bào BHK-21
4.1.1. Nhân giống vi rúttype O chủng Myanma 98-like
Từ kết quả phân tắch gien tại phòng tham chiếu LMLM của Pirbright ựối với những mẫu vi rút phân lập ựược từ các ổ dịch LMLM tại Việt Nam vào cuối năm 2010 và ựầu năm 2011, chúng tôi ựã chọn ra ựược 2 giống vi rút type O có hệ gien tương ựồng với vi rút type O chủng Myanma 98 ( vi rút type O chủng Myanma 98-like) ựể phục vụ cho phương pháp trung hòa trên tế bào.đó là vi rút LMLM gây bệnh trên trâu bò tại Sơn La ựược gọi tên là FMD-10-34 và vi rút gây bệnh LMLM trên lợn tại Hải Dương ựược gọi tên là FMD-11-07.
Chúng tôi tiến hành nhân giống và ổn ựịnh giống qua 2 ựời nuôi cấy trên chai T75, mỗi loại vi rút nuôi cấy trong 4 chai T75, mỗi chai nhiễm 100 ộl và nuôi trong 4 ngày ở tủ ấm 370C có 5% CO2. Chai ựối chứng chỉ có tế bào BHK- 21 nuôi trong môi trường MEM có bổ sung 5% FCS. Quan sát biến ựổi bệnh tắch tế bào hàng ngày dưới kắnh hiển vi ựảo vào các thời ựiểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ thấy bệnh tắch tế bào bắt ựầu xuất hiện sau 24 giờ và ựến 96 giờ thì vi rút phá hủy toàn bộ thảm tế bào. Cùng với việc quan sát khi thấy xuất hiện bệnh tắch tế bào thì chúng tôi ựồng thời thu hoạch vi rút ở 4 thời ựiểm trên. Sau khi hoàn tất việc thu hoạch chúng tôi tiến hành xác ựịnh mức ựộ OD của vi rút tại mỗi thời ựiểm thu hoạch bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên ựể biết ựược vi rút thu hoạch vào thời ựiểm nào là tốt nhất. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
Bảng 4.1: Kết quả ựánh giá hai giống vi rút
Lần 1 Lần 2
Vi rút Thời gian Chỉ số OD % thảm tế bào
bị phá hủy Chỉ số OD % thảm tế bào bị phá hủy 24 giờ 0.6 40 0.52 40 48 giờ 1.46 60 1.53 60 72 giờ 2.23 90 2.41 90 FMD-10-34 96 giờ 1.8 100 1.97 100 24 giờ 0.8 40 0.76 40 48 giờ 1.53 60 1.49 60 72 giờ 2.52 90 2,63 90 FMD-11-07 96 giờ 2.01 100 2.07 100
Ghi chú: % phá hủy thảm tế bào ựược ước lượng bằng quan sát dưới kắnh hiển vi.
Qua kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi thấy ở thời ựiểm 96 giờ sau khi nhiễm vi rút lên chai tế bào, vi rút phá hủy ựến 100% thảm tế bào nhưng kết quả OD lại thấp hơn so với ở thời ựiểm 72 giờ sau khi nhiễm. Vì vậy chúng tôi quyết ựịnh cả 2 giống vi rút sau khi ựược nhân giống và ổn ựịnh ựều ựược thu hoạch ở thời ựiểm 72 giờ sau khi nhiễm là tốt nhất vì lúc ựóhàm lượngvi rút ựạt cao nhất. Sau khi nhân giống vi rút, bước tiếp theo chúng tôi chuẩn ựộ vi rút ựể xác ựịnh liều gây nhiễm 50% tế bào TCID50của 2 giống vi rút này.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
Hình 4.1 Chai tế bào ựể nhân giống virút
Hình 4.2: Tế bào BHK-21 bình thường
Hình 4.3: Tế bào BHK-21 bị vi rút LMLM phá hủy
4.1.2. Chuẩn ựộ 2 giống vi rút type O chủng Myanma 98- like
