Nghiên Cứu Ứng Dụng Nuôi Cấy Nấm Men Rhodotorula Sp Trên Môi Trường Bán Rắn Để Thu Nhận Beta Carotene

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-carotene, một hợp chất có hoạt tính sinh học, có

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NUÔI CẤY NẤM MEN

RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU

NHẬN BETA CAROTENE

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS.NGUYỄN MINH KHANG TRẦN NGỌC VÂN KHANH

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2009

TÓM TẮT LUẬN VĂN

TRẦN NGỌC VÂN KHANH, Đại học Tôn Đức Thắng Tp Hồ Chí Minh

Tháng 8/2009 “Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi

trường bán rắn để thu nhận beta -carotene”

Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Minh Khang

Quá trình lên men bán rắn từ nấm men Rhodotorula sp đã tạo được hướng đi

mới trong việc tận dụng các nguồn phụ phẩm rẻ tiền trong sản xuất nông nghiệp và ngành công nghiệp thực phẩm thành các chế phẩm giàu dinh dưỡng và hàm lượng beta- carotene đạt 50mg/kg

Với mục tiêu nghiên cứu: tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy nấm men

Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene, bước đầu chúng tôi

đã thành công khi mật độ tế bào đạt được 7,40.108 CFU/g sau 7 ngày nuôi cấy với các điều kiện sau:

 Gạo tấm phụ phẩm ngâm 24 giờ, pH 2,0 trước khi hồ hóa

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm cơm tấm : lõi bắp : khoáng K2HPO4 87%: 5% : 2,8%

 Điều kiện nuôi cấy tối ưu với các thông số ban đầu pH = 5,5, độ ẩm = 60% và lượng giống cấy là 10%

Sau quá trình nghiên cứu, bước đầu tạo sản phẩm bột màu đỏ nâu từ canh

trường nuôi cấy Thu được chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula sp có độ

ẩm <10% với các thành phần như sau :

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt luận văn ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình vii

Danh sách các sơ đồ ix

Danh sách các biểu đồ x

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI 2

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN 3

2.1.1 Tổng quan về nấm men 3

2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men 3

2.2 NẤM MEN RHODOTORULA SP 8

2.2.1 Phân loại 8

2.2.2 Hình dạng và kích thước 9

2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp 11

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 13

2.2.5 Đặc điểm sinh lý: 14

2.3 BETA-CAROTENE (β-Carotene) 15

2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids 15

2.3.2 Giới thiệu về Beta-Carotene 20

2.4 Lên men bán rắn 24

2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF) 24

2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm men Rhodotorula sp 26

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 32

3.2 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 32

3.2.1 Dụng cụ 32

3.2.2 Thiết bị 33

3.2.3 Hóa chất 33

3.3 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG VI SINH VẬT 33

3.3.1 Nguyên liệu 33

3.3.2 Giống vi sinh vật 34

3.4 CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG (Phụ lục 1) 34

3.4.1 Môi trường phân lập nấm men 34

3.4.2 Môi trường giữ giống nấm men 34

3.4.3 Môi trường hoạt hóa nấm men 35

3.4.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn 35

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

3.5.1 Các phương pháp phân tích, thu nhận các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu 36 3.5.2 Phương pháp phân lập và chọn giống 36

3.5.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37

3.6 TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 44

3.6.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 44

3.6.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 45 3.6.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K 2 HPO 4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 46

3.7 PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 47

3.7.1 Mục đích 47

3.7.2 Phương pháp xử lý số liệu 47

3.8 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 49

3.9 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 49

Chương 4: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

4.1 KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NẤM MEN RHODOTORULA 50

4.2 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI BÁN RẮN 52

4.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN 56

4.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ THỜI GIAN NGÂM GẠO 58

4.5 TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 60

4.5.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 60

4.5.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 61

4.5.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K2HPO4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 63

4.6 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUỐI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 64

4.7 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 66

4.8 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM 67

4.9 TÍNH GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 67

Chương 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 69

5.1 KẾT LUẬN 69

5.2 KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 1 72

PHỤ LỤC 2 74

PHỤ LỤC 3 81

PHỤ LỤC 4 86

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

SSF Solid State Fermentation (Lên men bán rắn)

LDL Low-Density Lipoprotein (lipoprotein có tỷ trọng thấp)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men 4

Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau 10

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh lý 14

Bảng 3.1: Danh sách dụng cụ sử dụng 32

Bảng 3.2: Danh sách các thiết bị sử dụng 33

Bảng 3.3 Bảng phân phối nghiệm thức 42

Bảng 3.4 Các yếu tố thí nghiệm 48

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 49

Bảng 4.1: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu 53

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát môi trường lên men bán rắn 53

Bàng 4.3: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày 55

Bảng 4.4: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày trên môi trường 2 56

Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy 58

Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy 59

Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm 60

Bảng 4.8 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp 61

Bảng 4.9 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần khoáng K2HPO4 63

Bảng 4.10 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng 64

Bảng 4.11 : Kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm 65

Bảng 4.12 : Chi phí trong 1 lít môi trường nhấn giống nấm men Rhodotorula 67

Bảng 4.13 : Chi phí trong 1 kg môi trường lên men bán rắn 68

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Nấm men Rhodotorula sp 8

Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis 8

Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp 14

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng 16

Hình 2.5: Phân loại carotenoids 17

Hình 2.6:Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị 19

Hình 2.7: Cấu trúc phân tử Betacaroten 20

Hình 2.8: Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D 20

Hình 2.9: Cấu trúc Vitamin A 21

Hình 2.10: Sinh tổng hợp vitamin A từ Beta-Carotene 22

Hình 4.1: Nấm men đỏ trên môi trường thạch Hensen 50

Hình 4.2: Cấy trang quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch Hensen 50

Hình 4.3: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x 40 51

Hình 4.4: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x100 51

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rodotorula 37

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 40

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 43

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1: Khảo sát môi trường lên men bán rắn 54

Biểu đồ 4.2: Sự phát triển của nấm men trên môi trường bán rắn 55

Biểu đồ 4.3: Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula trên môi trường 2 57

Biểu đồ 4.4: Khảo sát ảnh hưởng của pH nước ngâm gạo 58

Biểu đồ 4.5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo 59

Biểu đồ 4.6 : Kết quả tối ưu hóa thành phần cơm 60

Biểu đồ 4.7 : Kết quả tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp 62

Biểu đồ 4.8 : Tối ưu hóa tỉ lệ khoáng K2HPO4 63

Biểu đồ 4.9 : Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm 66

Khi đất nước ngày càng phát triển, cùng với quá trình công nghiệp hóa hiện đại hóa Các ngành nông nghiệp, công nghiệp nâng cao năng suất và các sản phẩm ngày càng tăng, đa dạng hơn về mặt số lượng cũng như chất lượng Việc ứng dụng phế liệu trong ngành nông nghiệp để tạo ra một sản phẩm sinh học có giá trị là một vấn đề đang được hầu hết các nhà khoa học quan tâm

Các kết quả nghiên cứu cho thấy tại Việt Nam rất phổ biến giống nấm men

Rhodotorula Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích lũy

carotenoid, chất béo đặc biệt là các acid béo không no có giá trị sinh học cao trên các phế phụ phẩm chế biến nông sản thực phẩm

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp

một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-carotene, một hợp chất có hoạt tính sinh học, có vai trò quan trọng trên người, gia súc, gia cầm…

Ngoài việc được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, beta-caroten còn được quan tâm hơn khi bổ sung vào các loại thực phẩm cho người và thức ăn gia súc nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng, cũng như cải thiện và giảm thiểu một số bệnh do

thiếu vitamin A Tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula đã

được nghiên cứu và được sử dụng như một nguồn cung cấp chất màu thực phẩm an toàn, sinh khối nấm men có giá trị dinh dưỡng cao được dùng trong chăn nuôi

Đứng trước nhu cầu đó, bước đầu chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng

dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận

beta -carotene”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI

Khảo sát những điều kiện tối ưu nhất cho sự phát triển của nấm men đỏ

Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật

liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

- Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng Rhodotorula sp trên môi trường bán

rắn

- Quan sát vi thể và đại thể của chủg nấm men đỏ Rhodotorula sp

- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ

Rhodotorula sp

- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy

- Sản xuất chế phẩm beta-carotene từ nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường

tối ưu

- Kiểm tra hàm lượng beta-carotene trong chế phẩm sản xuất

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN

2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lối nảy chồi Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota)

Nấm men phân bố hết sức rộng rải trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp như đất trồng nho và cây ăn quả

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid Vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm

men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma).

