Nhằm ựạt ựược các mục tiêu ựã ựề ra, thiết kế nghiên cứu tập trung vào các nội dung sau:
1. Thiết lập phương pháp trung hòa kháng thể LMLM trên môi trường tế bào BHK-21:
- Nhân giống vi rút type O chủng Myanma 98-like
- Chuẩn ựộ 2 giống vi rút type O chủng Myanma 98- like
- Kết quả thiết lập thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào BHK-21 2. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nam định bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
- Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin - Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phòng vacxin
3. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh LàoCai bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
- Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin - Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phòng vacxin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
4. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nghệ An bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
- Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin - Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phòng vacxin 5. So sánh phương pháp trung hòa vi rút với phương pháp ELISA
- Kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phương pháp trung hòa vi rút LMLM trên tế bào
- So sánh kết quả kiểm tra kháng thể của 2 phương pháp trung hòa và ELISA
- So sánh thời gian xét nghiệm của 2 phương pháp trung hòa và ELISA - So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trung hòa và ELISA
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1.Nuôi cấy giống vi rút LMLM type O ựược phân lập tại Việt Nam
- Lựa chọn và xử lý lọc qua màng lọc mẫu bệnh phẩm lợn và mẫu bệnh phẩm trâu bò dương tắnh với vi rút LMLM type O trong các ổ dịch LMLM nổ ra vào cuối năm 2010 và 2011 ựã ựược xác ựịnh bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên với OD > 0,5.
- Chuyển 1ml huyễn dịch bệnh phẩm ựã lọc ở trên vào chai tế bào (T25) ựã có tế bào mọc ựạt 90% hoặc ựĩa 6 giếng, 0,5ml/ giếng với ựĩa 24 giếng.
- Ủ ở nhiệt ựộ 37oC/60 phút, sau cho dung dịch MEM (EagleỖs) không có huyết thanh thai bê nuôi tiếp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
- Theo dõi kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE: Cytopathic Effect) hàng ngày sau khi nhiễm vi rút bằng kắnh hiển vi quang học. Khi có CPE ựạt mức 3+++ (tế bào co tròn và bong tróc ra hết) thì thu hoạch vi rút bằng cách ựông tan chai T25 rồi hút hết dung dịch trong chai.
- Gửi mẫu vi rút phân lập ở trên ựến phòng tham chiếu Pirbright giải mã gien và xác ựịnh ựây là vi rút LMLM type O có cấu tạo giống vi rút LMLM type O chủng Myanma 98. Những vi rút này ựược gọi tên là FMD-10-34, gây bệnh trên trâu bò và FMD-11-07, gây bệnh trên lợn.
3.2.2.2. Chuẩn ựộ vi rút xác ựịnh liều TCID50
-Chuẩn bị 8 ống eppendorf vô trùng có chứa môi trường nuôi cấy MEM có 5% FCS với lượng 900 ộl/ống, ựánh dấu từ 10-1 ựến 10-8
-Lấy 100 ộl dung dịch vi rút cần chuẩn ựộ cho vào ống thứ nhất có chứa 900 ộl môi trường MEM có 5% FCS, trộn ựều, rồi bỏ ựầu tắp pipet ựi. Nồng ựộ vi rút 10-1 ựược chuẩn bị.
- Pha loãng nồng ựộ vi rút theo cơ số 10 từ nồng ựộ 10-1 ựến 10-8
- Chuyển 100 ộl dung dịch vi rút mỗi nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-8 vào mỗi hàng trên ựĩa tế bào 96 giếng ựáy bằng ở vị trắ các giếng từ A1 ựến A10.
