Sau khi xác ựịnh ựược liều gây nhiễm TCID50 của 2 giống vi rút type O ựược chọn, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng trung hòa trên tế bào BHK-21 với ựối chứng kháng thể chuẩn và một số mẫu huyết thanh cố ựịnh ựã biết hiệu giá kháng thể trước ựó bằng phương pháp ELISA. Kháng thể chuẩn là ựối chứng chuẩn type O ựược phòng tham chiếu Pirbright cung cấpgồm ựối chứng chuẩn dương tắnh ựạt hiệu giá là 1/1024, ựối chứng chuẩn âm tắnh có kết quả âm tắnh.Mẫu huyết thanh kiểm tra gồm 10 mẫu huyết thanh trâu bò TB01 ựến
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
TB10và 10 mẫu huyết thanh lợn L01 ựến L10 ựã biết kết quả trước ựó bằng phương pháp ELISA. Trước khi trung hòa, những mẫu huyết thanh phải ly tâm 10.000 vòng/10 phút, rồi diệt bổ thể ở 560C trong 30 phút sau ựó mới ựược sử dụng. Việc trung hòathực hiện trênựĩa tế bào 96 giếng với việc pha loãng mẫu theo cơ số 2 ở tỷ lệ pha loãng ban ựầu là 1/4 (25 ộl huyết thanh + 75 ộl môi trường MEM 5% FCS).Nhỏ 1 mẫu/hàng với lượng 50 ộl /giếng theo tỷ lệ pha loãng tăng dần từ giếng 1 ựến giếng 12. Từ hàng E1 ựến hàng H5 của ựĩa ựối chứng dùng ựể chuẩn ựộ ngược vi rút ở các nồng ựộ 100 ựến 10-3 với lượng 100 ộl vi rút/giếng/5 giếng. Từ E6 ựến H6 của ựĩa ựối chứng nhỏ100 ộl môi trường MEM 5% FCS làm ựối chứng tế bào, các giếng còn lại từ E7 ựến H12 làm ựối chứng môi trường với lượng 100 ộl môi trường MEM 5% FCS. Sau ựó pha liều 100TCID50 và nhỏ vào các giếng với lượng 50 ộl/giếng trừ hàng E ựến hàng H ở ựĩa ựối chứng. Ủ trong tủ ấm 370C có 5% CO2 trong 1 giờ rồi nhỏ 100 ộl dung dịch tế bào BHK-21 có nồng ựộ 5x105 tế bào/ml vào tất cả các giếng trừ các giếng từ E7 ựến H12 của ựĩa ựối chứng. đem ủ ựĩa trong tủ ấm 370C có 5% CO2
từ 2-3 ngày. Hàng ngày ựem ựĩa ra quan sát dưới kắnh hiển vi. đến ngày thứ 3 ựổ bỏ dung dịch trong ựĩa, cố ựịnh ựĩa bằng 100 ộl/ giếng dung dịch muối ựệm 10% formol và 0,05% methylene blue trong 30 phút. đổ bỏ dung dịch cố ựịnh, quan sát kết quả dưới kắnh hiển vi ựảo chiều: giếng dương tắnh bắt màu xanh, giếng âm tắnh trống rỗng không bắt màu.
Chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp trung hòa trên tế bào 3 lần với kháng thể chuẩn và mẫu huyết thanh cố ựịnh, kết quả ựược trình bày ở bảng 4.3.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra ựối chứng chuẩn và huyết thanh bằng phương pháp trung hòa
Trung hòa KH mẫu
Lần 1 (HGKT) Lần 2 (HGKT) Lần 3 (HGKT)
đC (+) 1/1024 1/1024 1/1024
đC (-) Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 01 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 02 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 03 1/8 Âm tắnh Âm tắnh
TB 04 Âm tắnh 1/8 Âm tắnh
TB 05 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 06 1/256 1/256 1/256 TB 07 1/256 1/512 1/256 TB 08 1/256 1/256 1/256 TB 09 1/512 1/256 1/256 FMD-10-34 (100TCID50) TB 10 1/256 1/256 1/256 đC (+) 1/1024 1/1024 1/1024
đC (-) Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L01 1/16 Âm tắnh Âm tắnh
L02 Âm tắnh 1/8 Âm tắnh
L03 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L04 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L05 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L06 1/128 1/128 1/128 L07 1/128 1/128 1/128 L08 1/128 1/128 1/128 L09 1/128 1/128 1/64 FMD-11-07 (100TCID50) L10 1/128 1/128 1/128
Kết quả ở bảng 4.3 cho chúng ta thấy:
- Sau 3 lần tiến hành bằng phương pháp trung hòa trên tế bào với vi rút FMD-10-34 và FMD-10-07 (type O chủng Myanma 98- like) chúng ta nuôi cấy ựược thì mẫu ựối chứng dương chuẩn ựều cho kết quả hiệu giá ựạt 1/1024 và ựối
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
chứng âm chuẩn cho kết quả âm tắnh với cả 2 giống vi rút ựúng như công bố của nhà cung cấp Pirbright.