2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7]

2.1.2.1 Hình dạng nấm men [7]

Nấm men thường có cấu tạo đơn bào Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục

(Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống (Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt Hình

dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy

Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi

gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida,

Trichosporon

2.1.2.2 Kích thước tế bào nấm men [7]

Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay tuổi sinh lý Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần Kích thước trung bình của tế bào nấm men

 Chiều dài: 9 ÷ 10 µm

 Chiều rộng: 2 ÷ 7 µm

Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 µm x 5- 10 µm

2.1.3 Dinh dưỡng nấm men

2.1.3.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men [12]

Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước (nước liên kết và nước tự do) - khoảng 75% khối lượng chung Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%)

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro Chất hữu cơ gồm có : Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất béo 0,5 – 2 %

2.1.3.2 Dinh dưỡng nấm men [12]

Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài Khi tế bào ở trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được nấm men sử dụng – dinh dưỡng nội bào

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục

vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào

 Dinh dưỡng cacbon [12],[4]

Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác nhau như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin,… Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose

Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm men Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật

Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men Đối với các nguồn carbon khác như rượu và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả

các loài nấm men Các loài Saccharomyces lên men rượu vang sử dụng glucose,

fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần Với lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là tính đa dưỡng của nấm men Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết

Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau Các loài khác nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng khác nhau

Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men Các acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men Chúng

có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất

Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở nồng độ trong môi trường rất thấp (0,02 ÷ 0,05 %) Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men phát triển Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trong phân tử được sử dụng tùy thuộc vào từng chủng loại nấm men

 Dinh dưỡng nitơ [12], [4]

Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô

cơ có sẵn trong môi trường

Thông thường, nitơ của tế bào nấm men thường vào khoảng 7 ÷ 10 %, đôi khi lên tới 12% vật chất khô Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ trong điều kiện

kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí là 37 ÷ 53 mgN Tuy nhiên hàm lượng nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu khí và số lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và một số vitamin

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ Đó là các muối amoni sunfat, amoni phosphat rồi đến các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng do vậy có thể làm môi trường acid hóa, giảm pH Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu cơ

Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt nhất là các muối amon, tiếp theo là các acid amin, sử dụng pepton kém và hoàn toàn không sử dụng được protein Trong quá trình nuôi cấy nấm men các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn carbon dinh dưỡng Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin mới như là chất cho nhóm amin (NH2-)

 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ [12], [4]

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh,…

Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các

nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid,… Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp

Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ Nhu cầu sinh lý

về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 ÷ 13 mgP

Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat

Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số enzyme CoA Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin) và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này Do vậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải thận trọng

Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men Thông thường ion K+ được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+,

Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước) Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn

 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng [12], [4]

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic (B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6), acid nicotinic (B5 hay PP) Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh trưởng là tiamin, ngoài ra còn có acid paraaminobenzic

Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin) Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường

Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]

Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men có khả năng tổng hợp tích luỹ một

lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torularhodin

Năm 1921, A Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula

mucilaginose, tiếp sau đó năm 1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập

được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài Rhodotorula glutinus, Rh Mucilaginosa

và Rhodotorula gracilis Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống nấm men

Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh mucilaginosa

trước đó có tên gọi là Rh rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá

nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc nhiệt độ 40oC và loài Rh rubra thực

ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh glutinis, tên gọi Rh ruba ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh Mucilaginosa [10],[11]

Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố

carotenoide để chia giống nấm men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là:

Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula (hấp thụ tối đa ở

bước sóng 450nm)

Theo Lodder (1971), Koneman E.W và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc

cơ thể đơn bào, nhóm nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 -

400C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây: táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…

Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình

tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy Kích thước tế bào dao động trong khoảng

2 ÷ 5 µm chiều rộng, 2,5 – 10 µm chiều dài tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và độ tuổi

Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt Mép khuẩn lạc không có răng cưa Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏ cam Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4]

2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12]

Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy

và loài khác nhau Gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy

Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ

Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc nhầy

Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài, thường nảy chồi ở đỉnh

Có thể xuất hiện sợi giả và sợi thật

Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi

trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau [4]

dạng

Nguồn phân lập

1 Rh Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê

2 Rh Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán

3 Rh Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia,

đất

4 Rh Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy

5 Rh Diffluens Kem Tròn cầu,

elip

6 Rh Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại

7 Rh Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu

8 Rh Graminis Hồng Tròn cầu

9 Rh Ingeniosa Kem Tròn cầu

10 Rh Javanica Kem Dài

11 Rh Lactosa Vàng, hồng

hoặc đỏ

Tròn cầu Không khí

12 Rh Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm

13 Rh Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển

14 Rh

Mucilaginosa (rubra)

17 Rh Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách

18 Rh Pilimanae Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Nước, đất

2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp [11]