Hai giống vi rút type O này sau khi ựược thu hoạch tiếp tục ựược chuẩn ựộ trên ựĩa tế bào 96 giếng ựáy bằng ựể xác ựịnh liều gây nhiễm 50% tế bào TCID50. Chúng tôi tiến hành pha loãng vi rút với môi trường nuôi cấy tế bào MEM có 5% FCS ở các nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-8 (cho 100ộl vi rút giống vào trong ống eppendorf có chứa 900 ộl môi trường MEM thì ựược nồng ựộ 10-1 , sau ựó trộn ựều rồi chuyển 100 ộl nồng ựộ này sang ống eppendorf khác có chứa 900 ộl môi trường MEM, cứ như vậy sẽ ựược ựến 10-8) sau ựó nhiễm mỗi nồng ựộ lên 10 giếng trên ựĩa tế bào 96 giếng với lượng 100ộl/giếng. Hai cột cuối của
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
ựĩa nhỏ 100 ộl môi trường tế bào MEM ựể làm ựối chứng. Rồi cho tiếp 100 ộl tế bào nồng ựộ 5x105tế bào/ml vào các giếng. Ủ tủ ấm 370C có 5% CO2 trong 5 ngày, quan sát hàng ngày xác ựịnh giếng có tế bào bị vi rút phá hủy. đến ngày thứ 5 khi không còn hiện tượng tế bào bị phá hủy thì tiến hành tắnh công thức TCID50. Việc chuẩn ựộ liều gây nhiễm 50% tế bào TCID50 này ựược chúng tôi tiến hành 3 lần cho cả 2 giống vi rút ựược chọn. Kết quả chuẩn ựộ ựược thể hiện ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Kết quả sau 3 lần chuẩn ựộ trên tế bào BHK-21
Vi rút FMD-10-34
Lần kiểm tra độ pha
loãng
Số giếng gây nhiễm
giếng nhiễm/ giếng gây nhiễm
Tỷ lệ % Lần 1 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100 10-4 10 10/10 100 10-5 10 8/10 80 10-6 10 2/10 20 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.63/ml Lần 2 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100 10-4 10 10/10 100 10-5 10 8/10 80 10-6 10 2/10 20 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.63/ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 Lần 3 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100 10-4 10 10/10 100 10-5 10 8/10 80 10-6 10 0/10 0 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.38/ml Vi rút FMD - 11-07 Lần 1 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100 10-4 10 10/10 100 10-5 10 10/10 100 10-6 10 4/10 40 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.83/ml Lần 2 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100 10-4 10 10/10 100 10-5 10 10/10 100 10-6 10 4/10 40 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.83/ml Lần 3 10-1 10 10/10 100 10-2 10 10/10 100 10-3 10 10/10 100
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 10-4 10 10/10 100 10-5 10 10/10 100 10-6 10 4/10 40 10-7 10 0/10 0 10-8 10 0/10 0 TCID50 = 106.83/ml
Qua bảng 4.2, chúng ta thu ựược kết quả như sau:
- đối với vi rút FMD-10-34, qua 3 lần chuẩn ựộ ta xác ựịnh ựược liều TCID50 khác nhau. Cụ thể là: TCID50 lần 1= 106,63/ml.
TCID50 lần 2 = 106,63/ml TCID50 lần 3 =106,38/ml
Vậy trong 3 lần chuẩn ựộ TCID50 vi rút FMD- 10-34 có 2 lần ựạt ở mức 106,63, do ựó chúng tôi quyết ựịnh chấp nhận vi rút FMD-10-34 có liều TCID50 là 106,63/ml ựể dùng cho việc lập phản ứng trung hòa kháng thể trên tế bào.
- đối với vi rút FMD-11-07, trong cả 3 lần chuẩn ựộ vi rút ựều cho kết quả giống nhau về liều gây nhiễm 50% tế bàotức là TCID50 = 106,83/ml.