- đối với các mẫu huyết thanh trâu bò ựược dùng cho trung hòa thì sau 3 lần kiểm tra thì có 3 mẫu có sự sai khác về kết quả là TB03, TB04 và TB07 với hiệu giá kháng thể là 1/8, 1/8 và 1/512. Theo qui tình của OIE ựược áp dụng cho phương pháp này thì nếu hiệu giá <1/32 ựược coi là âm tắnh nên 2 mẫu TB03 và TB04 là dương tắnh giả và không thay ựổi về kết quả. Riêng mẫu TB07, tại lần kiểm tra thứ 2 thì hiệu giá cao hơn so với các kết quả khác. Tuy nhiên sự sai khác này theo tiêu chuẩn của OIE không ựáng kể và chấp nhận ựược.
-Cũng theo tiêu chuẩn của OIE, mẫu lợn cũng thu ựược 3 mẫu có kết quả sai lệch trong ựó cũng có 2 mẫu dương tắnh giả còn 1 mẫu L09 thì thay ựổi hiệu giá kháng thể giảm xuống 1/64. Tuy nhiên sự sai khác này theo tiêu chuẩn của OIE không ựáng kể và chấp nhận ựược.
Với kết quả xác ựịnh hiệu giá của các ựối chứng huyết thanh chuẩn và mẫu huyết thanh cố ựịnh thì ta có thể thấy phương pháp trung hòa trên tế bào này tương ựối tốt và chắnh xác. Trên cơ sở ựó chúng tôi ứng dụng ựưa phương pháp này vào tiến hành song song với phương pháp ELISA truyền thống trong việc xác ựịnh hiệu giá kháng thể trước và sau tiêm phòng vacxintype O chủng Myanma 98 tại 3 tỉnh Nam định, Lào Cai và Nghệ An cho các mẫu thực ựịa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
Hình 4.4: đĩa tế bào trung hòa trước khi cố ựịnh xanh methylene
Hình 4.5: đĩa tế bào trung hòa sau khi cố ựịnh xanh methylene 4.2. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nam định bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
Phương pháp trung hòa trên tế bào ựược tiến hành song song cùng phương pháp ELISA ựể xác ựịnh hiệu giá kháng thể LMLM type O trong huyết thanh. ELISA là kỹ thuật lần ựầu tiên ựược sử dụng vào năm 1972, hiện nay ựược sử dụng khá phổ biến tại các phòng thắ nghiệm chẩn ựoán trên toàn thế giới. Phương pháp truyền thống này dựa trên sự ựặc hiệu giữa kháng nguyên mỗi typevi rút với kháng thể tương ứng của nó.
4.2.1 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin
Hàng năm, tỉnh Nam định ựều có chắnh sách tiêm phòng vacxin LMLM bắt buộc cho ựàn gia súc nên không thể chọn ựược xã không có ựàn gia súc chưa tiêm phòng. Do ựó ựể có kết quả ựánh giá trong một thời gian ngắn, ngay tại thời ựiểm tiêm phòng vacxin LMLM type O chủng Myanma 98, chúng tôi lấy máu của 45 con trâu, bò và lợn ngẫu nhiên ựã ựược ựánh số tai ựể tiến hành thắ nghiệm kiểm tra hiệu giá kháng thể ựể xác ựịnh tỷ lệ kháng thể bảo hộ bằng 2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
phương pháp song song là phương pháp ELISA và phương pháp trung hòa trên tế bào. Kết quả thu ựược ựược trình bày ở bảng 4.4
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa tại Nam định
Phương pháp ELISA Phương pháp Trung hòa Loài vật Tổng Số Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Bò 22 10 12 0 0 11 11 0 0 Trâu 8 6 2 0 0 6 2 0 0 Lợn 15 12 3 0 0 12 3 0 0 Tổng 45 28 17 0 0 29 16 0 0
Qua bảng 4.4ta thấy:
- Trong những mẫu huyết thanh kiểm tra trước khi tiêm phòng bằng cả 2 phương pháp Elisa và trung hòa trên tế bào có những mẫu dương tắnh (17 mẫu ựối với phương pháp Elisa và 16 mẫu ựối với phương pháp trung hòa). Nhưng những mẫu dương tắnh này ựều không ựạt bảo hộ theo tiêu chuẩn của OIE và Pirbright tức là hiệu giá kháng thể chỉ ở 1/8 hoặc 1/16 (xem chi tiết ở phụ lục). điều nàycũng phù hợp với số liệu ựiều tra dịch tễ là những con gia súc này ựều ựược tiêm phòng từ tháng 11 năm 2010.
