Nghiên cứu ứng dụng phương pháp trung hoà vi rút trên môi trường tế bào BHK 21 trong giám sát huyết thanh sau tiêm phòng vacxin LMLM vô hoạt type o chủng myanma

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ANH “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH SAU TIÊM PHÒNG VACXIN LMLM VÔ HOẠT TYPE O CHỦNG MYANMA 98/BY/2010” LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ANH “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH SAU TIÊM PHÒNG VACXIN LMLM VÔ HOẠT TYPE O CHỦNG MYANMA 98/BY/2010” LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP Mã số: 60.62.50 Chuyên ngành: Thú y Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hữu Nam Hà Nội, 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii Lời cam ñoan Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép của ai. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của luận văn. Tác giả luận văn Nguyễn Quang Anh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii Lời cảm ơn Luận văn này là kết quả của quá trình học tập tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và quá trình công tác của bản thân tại Cục Thú y trong các năm qua. Với tình cảm chân thành, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô giáo đã tham gia giảng dạy lớp cao học khoá 19 chuyên ngành Thú y, đến Viện đào tạo sau Đại học của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đến lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ công nhân viên của Trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tác giả trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài luận văn này. Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tác giả nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh luận văn. Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhưng chắc chắn luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được nhận những ý kiến đóng góp bổ sung của quý thầy cô cùng các đồng nghiệp. Hà Nội, tháng 10 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Quang Anh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv Mụ c lục PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 1.3. Mục tiêu của đề tài 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Những hiểu biết về bệnh Lở mồm long móng 3 2.1.1. Khái niệm bệnh Lở mồm long móng 3 2.1.2. Lịch sử bệnh Lở mồm long móng 3 2.1.3. Loài vật mắc bệnh 8 2.1.4. Lứa tuổi 8 2.1.5. Khả năng lây lan 9 2.1.6. Tỷ lệ ốm và chết 9 2.1.7. Triệu chứng - bệnh tích 10 2.1.8. Phòng bệnh 14 2.2. Những hiểu biết về vi rút gây bệnh Lở mồm long móng 16 2.2.1. Hình thái, kích thước của vi rút 16 2.2.2. Cấu tạo của vi rút 16 2.2.3. Phân loại vi rút 17 2.2.4. Đặc tính nuôi cấy của vi rút 18 2.2.5. Sức đề kháng của vi rút 19 2.2.6. Chất chứa vi rút 19 2.2.7. Cách sinh bệnh 20 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 2.2.8. Phân bố serotype vi rút LMLM trên thế giới 20 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh 22 2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng 22 2.3.2. Chẩn đoán vi rút học 22 2.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học 23 2.3.4. Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 26 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Đối tượng, máy móc, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 27 3.1.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 27 3.1.2. Máy móc, dụng cụ, hóa chất và nguyên liệu 27 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29 3.2.1. Nội dung nghiên cứu 29 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 37 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1. Thiết lập phương pháp trung hòa kháng thể LMLM trên môi trường tế bào BHK- 21……… 38 4.1.1. Nhân giống vi rút type O chủng Myanma 98-like 38 4.1.2. Chuẩn độ 2 giống vi rút type O chủng Myanma 98- like 40 4.1.3. Kết quả thiết lập thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào BHK-21 43 4.2. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nam Định bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 47 4.2.1 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin 47 4.2.2 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phòng vacxin 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi 4.3. Kết quả kiểm tra tỷ lệ bảo hộ của kháng của tỉnh Lào Cai bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 51 4.3.1 Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin 51 4.3.2. Kết quả kiểm tra sau khi tiêm phòng vacxin 53 4.4.1. Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin 55 4.4.2. Kết quả kiểm tra sau khi tiêm phòng vacxin 56 4.5. So sánh phương pháp trung hòa vi rút với phương pháp ELISA 59 4.5.1. Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp trung hòa vi rút LMLM trên tế bào… 59 4.5.2. So sánh kết quả kiểm tra kháng thể của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 60 4.5.3. So sánh thời gian xét nghiệm của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 63 4.5.4. So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 65 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 5.1. Kết luận 67 5.2. Đề nghị 68 PHỤ LỤC 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii Danh mục các chữ viết tắt BHK 21 Baby Hamster Kidney 21 B-ME B-Mercaptoethanol BSC Bio Safety Cabinet CEF Chicken Embryo Fibroblast CPE Cyto Pathic Effect CQTY Cơ Quan Thú y DMSO Dimethylsulfoxide DNA Dinucleotide Acid dNTP DeoxyriboNucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Emzyme - Linked Immunosorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization FCS Foetal Cafl Serum FMD Foot and Mouth Disease FMDV Foot and Mouth Disease Virus GSO General Statistics Office HGKT Hiệu giá kháng thể KHKT Khoa Học Kỹ Thuật LMLM Lở Mồm Long Móng MDBK Madin-Darby Bovine Kidney MEM Minimum Essential Medium MHC-II Major Histocompatibility Complex class II OIE International Office des Epizootics (nay là World Organisation for Animal Health) OPD Ortho- Phenylenediamine PBS Phosphate Buffer Saline RNA Ribonucleotide Acid RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TTCĐTYTƯ Trung tâm Chẩn đoán Thú y TƯ Vero Verda Reno - tế bào thận khỉ xanh châu Phi VNT Virus Neutralization Test Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii VP1 Varial Protein 1 WTO World Trade Organization µ micro g gram l lít M mol ml millilít N Đương lượng gram UI Đơn vị quốc tế (International Unit) ρ picro Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix Danh mục các bảng Bảng 4.1: Kết quả đánh giá hai giống vi rút 39 Bảng 4.2: Kết quả sau 3 lần chuẩn độ trên tế bào BHK-21 41 Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra đối chứng chuẩn và huyết thanh bằng phương pháp trung hòa 45 Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa tại Nam Định 48 Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 50 Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng 52 Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai 53 Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 55 Bảng 4.9: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 57 Bảng 4.10: Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp trung hòa tế bào 59 Bảng 4.11: Kết quả so sánh tại 3 tỉnh bằng 2 phương pháp trung hòa trên tế bào và ELISA 60 Bảng 4.12: Thời gian xét nghiệm mẫu của phương pháp trung hòa 63 Bảng 4.13: Chi phí xét nghiệm 1 mẫu huyết thanh của phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 65 [...]... bò ho c c a l n, ho ccác dòng t b o m n c m như t b o BHK (Baby Hamster Kidney) Sau khic y vi rút LMLM v o các môi trư ng t b o nói trên, ñ t m 370C trongkho ng 24-72 gi , vi rút s làm hu ho i t b o nuôi Phòng thí nghi m thamchi u LMLM Pirbright năm 1973 ñã nuôi c y 140 ch ng vi rút LMLM, kho ng 120 ch ng ñã sinh trư ng trong môi trư ng BHK2 1 Hi n nay môitrư ng này thư ng ñư c s d ng ñ phân l p vi rút. .. kháng th LMLM sau tiêm phòng b ng phương pháp ELISA và trung hòa trên t b o t i Nam ð nh 50 Bi u ñ 4.3: K t qu ki m tra kháng th LMLM trư c tiêm phòng b ng phương pháp ELISA và trung hòa trên t b o t i L o Cai 