4.1.3. Kết quả thiết lập thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào BHK-21
Sau khi xác ựịnh ựược liều gây nhiễm TCID50 của 2 giống vi rút type O ựược chọn, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng trung hòa trên tế bào BHK-21 với ựối chứng kháng thể chuẩn và một số mẫu huyết thanh cố ựịnh ựã biết hiệu giá kháng thể trước ựó bằng phương pháp ELISA. Kháng thể chuẩn là ựối chứng chuẩn type O ựược phòng tham chiếu Pirbright cung cấpgồm ựối chứng chuẩn dương tắnh ựạt hiệu giá là 1/1024, ựối chứng chuẩn âm tắnh có kết quả âm tắnh.Mẫu huyết thanh kiểm tra gồm 10 mẫu huyết thanh trâu bò TB01 ựến
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
TB10và 10 mẫu huyết thanh lợn L01 ựến L10 ựã biết kết quả trước ựó bằng phương pháp ELISA. Trước khi trung hòa, những mẫu huyết thanh phải ly tâm 10.000 vòng/10 phút, rồi diệt bổ thể ở 560C trong 30 phút sau ựó mới ựược sử dụng. Việc trung hòathực hiện trênựĩa tế bào 96 giếng với việc pha loãng mẫu theo cơ số 2 ở tỷ lệ pha loãng ban ựầu là 1/4 (25 ộl huyết thanh + 75 ộl môi trường MEM 5% FCS).Nhỏ 1 mẫu/hàng với lượng 50 ộl /giếng theo tỷ lệ pha loãng tăng dần từ giếng 1 ựến giếng 12. Từ hàng E1 ựến hàng H5 của ựĩa ựối chứng dùng ựể chuẩn ựộ ngược vi rút ở các nồng ựộ 100 ựến 10-3 với lượng 100 ộl vi rút/giếng/5 giếng. Từ E6 ựến H6 của ựĩa ựối chứng nhỏ100 ộl môi trường MEM 5% FCS làm ựối chứng tế bào, các giếng còn lại từ E7 ựến H12 làm ựối chứng môi trường với lượng 100 ộl môi trường MEM 5% FCS. Sau ựó pha liều 100TCID50 và nhỏ vào các giếng với lượng 50 ộl/giếng trừ hàng E ựến hàng H ở ựĩa ựối chứng. Ủ trong tủ ấm 370C có 5% CO2 trong 1 giờ rồi nhỏ 100 ộl dung dịch tế bào BHK-21 có nồng ựộ 5x105 tế bào/ml vào tất cả các giếng trừ các giếng từ E7 ựến H12 của ựĩa ựối chứng. đem ủ ựĩa trong tủ ấm 370C có 5% CO2
từ 2-3 ngày. Hàng ngày ựem ựĩa ra quan sát dưới kắnh hiển vi. đến ngày thứ 3 ựổ bỏ dung dịch trong ựĩa, cố ựịnh ựĩa bằng 100 ộl/ giếng dung dịch muối ựệm 10% formol và 0,05% methylene blue trong 30 phút. đổ bỏ dung dịch cố ựịnh, quan sát kết quả dưới kắnh hiển vi ựảo chiều: giếng dương tắnh bắt màu xanh, giếng âm tắnh trống rỗng không bắt màu.
Chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp trung hòa trên tế bào 3 lần với kháng thể chuẩn và mẫu huyết thanh cố ựịnh, kết quả ựược trình bày ở bảng 4.3.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra ựối chứng chuẩn và huyết thanh bằng phương pháp trung hòa
Trung hòa KH mẫu
Lần 1 (HGKT) Lần 2 (HGKT) Lần 3 (HGKT)
đC (+) 1/1024 1/1024 1/1024
đC (-) Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 01 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 02 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 03 1/8 Âm tắnh Âm tắnh
TB 04 Âm tắnh 1/8 Âm tắnh
TB 05 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
TB 06 1/256 1/256 1/256 TB 07 1/256 1/512 1/256 TB 08 1/256 1/256 1/256 TB 09 1/512 1/256 1/256 FMD-10-34 (100TCID50) TB 10 1/256 1/256 1/256 đC (+) 1/1024 1/1024 1/1024
đC (-) Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L01 1/16 Âm tắnh Âm tắnh
L02 Âm tắnh 1/8 Âm tắnh
L03 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L04 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L05 Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
L06 1/128 1/128 1/128 L07 1/128 1/128 1/128 L08 1/128 1/128 1/128 L09 1/128 1/128 1/64 FMD-11-07 (100TCID50) L10 1/128 1/128 1/128
Kết quả ở bảng 4.3 cho chúng ta thấy:
- Sau 3 lần tiến hành bằng phương pháp trung hòa trên tế bào với vi rút FMD-10-34 và FMD-10-07 (type O chủng Myanma 98- like) chúng ta nuôi cấy ựược thì mẫu ựối chứng dương chuẩn ựều cho kết quả hiệu giá ựạt 1/1024 và ựối
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
chứng âm chuẩn cho kết quả âm tắnh với cả 2 giống vi rút ựúng như công bố của nhà cung cấp Pirbright.
- đối với các mẫu huyết thanh trâu bò ựược dùng cho trung hòa thì sau 3 lần kiểm tra thì có 3 mẫu có sự sai khác về kết quả là TB03, TB04 và TB07 với hiệu giá kháng thể là 1/8, 1/8 và 1/512. Theo qui tình của OIE ựược áp dụng cho phương pháp này thì nếu hiệu giá <1/32 ựược coi là âm tắnh nên 2 mẫu TB03 và TB04 là dương tắnh giả và không thay ựổi về kết quả. Riêng mẫu TB07, tại lần kiểm tra thứ 2 thì hiệu giá cao hơn so với các kết quả khác. Tuy nhiên sự sai khác này theo tiêu chuẩn của OIE không ựáng kể và chấp nhận ựược.