2.2.3.1 Thành phần cấu tạo nấm men

Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái và cấu tạo tế bào

giống như các loài nấm men khác, được cấu tạo từ các thành phần

a Thành tế bào

Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ như kitin

 Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucoza Đó là một polysacharit phân

nhánh có liên kết β-1,3 và β-1,6 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành

tế bào

 Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manoza, mỗi phân tử thường chứa 200 -

400 thành phần manoza Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3 Phân tử lượng của chúng khoảng 5.104 dalton

 Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan Trong

thành phần của chúng chứa nhiều axit amin Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào tương

 Kitin: nằm ở phần nẩy chồi Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3% Đầu là

chất bền vững không bị enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi còn non

 Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng phospholipit, khoảng

mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn Hai hiện tượng này được gọi là

co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất

c Nguyên sinh chất

Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiện nhiều không bào và hạt voluten Thành phần bao gồm: nước, protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym Tế bào chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào

d Nhân

Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu Nó được bao

bọc bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân Nhân thường có hình bầu dục và hình cầu Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp

e Các thành phần khác

- Không bào: là nơi chứa đựng protease

- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào,

nguồn năng lượng cho tế bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào

- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men

- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những

điều kiện đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô

cơ Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và sự có mặt của S cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:

+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào

+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào

+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào

2.2.3.2 Sinh sản nấm men [3], [4], [11]

Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh

pilimanae, Rh pilatii, Rh javaniti, Rh ingniosa, Rh diffluens và Rh bogoriensis

Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân đôi nhưng giống Rhodotorula sp không có kiểu sinh sản theo hữu tính

a Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi

Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con Khi chồi con gần

bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men

b Sinh sản bằng hình thức phân đôi

Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và tạo thành hai tế bào con độc lập Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của tế bào mẹ

Tốc độ sinh sản của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi

thường từ 2 ÷ 6 giờ

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong

Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu

môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22]

Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hoá sau:

 Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me- α -D glucoide, saccharose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào

 Tạo ra ezyme urease

 Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B)

 Có chứa sắc tố carotenoid

 Không tạo thành hợp chất loại tinh bột

 Không tạo ra acid acetic

 Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của

Rhodotorula sp khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida

 Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

- : Không lên men

Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống

Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như: nấm men,

Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số

cơ thể sinh vật quang hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

b Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]

Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19 Và Carotenoid đã được phân lập lần đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831 (thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về carotenoids đã được đặt tên trong suốt những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết

Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của beta-caroten C10H56 và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong năm 1930 -1931 Và trong năm 1919, Steenbock đã đưa ra giả thiết là có thể có mối quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A

Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls Và thập niên 1950, carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu thực phẩm

Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids Có rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm và hoạt động của nó trong cơ thể người

Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thể hữu ích trong việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá

Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất với các màu sắc khác nhau Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật

c Danh pháp và cấu tạo [4]

Có hai cách gọi tên carotenoids:

+ Tên truyền thống: tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết đầu tiên

+ Tên hệ thống: tên theo công thức hóa học Carotenoid được gọi tên theo dẫn xuất carotene với hai nhóm cuối được ký hiệu bằng các ký tự Hy Lạp (theo trình tự alphabe)

Các tiếp đầu ngữ, tiếp vị ngữ được sử dụng để chỉ mức độ hydro hóa và sự hiện diện của các nhóm chức thay thế

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng [4]

Tất cả các carotenoid có thể được xem như là dẫn xuất của acrylic C40H56 có trung tâm là chuỗi gồm nhiều nối đôi liên hợp, do kết hợp với hydro (hydrogenation), khử hydro (dehydrogenation), hình thành vòng (cyclization), thực hiện quá trình oxy hóa (oxidation) tạo nên

Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20) Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene Tiếp theo đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxi hóa, để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong

tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau

d Phân loại

Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính:

+ Carotenes: gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid

+ Xanthophylls: gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy (hydroxy, keto, epoxy, methoxy, các nhóm acid carboxylic)

Hình 2.5: Phân loại carotenoids [4]

Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính có giống men nghiên cứu

Rhodotorula sp hiện điện đủ hai nhóm, trong đó torulene (I), beta-carotene (III) thuộc

nhóm carotenes; torularhodin (II) thuộc xanthophylls

e Tính chất [4], [18], [19]

Carotenoid thường kết tinh ở dạng tinh thể Tinh thể carotenoid có nhiều dạng khác nhau và kích thước của chúng cũng rất khác nhau như dạng hình kim dài (lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện (α-carotene), dạng hình thoi (β-carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene)

Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng 130 – 2200C

Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi như chloroform, dichloromethane Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không phân cực

Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất, nguồn nguyên liệu, điều kiện nuôi trồng, thời tiết,… dạng caroteneoprotein tạo dãy màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen Khi đun sôi sẽ chuyển sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lại bình thường

Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạo màu khác Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt

độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ion kim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…

2.3.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp Carotenoids trong sinh vật [4],[17],[20]

Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành

3 giai đoạn:

 Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ)

 Giai đoạn tổng hợp các enzyme - giai đoạn này xảy ra trong tối

 Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu Giai đoạn hai là hình thành các hợp chất C40 Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con đường là thông

qua farnesyl pyrophosphate Giống Rhodotorula sp thông qua tổng hợp acid mevalonic

tương tự với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968)

Hình 2.6:Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị [4]

Theo Hornero-Mendez D và Britton G (2002 ) có ít nhất 700 loại carotenoid đã được mô tả theo 2 con đường sinh tổng hợp đã được biết Phần lớn là các carotenoid

do các loài thực vật và vi sinh tổng hợp theo con đường C40 Như vậy có nhiều chứng

cứ chắc chắn rằng sự hình thành carotenoid trong nấm men theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất bão hòa Tuy nhiên kết quả về sự hình thành vòng chưa rõ Nhưng nhìn

chung, quá trình sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật được thực hiện qua hai giai đoạn

 Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)

 Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP

2.3.2 Giới thiệu về Beta-Carotene

2.3.2.1 Giới thiệu về Beta-Carotene [19]

Beta-carotene là một phân tử cân đối được cấu tạo do 1 chuỗi prolene và 2 vòng

β -ionone ở 2 đầu, khi thuỷ phân cho 2 phân tử vitamin A Chuỗi liên kết dài sẽ tạo ra màu cam cho beta-carotene

Hình 2.7: Cấu trúc phân tử Betacaroten [18]

Hình 2.8: Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D [21]

2.3.2.2 Tính chất [4],[18]

Beta-carotene là đồng phân quan trọng của hydrocacbon carotene Tên gọi khác: Natural Extracts (carotenes), Natural β-carotene, carotenesnatural; CI Food Orange 5, mixed carotenes, INS No 160a(ii); CI (1975) No 75130; CI (1975) No 40800 (β-Carotene), : b,b-Carotene,

Phân nhóm: thuộc nhóm Carotenoid

Công thức phân tử: C40H56 (β-Carotene)

Khối lượng phân tử: M = 536,88 (β-Carotene)

Nhiệt độ nóng chảy: 1830C

Độ hoà tan: beta-carotene có độ hòa tan rất khác nhau như sau:

+ Tan tốt trong chloroform, benzen, CS2

+ Tan trung bình trong ether, petroleum ether, dầu thực vật

+ Tan hạn chế trong methanol, ethanol

+ Không tan trong nước, acid, hợp chất alkane

Tinh thể beta-carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh từ dung môi benzen-methanol, nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether có dạng lá hình thoi gần như vuông, màu đỏ Dung dịch beta-carotene loãng có màu vàng Beta-carotene có độ hấp thu cực đại trong chloroform tại bước sóng 497nm và 466nm Vì

có 2 vòng β- ionone ở 2 đầu nên beta-carotene có hoạt tính provitamin A mạnh nhất Beta-caroten là một chất chống oxi hoá vì vậy mà nó có thể được dùng để chống lại một số bệnh ung thư và căn bệnh khác Beta-caroten là một chất tự nhiên hiện diện trong những trái cây và rau quả màu vàng xanh Trong cơ thể, beta-carotene nằm trong vitamin A và nó được sử dụng như là một chất bổ sung của vitamin A để ngăn chăn hoặc điều trị những chứng thiếu hụt vitamin A

Beta-carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân Một đồng phân quan trọng là 9 – cis beta – carotene, đồng phân còn lại là all – trans beta – carotene Các đồng phân này đều có công thức phân tử giống nhau nhưng cách sắp xếp của chúng trong không gian ba chiều lại khác nhau Các đồng phân như vậy thường có những đặc tính sinh hóa học rất khác biệt Hợp chất 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa chủ yếu của beta-carotene Trong khi đó, loại beta-carotene tổng hợp chỉ chứa loại đồng phân all – trans beta – carotene có khả năng chống oxi hóa rất thấp