52 Bi u ñ 4.4: K t qu ki m tra kháng th LMLM sau tiêm phòng b ng phương pháp ELISA và trung hòa trên t b o t i L o Cai 54 Bi u ñ 4.5: K t qu ki m tra kháng th LMLM trư c tiêm phòng. .. FAO: http://www.fao.org/corp/google_result/en/?cx=018170620143701104933%3Aqq82jsfba7w&q=FMD+stituation+map+2008&cof=FORID%3A9&x=12&y=7#1247) Hình 2.6: S ph n b các type huy t thanh vi rút LMLM trên th gi i Vi rút LMLM type O xu t hi n nhi u nh t khu v c ðông Nam Á: Malaysia, L o, Vi t Nam, Philippin, H ng Kông, Myanmar và Thái Lan do vi rút LMLM type Asia1 cũng ñư c b o c o d ch Iran, Afganistan, Georgia,... y vi- rút LMLM Lư i bò ph i ñư c l y ngay sau khi m bò, gi l nh nhi t ñ 2 -30C và ch s d ng ñư c trong vòng 8 ngày .Phương pháp này cho k t qu t t nh t, ñ c l c c a vi- rút v n cao ñ i v i bò và ñ ng v t thí nghi m sau nhi u l n ti p ñ i Do ñó phương pháp này thư ng ñư c dùng ñ ch v c-xin vô ho t - Ngoài các phương pháp trên, có th nuôi c y trên môi trư ng t b o. T t nh t là t b o th n bê ho c c u non,... y vi rút trên môi trư ng t b o Các t b o nh y c mv i vi rút LMLM bao g m t b o tuy n giáp tr ng sơ c p c a bò, t b o th nsơ c p c a c u, bê ho c l n, các t b o dòng, như t b o th n chu t Hamsternon (Baby Hamster Kidney- BHK) N u b nh ph m có vi rút LMLM, sau khigây nhi m 24 gi s th y b nh tích t b o Ngoài ra, có th tiêm huy n d ch b nh ph m c n ch n o n v o n i bìlư i bò ho c da gan bàn chân chu t... phèn + Vacxin vô ho t nuôi c y trên môi trư ng t b o Các lo i vacxin LMLM hi n dùng Vi t Nam T i Vi t Nam hi n ñang s d ng 2 lo i vacxin ñơn giá và ña giá nh p t các nư c là Merial (Pháp) và Intervet (Hà Lan), Trung Qu c (vacxin vô ho t type O) , Nga, n ð (Posi-FMD) Intervet gi i thi u Vi t Nam hai lo i vacxin LMLM có tên thương m i là DECIVAC- FMD- ALSA (dùng cho thú nhai l i) và DECIVAC- FMD- DOE (dùng... ñ c l c, clorofoc 1% sau 20 ngày vi- rút v n còn ñ c l c Vì th ph i dùng nh ng ch t sát trùng m nh, xút 1% di t vi- rút trong 1 - 10 phút, t t nh t là dùng nư c vôi tôi 5 - 10%, formôn 2% di t trong 6 gi 2.2.6 Ch t ch a vi rút Trong cơ th c a ñ ng v t m c b nh, vi rút ñư c phân b trong các b nh tích ñ c hi u, các m n nư c, trong d ch lâm ba không màu ho c màu vàng nh t c a m n nư c và trong các màng... chóng Vi c tìm ra kháng th ñ c hi u gia súc chưa ñư c tiêm phòng v c-xin LMLM ñ cơ s k t luân là con v t có b nh Kháng nguyên là vi- rút LMLM chu n nuôi c y trên môi trư ng IB-RS-2, BHK- 21, t b o th n l n ho c th n c u và gây b nh tích t b o Kháng th nghi là huy t thanh c a gia súc nghi m c b nh ñư c x lý nhi t ñ 560C trong 30 phút Ph n ng trung hòa vi- rút ñư c th c hi n trên môi trư ng t b o IB-RS-2, BHK- 21, ... ph thu c v o loài ñ ng v t, li u vi rút, ñư ng truy n và type vi rút, trong m t s trư ng h p có th k o dài 2- 10 ngày Vi rút LMLM có tính hư ng thư ng bì, sinh s n ch y u trong các t b o thư ng bì, ñ c bi t là nh ng t b o thư ng bì non Khi vi rút xâm nh p v o cơ th , trư c tiên nó nhân lên trong l p thư ng bì c a nơi xâm nh p (l p thư ng bì c a ng tiêu hóa, c a da, ), gây thu thũng các t b o thư ng bì... Phòng b nh b ng vacxin - ð i v i b nh LMLM ñ n nay ngư i ta ch s d ng vacxin vô ho t (Nguy n Như Thanh, 2001) - Vi rút LMLM có nhi u type và subtype, có kh năng ñ t bi n m nh và không gây mi n d ch ch o nên ch ng vi rút dùng s n xu t vacxin ph i phù h p v i ch ng vi rút gây b nh trên th c ñ a thì vi c tiêm phòng m i có hi u qu Sau khi tiêm vacxin m c ñ b o h t t nh t thư ng ñư c ghi nh n bò là t 21- 28 . GI O DỤC VÀ Đ O T O TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ANH “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ B O BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH. GI O DỤC VÀ Đ O T O TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ANH “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ B O BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH. sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế b o tại L o Cai 53 Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế b o tại Nghệ