-Cũng theo tiêu chuẩn của OIE, mẫu lợn cũng thu ựược 3 mẫu có kết quả sai lệch trong ựó cũng có 2 mẫu dương tắnh giả còn 1 mẫu L09 thì thay ựổi hiệu giá kháng thể giảm xuống 1/64. Tuy nhiên sự sai khác này theo tiêu chuẩn của OIE không ựáng kể và chấp nhận ựược.
Với kết quả xác ựịnh hiệu giá của các ựối chứng huyết thanh chuẩn và mẫu huyết thanh cố ựịnh thì ta có thể thấy phương pháp trung hòa trên tế bào này tương ựối tốt và chắnh xác. Trên cơ sở ựó chúng tôi ứng dụng ựưa phương pháp này vào tiến hành song song với phương pháp ELISA truyền thống trong việc xác ựịnh hiệu giá kháng thể trước và sau tiêm phòng vacxintype O chủng Myanma 98 tại 3 tỉnh Nam định, Lào Cai và Nghệ An cho các mẫu thực ựịa.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
Hình 4.4: đĩa tế bào trung hòa trước khi cố ựịnh xanh methylene
Hình 4.5: đĩa tế bào trung hòa sau khi cố ựịnh xanh methylene 4.2. Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nam định bằng 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào
Phương pháp trung hòa trên tế bào ựược tiến hành song song cùng phương pháp ELISA ựể xác ựịnh hiệu giá kháng thể LMLM type O trong huyết thanh. ELISA là kỹ thuật lần ựầu tiên ựược sử dụng vào năm 1972, hiện nay ựược sử dụng khá phổ biến tại các phòng thắ nghiệm chẩn ựoán trên toàn thế giới. Phương pháp truyền thống này dựa trên sự ựặc hiệu giữa kháng nguyên mỗi typevi rút với kháng thể tương ứng của nó.
4.2.1 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phòng vacxin
Hàng năm, tỉnh Nam định ựều có chắnh sách tiêm phòng vacxin LMLM bắt buộc cho ựàn gia súc nên không thể chọn ựược xã không có ựàn gia súc chưa tiêm phòng. Do ựó ựể có kết quả ựánh giá trong một thời gian ngắn, ngay tại thời ựiểm tiêm phòng vacxin LMLM type O chủng Myanma 98, chúng tôi lấy máu của 45 con trâu, bò và lợn ngẫu nhiên ựã ựược ựánh số tai ựể tiến hành thắ nghiệm kiểm tra hiệu giá kháng thể ựể xác ựịnh tỷ lệ kháng thể bảo hộ bằng 2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
phương pháp song song là phương pháp ELISA và phương pháp trung hòa trên tế bào. Kết quả thu ựược ựược trình bày ở bảng 4.4
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa tại Nam định
Phương pháp ELISA Phương pháp Trung hòa Loài vật Tổng Số Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Mẫu (-) Mẫu (+) KBH Mẫu (+) BH Tỷ lệ bảo hộ (95% CI) Bò 22 10 12 0 0 11 11 0 0 Trâu 8 6 2 0 0 6 2 0 0 Lợn 15 12 3 0 0 12 3 0 0 Tổng 45 28 17 0 0 29 16 0 0
Qua bảng 4.4ta thấy:
- Trong những mẫu huyết thanh kiểm tra trước khi tiêm phòng bằng cả 2 phương pháp Elisa và trung hòa trên tế bào có những mẫu dương tắnh (17 mẫu ựối với phương pháp Elisa và 16 mẫu ựối với phương pháp trung hòa). Nhưng những mẫu dương tắnh này ựều không ựạt bảo hộ theo tiêu chuẩn của OIE và Pirbright tức là hiệu giá kháng thể chỉ ở 1/8 hoặc 1/16 (xem chi tiết ở phụ lục). điều nàycũng phù hợp với số liệu ựiều tra dịch tễ là những con gia súc này ựều ựược tiêm phòng từ tháng 11 năm 2010.
- Với 2 phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào BHK-21 xác ựịnh hiệu giá kháng thể của các mẫu huyết trước khi tiêm phòng vacxinLMLM thì tỷ lệ bảo hộ ở cả 3 loài trâu, bò và lợn của tỉnh Nam định ựều là 0%.