2.3.2.3 Sinh tổng hợp Vitamin A

Beta-caroten còn được gọi là tiền vitamin A, bởi vì nó là một trong những tiền thân quan trọng nhất của vitamin A trong chế độ ăn uống của con người Nếu ta so sánh 2 phân tử sẽ thấy rằng vitamin A (retinol) là ½ phân tử beta-caroten

Hình 2.9: Cấu trúc Vitamin A [19]

Sự sinh tổng hợp vitamin A từ β-Carotene:

Hình 2.10: Sinh tổng hợp vitamin A từ Beta-Carotene [4]

Khi vào cơ thể beta-carotene chuyển hóa thành vitamin A Beta-carotene bị phân cắt ở giữa mạch carbon trung tâm thành 2 phân tử retinal bằng enzyme 15,15’-dioxygenase Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzym thành retinol Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành ruột hay sẽ được vận chuyển nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết hoặc đến gan là nơi tích luỹ vitamin Ngoài ra beta-carotene cũng có thể được chuyển hóa thành những chất khác

2.3.2.4 Sinh tổng hợp Carotenoid ở nấm men

Hiện nay, nấm men đang được tập trung nghiên cứu khả năng sinh tổng carotenoids của chúng Một phần là do nấm men ít gây độc và có thể là thức ăn bổ sung cho con người và động vật

Một vài chủng nấm men đã được phân loại dựa trên khả năng và đặc tính sinh carotenoids của chúng Có rất nhiều loại carotenoid được tổng hợp từ nấm men, trong

đó chủ yếu: carotene, torulene, lycopene, astaxanthin, torularhodin, … Quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men cũng trải qua hai giai đoạn để tạo ra các sản phẩm carotenoid khác nhau là:

 Sinh tổng hợp IPP

 Sinh tổng hợp carotenoids từ IPP

2.3.2.5 Tầm quan trọng của Beta-Carotene đối với sức khoẻ con người

Beta-carotene còn được biết đến là tiền vitamin A Khi hấp thụ vào cơ thể nó được chuyển thành vitamin A với tỷ lệ 1mcg beta-caroten thì được 0,167mcg vitamin Nhưng ngoài những tác dụng như vitamin A, nó còn là một nguồn cung cấp vitamin A

an toàn, không hề gây độc tính quá liều như vitamin A và điều đặc biệt là betacaroten khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A rất nhiều

Các chế phẩm beta-caroten có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khoẻ Phải kể đến những tác dụng như: khả năng hoạt hóa một số tế bào miễn dịch của cơ thể, beta-caroten có thể giảm tổn thương DNA, bảo vệ da tránh tác hại của ánh nắng mặt trời, hạ thấp nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, góp phần làm giảm nồng độ cholesterol trong máu cũng như một số bệnh tim mạch liên quan

Tia cực tím (Ultraviolet: UV) trong ánh nắng mặt trời tạo ra rất nhiều gốc tự do gây tổn thương tê bào da Các vitamin và các dưỡng chất có khả năng chống oxy hóa thường tập trung rất nhiều ở da, như beta-caroten

Phân tử vitamin A khi oxy hóa gốc aldehyt của nó sẽ hình thành nên một chất mới có tên là opsin, là chất tham gia vào cấu tạo của mắt Do đó, beta-carotene có ảnh hưởng tốt đến thị lực của con người

Ngoàii ra, beta- caroten còn tham gia quá trình sinh tổng hợp glycoprotein, chất

mà nếu thiếu hụt trong cơ thể sẽ dẫn đến sự phát triển không bình thường của xương Beta-carotene còn được tìm thấy trong huyết tương người Các nghiên cứu về sức khỏe y học đã cho thấy những người có lượng beta-carotene đưa vào cơ thể cao và có một lượng lớn beta-carotene trong huyết tương thì có khả năng giảm thiểu các mối nguy hiểm của bệnh ung thư phổi

Beta-carotene còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim, dựa trên khả năng của

beta-carotene là có thể kìm chế các chất LDL (Low Density Lipoprotein ) cholesterol gây

hại.Theo một nghiên cứu được công bố trên tờ AmericanJournal of Clinical Nutrition,

các chuyên gia đã tính toán rằng phụ nữ sử dụng ít nhất 5.37mg (8.950IU) carotene mỗi ngày có thể chống lại sự oxy hóa LDL

beta-Có khả năng ngăn ngừa ung thư là một trong những đặc tính quan trọng nhất của beta-carotene Khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư của beta-carotene còn phải dựa trên

sự kết hợp của beta-carotene với các carotenoids khác như lycopene và các chất chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E

