2.3.3.1. Phản ứng trung hoà vi rút
Phản ứng này dùng chẩn ựoán các trường hợp bị bệnh nhẹ, không ựiển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh ựể tìm kháng thể. Phản ứng này rất ựặc hiệu, nhạy và nhanh chóng. Việc tìm ra kháng thể ựặc hiệu ở gia súc chưa ựược tiêm phòng vắc-xin LMLM ựủ cơ sở kết luân là con vật có bệnh.
Kháng nguyên là vi-rút LMLM chuẩn nuôi cấy trên môi trường IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu và gây bệnh tắch tế bào. Kháng thể nghi là huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh ựược xử lý ở nhiệt ựộ 560C trong 30 phút.
Phản ứng trung hòa vi-rút ựược thực hiện trên môi trường tế bào IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu ựược nuôi trong các ựĩa nhựa giếng nhỏ ựáy bằng. để xác ựịnh type gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào 7 ống nghiệm, sau ựó cho vào ống nghiệm từng type vi-rút LMLM ựã biết với hiệu giá vi-rút ựã ựược xác ựịnh là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương ựương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 370C trong khoảng 1 giờ ựể kháng nguyên và kháng thể tác ựộng vào nhau. Sau ựó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy giếng nhựa ựã nuôi cấy tế bào, ựồng thời các giếng ựối chứng âm không cấy hỗn dịch mà ựể tế bào tiếp tục phát triển và các giếng ựối chứng dương cấy các type vi-rút LMLM tiếp tục ựể tủ ấm 370C trong vòng 2-3 ngày.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24
đọc kết quả, nếu giếng ựĩa nhựa nào không có hiện tượng hủy hoại tế bào, giống như giếng ựối chứng âm, chứng tỏ giếng ựó có kháng thể tương ứng với type vi-rút LMLM nên vi-rút bị kháng thể trung hòa và không có khả năng hủy hoại tế bào. Ngược lại, nếu giếng ựĩa nào có hiện tượng hủy hoại tế bào, tức là ở ựó vi-rút vẫn còn khả năng gây bệnh, giống giếng ựối chứng dương, chứng tỏ kháng thể không tương ứng với type vi-rút ựó hoặc trong huyết thanh không có kháng thể.
2.3.3.2. Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test)
Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thông thường ựược dùng ựể phát hiện bệnh LMLM, vì ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tổn kém.
Nguyên lý: Dùng các type huyết thanh ựã biết ựể phát hiện type vi-rút gây bệnh. Phản ứng kết hợp bổ thể ựược thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự tham gia của bổ thể.
Huyết thanh miễn dịch (huyết thanh chuẩn) của từng type ựược chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Kháng nguyên nghi là huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường phù hợp, sau ựó lấy dịch ựể làm phản ứng.
2.3.3.3. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Theo tác giả Tô Long Thành, ELISA là một phản ứng dùng ựể chẩn ựoán nhanh bệnh LMLM và ựể giám ựịnh type huyết thanh của vi-rút LMLM. đây là một phản ứng có ựộ ựặc hiệu cao khi dùng với một kháng thể ựơn dòng, phản ứng này có ựộ nhạy cao trong chẩn ựoán và ựịnh type vi-rút. Phản ứng ELISA cũng thường ựược sử dụng hơn so với phản ứng kết hợp bổ thể vì nó có ựộ ựặc
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
hiệu và ựộ nhạy cao hơn, không bị ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể.
Nguyên lý: Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn en-zym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn en-zym không bị rửa trôi, en-zym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng.
Trong ựó có:
- Phản ứng ELISA trực tiếp dùng ựể phát hiện kháng nguyên - Phản ứng ELISA gián tiếp dùng ựể phát hiện kháng thể
Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn ựoán thường sử dụng kắt FMD 3ABC Ờ ELISA ựể chẩn ựoán phân biệt huyết thanh dương tắnh là do nhiễm vi-rút tự nhiên hay do vắc-xin. Cơ sở khoa học của phương pháp này là vi-rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, vi-rút vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt vi-rút mới (các vi-ri-ôn), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt vi-ri-ôn mà chỉ ựóng vai trò là các men giúp cho quá trình nhân lên của vi-rút. Các thành phần kết hợp thành bản thân vi-rút có tắnh kháng nguyên gọi là prô-tê- in cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành vi- ri-ôn mới và có tắnh kháng nguyên gọi là prô-tê-in không cấu trúc (non Ờ structure protein). Trong các hạt prô-tê-in không cấu trúc của vi-rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ựặc hiệu với số lượng lớn và tổn tại nhiều tháng trong huyết
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
thanh trâu bò bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ựã bị nhiễm vi-rút LMLM
Tuy nhiên, trong các loại vắc-xin vô hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên không cấu trúc ựã ựược loại bỏ (gọi là vắc-xin tinh khiết). Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kắch thắch cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi-rút) chứ không có kháng thể chống lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC.
Một số loại vắc-xin khác (vắc-xin ựơn type O và hai type O- Asia1 của Trung Quốc) là vắc-xin không tinh khiết. Do ựó dùng phản ứng 3ABC Ờ ELISA sẽ không xác ựịnh chắn chắn gia súc nhiễm vi-rút LMLM thực ựịa hay do tiêm vắc-xin không tinh khiết. Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vắc-xin Trung Quốc phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hòa vi-rút và ựiều tra lịch sử tiêm phòng vắc-xin