- Với 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào BHK-21 xác ựịnh hiệu giá kháng thể của các mẫu huyết trước khi tiêm phòng vacxinLMLM thì tỷ lệ bảo hộ ở cả 3 loài trâu, bò và lợn của tỉnh Nam định ựều là 0%.
-Số mẫu âm tắnh ựược xác ựịnh ở phương pháp ELISA là 28 mẫu, ở phương pháp trung hòa trên tế bào là 29 mẫu. Việc chênh lệc này không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
Biểu ựồ 4.1: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêmphòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nam định
4.2.2Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phòng vacxin
Những trâu bò và lợn ựã ựược lấy mẫu tiến hành thắ nghiệm trước khi tiêm phòng vacxin lại tiếp tục theo dõi sau khi tiêm vacxin. đến 21 ngày sau tiêm, chúng lại ựược lấy máu chắt huyết thanh, xử lý diệt bổ thể ựể tiếp tục thắ nghiệm xác ựịnh hiệu giá kháng thể bảo hộ sau tiêm phòng bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào BHK-21. Kết quả thu ựược trình bày ở bảng 4.5 và biểu ựồ 4.2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
Phương pháp Elisa Phương pháp Trung hòa Loài vật Tổng Số Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệbảo hộ (95% CI) Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệbảo hộ (95% CI) Bò 22 1 0 21 95,45 (86,75ọ100) 3 1 18 81,82 (65,7ọ97,94) Trâu 8 0 1 7 87,5 (64,58ọ100) 1 1 6 75 (44,99ọ100) Lợn 15 9 5 1 6,67 (0,17ọ31,95) 9 5 1 6,67 (0,17ọ31,95) Tổng 45 10 6 29 64,44 (50,46ọ78,43) 13 7 25 55,56 (41,04ọ70,07)
Biểu ựồ 4.2: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nam định
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 51
Qua bảng 4.5 và biểu ựồ 4.2 ta thấy:
- Sau 21 ngày tiêm phòng thì tỷ lệ bảo hộ của kháng thể ựược kiểm tra bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa ựều tăng lên ở cả 3 loài. Trong ựó tỷ lệ bảo hộ ở bò là cao nhất chiếm 95,45% với 21/22 con có kháng thể dương tắnh ựạt bảo hộ, thấp nhất là tỷ lệ bảo hộ ở lợn chỉ ựạt có 6,67% với 1 con có HGKT bảo hộ trên 15 con kiểm tra. điều này ựược lý giải là ở lợn ựược khuyến cáo của nhà sản xuất vacxin là phải tiêm phòng 2 mũi mới ựạt kết quả tốt.
- Chỉ có 1 trường hợp ở bò là không phát hiện ựược kháng thể bảo hộ sau 21 ngày tiêm phòng. điều này có thể do con vật có ựáp ứng miễn dịch kém nên cho kết quả hàm lượng kháng thể thấp dưới mức phát hiện của phương pháp xét nghiệm hoặc do kỹ thuật tiêm phòng không ựảm bảo tại thời ựiểm tiêm.
- đã có sự chênh lệch giữa 2 phương pháp về việc xác ựịnh hiệu giá kháng thể ựạt bảo hộ, khác biệt lớn nhất là ở bò với 18 con ựạt hiệu giá kháng thể ựạt bảo hộ theo phương pháp trung hòa và 21 con theo phương pháp ELISA. Tuy nhiên sự chênh lệch này không có ý nghĩa về mặt thống kê.