Ngoài ra trên thế giới còn có những công trình đang nghiên cứu về beta-caroten như các phát hiện cho thấy beta-caroten có thể là một vũ khí quan trọng trong việc né tránh được các vấn đề về trí nhớ mà có thể là điềm báo của căn bệnh Alzheimer’s và

các chứng bệnh mất trí nhớ khác

2.4 Lên men bán rắn [10],[14]

2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF)

Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn (SSF) là một quá trình trong đó sự sinh trưởng của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của nguyên liệu hầu như không có mặt nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ trong mạng chất rắn

Lên men trên môi trường bán rắn đã được sử dụng từ rất lâu trước khi các quá trình sinh hóa và vi sinh có liên quan được tìm hiểu Năm 2600 trước công nguyên người Ai Cập đã sớm sử dụng SSF để làm ra bánh mì, sự chuẩn bị Koji cho nước tương đậu nành và sản xuất miso cách đây 1000 năm ở Nhật Bản và Đông Nam Á đã chứng minh sự ứng dụng SSF trong đời sống từ rất lâu Ngày nay SSF đang được quan tâm trở lại một cách mạnh mẽ trên toàn thế giới và được sử dụng rộng rãi nhằm gia tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế liệu nông nghiệp và các chất thải công nghiệp

Các quá trình và sản phẩm lên men SSF được nghiên cứu từ 1920-1940 bao gồm sản xuất acid Gluconic, acid citric, và các loại enzyme Giữa năm 1940-1950 công nghệ lên men đã phát triển một cách nhanh chóng và cho ra đời những sản phẩm đầu tiên của cả phương pháp lên men trong lòng dung dịch và lên men trên môi trường bán rắn như kháng sinh, penicillin, …Từ năm 1980, lên men SSF đã phát triển trên nhiều khía cạnh mở rộng việc sử dụng trên nhiều loại vi sinh vật khác nhau, sử dụng phế liệu như một loại cơ chất rẻ tiền, dễ kiếm và phần nào giảm chất gây ô nhiễm môi trường, khám phá các sản phẩm mới

2.4.1.1 Các loại vi sinh vật sử dụng trong lên men bán rắn

Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đếu sinh trưởng và phát triển được trên cơ chất rắn Nấm men được dùng trong sản xuất cồn công nghiệp, cồn thực phẩm, thức ăn gia

súc,… Vi khuẩn được dùng trong sản xuất phân trộn (composting), và các quá trình công nghệ thực phẩm khác

2.4.1.2 Các cơ chất thường dùng trong lên men bán rắn

Cơ chất chính trong SSF là các nguyên liệu thô, phụ phẩm rẻ tiền của ngành nông nghiệp và những phế liệu của các ngành công nghiệp khác, thường có cấu trúc đa phân tử (cung cấp nguồn hidrocacbon và năng lượng) như các nguyên liệu chứa tinh bột: gạo, lúa mì, gạc ngô, xenluloza, các phế liệu ngành công nghiệp thực phẩm: cám, cám mì, sắn, tấm, củ cải đường, bã mía, cùi bắp, vỏ cam, trấu, mạc cưa, bã sắn,

….và các nguyên liệu như lignoxenluloza, các chất thải giàu pectin cũng được dùng trong SSF để sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị cao

2.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bề mặt [15]

Nhìn chung khi lên men bán rắn, cũng như các quá trình lên men khác các thông

số chính cần được kiểm soát bao gồm: các dưỡng chất cần cung cấp, hàm ẩm, nhiệt độ,

pH và độ thoáng khí

 Các dưỡng chất cần phải cung cấp

Trong SSF do tốc độ khuếch tán cơ chất hạn chế nên cũng hạn chế sự tiếp xúc giữa vi sinh vật và cơ chất Một chỉ số quan trọng trong dinh dưỡng quyết định sự sinh trưởng của SSF là tỷ số C/N Tùy từng loài vi sinh vật mà có chỉ số C/N thích hợp khác nhau, chính vì vậy khi thay đổi chỉ số C/N cũng sẽ làm ảnh hưởng đáng kể đến thành phần dinh dưỡng cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường SSF Trong hầu hết các hệ thống SSF, Cacbon có nguồn gốc

từ các nguyên liệu tinh bột và xenluloza tự nhiên, trong khi nguồn nitơ thường được bổ sung vào Nguồn nitơ vô cơ thường được bổ sung nhất là NH4Cl, (NH4)2SO4,