Các giếng ựối chứng tế bào là 2 cột 11 và 12 cho 100 ộl môi trường nuôi cấy MEM có 5% FCS
-Cho 100 ộl tế bào BHK-21 có nồng ựộ5x105 tế bào/ml vào tất cả các giếng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
- Ủ ựĩa chuẩn ựộ vi rút ở 370C với 5% CO2 trong 5 ngày và soi ựĩa hàng ngày ựể xác ựịnh bệnh tắch tế bào ở các giếng
- Tắnh toán lượng vi rút chuẩn ựộ trong 100 ộl bằng công thức Reed và Muench. a a b B A A TCID ừ − + − − = 50 ( ) 50 Trong ựó:
A là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát trên 50%, tắnh bằng phần trăm (%); B là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát dưới 50%, tắnh bằng phần trăm (%); a là nồng ựộ pha loãng tại A;
b là nồng ựộ pha loãng tại B.
3.2.2.3. Phương pháp trung hòa trên tế bào a) Chuẩn bị mẫu huyết thanh
-Xử lý diệt bổ thể: lắc mẫu huyết thanh bằng máy vortex, ly tâm ở 10000 vòng/10 phút ựể loại bỏ các chất cặn bẩn và vi trùng(nếu có).
- Diệt bổ thể bằng cách ủ mẫu huyết thanh ở 560C trong 30 phút. Sau ựó ựể vào tủ -700C ựể diệt nốt vi trùng còn sót lại. Khi nào sử dụng thì ựem ựông tan và ly tâm lại 10000 vòng/10 phút.
b) Tiến hành trung hòa:tỷ lệ pha loãng ban ựầu là 1/4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
+ Cho 75 ộlmôi trường nuôi cấy MEM có 5% FCS vào tất cả các giếng của cột ựầu tiên của ựĩa tế bào 96 giếng ựáy bằng.
+ Nhỏ 50ộlmôi trường nuôi cấy MEM có 5% FCS vào tất cả các giếng còn lại của ựĩa tế bào.
+ Nhỏ 25 ộlmỗi mẫu huyết thanh cần xác ựịnh hiệu giá vào cột ựầu tiên theo thứ tự bố trắ thắ nghiệm. Trộn ựều và pha loãng theo cơ số 2 ựến hết hàng.
* đĩa ựối chứng:
+ Mẫu huyết thanh ựối chứng dương và mẫu huyết thanh ựối chứng âm cũng pha loãng như mẫu huyết thanh xét nghiệm: Hàng A nhỏ ựối chứng dương, hàng B nhỏ ựối chứng âm với lượng 50 ộl/giếng
+ Hàng C nhỏ 100 ộl môi trường MEM 5% FCS làm ựối chứng tế bào + Hàng D nhỏ 100 ộl môi trường MEM 5% FCS làm ựối chứng môi trường.
+ Từ hàng E ựến hàng H ựể chuẩn ựộ ngược vi rút ở các nồng ựộ 100 ựến 10-3 với lượng 100 ộl vi rút/giếng.
- Nhỏ 50 ộl vi rút liều 100 TCID50vào tất cả các giếng ở cả ựĩa huyết thanh và ựĩa ựối chứng trừ hàng D, C, E, F, G, H ở ựĩa ựối chứng là không nhỏ
- Ủ trong tủ ấm 370C có 5% CO2 trong 1 giờ
- Sau ựó nhỏ 100 ộl dung dịch tế bào BHK-21 có nồng ựộ 5x105 tế bào/ml vào tất cả các giếng trừ hàng D ở ựĩa ựối chứng. đem ủ ựĩa trong tủ ấm 370C có 5% CO2 từ 2-3 ngày. Hàng ngày ựem ựĩa ra quan sát dưới kắnh hiển vi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
-đến ngày thứ 3 ựổ bỏ dung dịch trong ựĩa, fix ựĩa bằng 100 ộldung dịch muối ựệm 10% formol và 0,05% methylene blue trong 30 phút.
- đổ bỏ dung dịch fix, quan sát kết quả dưới kắnh hiển vi ựảo chiều: giếng dương tắnh bắt màu xanh, giếng âm tắnh trống rỗng không bắt màu.
- đánh giá kết quả mẫu huyết thanh:
+ Mẫu huyết thanh dương tắnh ựạt hiệu giá ≥ 1/32 tức là tại giếng có ựộ pha loãng sau trung hòa là 1/32 vẫn quan sát thấy màu xanh.
