tính. Các mẫu DNT có hàm lƣợng protein tổng số từ 0,5 g/l đến 8,6 g/l là 69 mẫu và cả 69 mẫu (chiếm 100%) đều cho kết quả xét nghiệm Pandy dƣơng tính.
Nhƣ vậy, nhận thấy các mẫu DNT nghiên cứu có hàm lƣợng protein khá đa dạng, khoảng giá trị hàm lƣợng protein tƣơng đối rộng, lƣợng mẫu cho kết quả âm tính và dƣơng tính Pandy khá lớn hoàn toàn phù hợp cho nghiên cứu nhận định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DNT.
Bảng 3.2. Định lƣợng protein trong các mẫu DNT nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm Đơn vị Hàm lƣợng X SD HTNBT - ĐC X SD p/ĐC DNT chung (n = 100) g/l 1,138 1,411 76,090 3,959 < 0,05 DNT nhóm 1 (Pandy âm tính) (n = 31) g/l 0,332 0,065 76,090 3,959 < 0,05 DNT nhóm 2 (Pandy dƣơng tính) (n = 69) g/l 1,500 1,385 76,090 3,959 < 0,05
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện hàm lƣợng protein trong DNT
Kết quả từ bảng 3.2 và hình 3.3 nhận thấy hàm lƣợng protein tổng số trong DNT của các bệnh nhân mắc bệnh về não và tủy sống nghiên cứu tƣơng đối cao. Trung bình trong 100 mẫu DNT nghiên cứu thì hàm lƣợng protein tổng số là 1,138 g/l. Các mẫu DNT cho xét nghiệm Pandy âm tính có hàm lƣợng protein trung bình là 0,332 g/l, các mẫu cho xét nghiệm Pandy dƣơng tính có hàm lƣợng protein trung bình là 1,5 g/l. Hàm lƣợng protein trong các mẫu DNT dƣơng tính Pandy cao hơn 4,52 lần so với trong các mẫu xét nghiệm Pandy âm tính và cao hơn 1,32 lần so với các mẫu DNT chung.
Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy hàm lƣợng protein tổng số trong DNT của các bệnh nhân nghiên cứu cao hơn so với các số liệu đã công bố trƣớc đây về protein trong DNT ngƣời thƣờng. So với hàm lƣợng protein trong DNT ngƣời bình thƣờng của một số tác giả khác đã nghiên cứu nhƣ Trịnh Bỉnh Dy và cs (2006) [6], Phan Hải Nam (2006) [17] thì hàm lƣợng protein trong DNT nghiên cứu cao hơn từ 2,53 đến 5,69 lần. Điều này chứng tỏ khi cơ thể biểu hiện các trạng thái bệnh lý của các bệnh về não và tủy sống thì hàm lƣợng protein tổng số trong DNT sẽ thay đổi (tăng) so với khi cơ thể ở trạng thái bình thƣờng.
Khi so sánh hàm lƣợng protein trong DNT nghiên cứu với hàm lƣợng protein trong dịch huyết thanh ngƣời bình thƣờng nhận thấy hàm lƣợng protein
trong huyết thanh cao hơn rất nhiều so với trong DNT. Cụ thể cao hơn DNT chung 66,86 lần, cao hơn DNT âm tính Pandy 229,19 lần, cao hơn DNT dƣơng tính Pandy 50,73 lần. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein tổng số đối với DNT đƣợc nhận định từ hai bảng trên (bảng 3.1 và bảng 3.2) nhƣ sau: Hàm lƣợng protein tổng số ≤ 0,4 g/l cho kết quả phản ứng Pandy âm tính. Hàm lƣợng protein tổng số ≥ 0,5 g/l cho kết quả phản ứng Pandy dƣơng tính. Đây là kết luận nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho kết quả của phản ứng Pandy trong xét nghiệm lâm sàng.
3.1.3. Kết quả định tính và định lƣợng protein trong DMP
Bảng 3.3. Định tính protein trong DMP bằng xét nghiệm Rivalta
Mẫu bệnh phẩm Hàm lƣợng protein tổng số (g/l) Kết quả phản ứng Rivalta Số mẫu dƣơng tính % dƣơng tính Số mẫu âm tính % âm tính DMP chung (n = 100) 7 - 86 67 67 33 33 DMP nhóm 1 (n = 33) 7 - 24 0 0 33 100 DMP nhóm 2 (n = 67) 25 - 86 67 100 0 0
Ghi chú: Nhóm chung: 100 mẫu DMP dùng trong nghiên cứu có hàm lượng protein 7 - 86 g/l; nhóm 1: Mẫu DMP có hàm lượng protein 7 - 24 g/l; nhóm 2: Mẫu DMP có hàm lượng protein 25 - 86 g/l.
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện kết quả xét nghiệm Rivalta DMP
Kết quả phân tích hàm lƣợng protein và xét nghiệm Rivalta 100 mẫu DMP (bảng 3.3 và hình 3.4) nhận thấy: Hàm lƣợng protein tổng số của các bệnh nhân lấy mẫu DMP phân tích dao động trong khoảng 7,0 g/l đến 86 g/l. Các mẫu DMP phân tích cho kết quả cả dƣơng tính và âm tính đối với xét nghiệm Rivalta. Trong đó số mẫu cho kết quả âm tính là 33 mẫu chiếm 33%, số mẫu cho kết quả dƣơng tính là 67 mẫu chiếm 67%. Các mẫu DMP có hàm lƣợng protein tổng số từ 7 g/l đến 24 g/l là 33 mẫu và cả 33 mẫu (chiếm 100%) đều cho kết quả xét nghiệm Rivalta âm tính. Các mẫu DMP có hàm lƣợng protein tổng số từ 25 g/l đến 86 g/l là 67 mẫu và cả 67 mẫu (chiếm 100%) đều cho kết quả xét nghiệm Rivalta dƣơng tính.
Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy các mẫu DMP nghiên cứu có hàm lƣợng protein khá đa dạng, khoảng giá trị hàm lƣợng protein tƣơng đối rộng, lƣợng mẫu cho kết quả âm tính và dƣơng tính Rivalta khá lớn hoàn toàn phù hợp cho nghiên cứu nhận định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DMP.
Bảng 3.4. Định lƣợng protein trong các mẫu DMPnghiên cứu Mẫu bệnh phẩm Đơn vị Hàm lƣợng X SD HTNBT - ĐC X SD p/ĐC