- đối với lợn thì cả 2 phương pháp ựều cho kết quả giống nhau là 6,67% tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng.
4.3. Kết quả kiểm tra tỷ lệ bảo hộ của kháng của tỉnh Lào Cai bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
4.3.1Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với tỉnh Lào Cai, chúng tôi cũng tiến hành lấy mẫu làm thắ nghiệm giống như tỉnh Nam định. Kết quả thu ựược trình bày ở bảng 4.6 và biểu ựồ 4.3
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 52
Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai
Phương pháp Elisa Phương pháp Trung hòa Loài vật Tổng Số Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Bò 15 13 2 0 0 9 6 0 0 Trâu 15 14 1 0 0 11 4 0 0 Lợn 15 12 3 0 0 10 5 0 0 Tổng 45 39 6 0 0 30 15 0 0
Biểu ựồ 4.3: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai
- Dựa vào tài liệu ựiều tra và kết quả thu ựược từ phòng thắ nghiệm, thông qua bảng 4.6 và biểu ựồ 4.3 chúng tôi thấy tỷ lệ bảo hộ của trâu, bò và lợn trước khi tiêm phòng vacxintại Lào Cai ựều ựạt 0%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 53
- Cả 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào ựều cho kết quả giống nhau việc xác ựịnh số mẫu dương tắnh ựạt bảo hộ là 0 mẫu.
- Có sự chênh lệch ựáng kể về kết quả số mẫu âm tắnh giữa 2 phương pháp là 39 mẫu âm tắnh với phương pháp ELISA và 30 mẫu âm tắnh với phương pháp trung hòa. điều này cũng dẫn ựến sự chênh lệch kết quả số mẫu dương tắnh không ựạt bảo hộ ở 2 phương pháp, làm cho phương pháp trung hòa tăng lên 9 mẫu và phương pháp ELISA giảm ựi 9 mẫu.điều này ựược lý giải vì ựây là 2 phương pháp có nguyên lý khác nhau ựồng thời việc xác ựịnh nồng ựộ pha loãng huyết thanh ban ựầu ở 2 phương pháp là khác nhau: ựối với phương pháp Elisa là 1/16, với phương pháp trung hòa là 1/4, dẫn ựến hiệu giá kháng thể ban ựầu sau trung hòa cũng khác nhau với phương pháp Elisa là 1/32 còn phương pháp trung hòa trên tế bào là 1/8.
4.3.2. Kết quả kiểm tra sau khi tiêm phòng vacxin
Sau 21 ngày tiêm phòng vacxin, 45 con trâu, bò, lợn này lại ựược lấy mẫu ựể kiểm tra lại hiệu giá kháng thể bằng cả 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7 và biểu ựồ 4.4
Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai
Phương pháp Elisa Phương pháp Trung hòa
Loài vật Tổng Số Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Bò 15 0 0 15 100 0 0 15 100 Trâu 15 0 0 15 100 0 0 15 100 Lợn 15 7 6 2 13,33 (1,66ọ40,46) 7 6 2 13,33 (1,66ọ40,46) Tổng 45 7 6 32 71,11 (57,87ọ84,35) 7 6 32 71,11 (57,87ọ84,35)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 54
Biểu ựồ 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai
Qua bảng 4.7 và biểu ựồ 4.4, chúng ta thấy:
- Cả 3 loài trâu, bò, lợn ựều có tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng vacxin tăng lên so với khi trước tiêm phòng.
- Cả 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào cho kết quả kiểm tra giống nhau về cả mẫu âm tắnh, mẫu dương tắnh không ựạt bảo hộ và ựạt bảo hộ. - Ở cả hai phương pháp thắ nghiệm ELISA và trung hòa ựều cho kết quả tỷ lệ bảo hộ ựạt cao nhất 100% ở 2 loài trâu và bò. Lợn vẫn là loài cho kết quả tỷ lệ bảo hộ thấp nhất thông qua cả 2 phương pháp ựều là 13,33%.
4.4. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nghệ An bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 55
4.4.1. Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin
Tỉnh Nghệ An cũng ựược chúng tôi tiến hành lấy mẫu giống như 2 tỉnh Nam định và Lào Cai và tiến hành thắ nghiệm kiểm tra hiệu giá bằng song song cả 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào. Kết quả thu ựược chúng tôi trình bày tại bảng 4.8 và biểu ựồ 4.5.