+ Mẫu huyết thanh âm tắnh ựạt hiệu giá <1/32.
3.2.2.4. Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng LP-ELISA
- Gắn ựĩa: Kháng huyết thanh thỏ ựược pha loãng bằng dung dịch gắn với tỷ lệ 1/1000. Nhỏ vào mỗi giếng trong ựĩa 96 giếng 50 ộl kháng huyết thanh thỏ ựã pha loãng. đậy nắp và ựể qua ựêm ở nhiệt ựộ 40C (hoặc ở 370C trong 1h)
- Pha lỏng (liquid phase): ựây thực chất là pha trung hòa huyết thanh
+ Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo cơ số 2 trên ựĩa 96 giếng ựáy chữ U, bắt ựầu từ ựộ pha loãng 1/16 ựến 1/256. Mỗi giếng 50 ộl.
+ Pha loãng kháng nguyên vi rút LMLM (theo nồng ựộ tối ưu ựã biết hoặc ựã chuẩn ựộ trước khi làm LP- ELISA). Nhỏ 50 ộl kháng nguyên ựã pha loãng vào tất cả các giếng của ựĩa chữ U. đậy nắp ựĩa, ựể ở nhiệt ựộ 40C qua ựêm; trong mỗi ựĩa ựều có ựối chứng dương tắnh mạnh, ựối chứng dương tắnh yếu, ựối chứng âm tắnh và ựối chứng kháng nguyên Ca (không có huyết thanh, chỉ có kháng nguyên và PBST).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
+ Chuyển hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên tới ựĩa ELISA: rửa ựĩa phản ứng ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa. Sau khi rửa ựĩa, chuyển 50 ộl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ ựĩa ựáy chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trắ tương ứng.
+ Nhỏ kháng thể phát hiện: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi giếng của ựĩa ELISA 50 ộl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút LMLM ựã ựược pha loãng với tỷ lệ 1/100 bằng PBST bổ sung sữa tách bơ. đậy ựĩa, ủ ở nhiệt ựộ 370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
+ Nhỏ conjugate: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl conjugate ựã pha loãng 1/200. đậy ựĩa, ủ ở nhiệt ựộ 370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
+ Thêm Substrate/chromogen: Rửa ựĩa 3 lần, chuẩn bị dung dịch Substrate/chromogen (dung dịch OPD trong citrate acetate buffer bổ sung 0,5% H2O2), nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl, ựể phản ứng xảy ra trong 20-30 phút ở chỗ tối tại nhiệt ựộ phòng (nếu ựể quá lâu hoặc ựể ra chỗ có ánh sáng màu sẽ xuất hiện nhanh và làm sai lệch kết quả).
+ Ngừng phản ứng: Nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 1,25M.
+ đọc kết quả: Sử dụng máy ựọc ELISA (photo meter, Lab system Multiscan Plus II) ở bước sóng 492 nm.
- Tắnh kết quả: Từ kết quả ựọc ựược ở máy ta có ựậm ựộ quang học OD (optical density) của mẫu huyết thanh. Từ OD ta tắnh ựược phần trăm ức chế của mẫu PI (percentage inhibition). Dựa vào PI ựể ựánh giá kết quả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là dương tắnh, kết luận trong kiểm tra có kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là âm tắnh, kết luận trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể LMLM.
3.2.2.5. Phương pháp kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán
Dùng công thức bảng 2x2
Phương pháp chuẩn ELISA Dương tắnh Âm tắnh
Dương tắnh a b
Phương pháp trung hòa
Âm tắnh c d
- đánh giá ựộ nhạy của 1 phương pháp dựa trên những mẫu ựã ựược kiểmtra là dương tắnh chuẩn. Công thức tắnh:
- đánh giá ựộ ựặc hiệu của 1 phương pháp dựa trên những mẫu ựã ựược kiểm tra là chuẩn âm tắnh. Công thức tắnh:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37