NH4NO3, D.A.P, urê, … Trong khi nguồn nitơ hữu cơ là bánh dầu đậu nành, bã đậu nành, dịch chiết nấm men, pepton

 Hàm ẩm

Hàm ẩm của cơ chất là một thông số rất quan trọng quyết định đến sự thành công của quá trình lên men, có thể được theo dõi qua chỉ số hoạt tính của nước (aw) Đa số các vi khuẩn sinh trưởng ở mức aw cao trong khi nấm sợi và một số các nấm men sinh trưởng ở mức aw thấp và một số sinh trưởng ở mức độ aw trung bình Tuy nhiên khi mức độ aw quá cao làm giảm độ xâm nhập vào khoảng không nội bào, khả năng khuếch tán oxy thấp, giảm sự trao đổi khí, giảm bề mặt cơ chất và tăng nguy cơ nhiễm

tạp khuẩn Ngược lại khi aw thấp dẫn đến giảm sự trương nở cơ chất và giảm sự sinh trưởng của vi sinh vật

 Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những thông số có ảnh hưởng đến các quá trình SSF, do mỗi tế bào có một nhiệt độ tối ưu riêng để sinh trưởng và phát triển Trong SSF một lượng lớn nhiệt được trao đổi và điều này có liên quan chặt chẽ đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật Kiểm soát nhiệt độ đối với SSF còn nhiều khó khăn đặc biệt là khi SSF quy mô lớn, khi nồng độ cơ chất cao sự tăng nhiệt trên một đơn vị thể tích là lớn hơn nhiều so với lên men trên môi trường lỏng

 pH ban đầu

Mặc dù pH là một yếu tố cần quan tâm, nhưng việc điều khiển và kiểm soát pH trong SSF là không đơn giản Việc tạo ra các điện cực để đo pH của chất rắn ẩm khi không có sự hiện diện của nước tự do rất khó khăn Tuy nhiên dung dịch đệm tốt sẽ giúp ổn định pH trong suốt quá trình lên men Điểm thuận lợi này được khai thác trong việc điều chỉnh pH của chất rắn thông qua việc sử dụng nước ở mức pH mong muốn làm chất tạo độ ẩm cho môi trường

 Nhu cầu oxy

Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của oxy và CO2 trong không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm khi nuôi trên môi trường bán rắn Trong điều kiện thiếu oxy, có

sự tạo thành nhiều ethanol, CO2 và lượng sắc tố được tạo ra ít hơn

Cơ chế truyền oxy không khí cho các vi sinh vật hiếu khí vẫn chưa rõ ràng, nhưng chúng thường có khả năng tồn tại do hòa tan trong màng nước xung quanh bề mặt hạt cơ chất Sự thông khí không chỉ cung cấp oxy mà còn tăng cường việc loại trừ

CO2 và tăng cường việc trao đổi nhiệt trong quá trình lên men

2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm

men Rhodotorula sp

Các công bố về khả năng lên men bán rắn của giống nấm men Rhodotorula không nhiều Tuy nhiên theo các tài liệu thu được bước đầu cho thấy giống nấm men này có khả năng lên men bán rắn Nghiên cứu gần nhất là của Jacob (1991) đã thành công khi lên men bán rắn nấm men Rhodotorula gracilis trên môi trường cơ chất là cám mì có bổ sung dinh dưỡng Theo Jacob nấm men dầu Rh gracilis có khả năng

hình thành lượng sinh khối cao hơn (13,7g/l) và chất béo (20,3%) trên môi trường nghèo nitrogen, rẻ tiền và mang lại hiệu quả kinh tế cao đó là rỉ đường không chứa dịch chiết nấm men bằng phương pháp lên men chìm Tuy nhiên khi tiến hành lên men bán rắn trên cơ chất cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có ảnh hưởng đến lượng sinh khối, protein tạo thành, sự hình thành dầu, sự hiện diện của các acid béo và tỷ lệ giữa acid béo bão hòa và không bão hòa Hàm lượng lipid ban đầu trong môi trường điều khiển là 3,5% trong khi với môi trường cám mì, mật rỉ có bổ sung khoáng chất tăng lên đến 69,8% Sản phẩm sau lên men bán rắn chứa sắc tố đỏ carotenoide, tiền vitamin B12 và một số acid béo bão hòa

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Rhodotorula sp chịu ảnh hưởng

của nhiều yếu tố thuộc môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn khoáng đa và vi lượng) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, ánh sáng, hàm lượng oxy hòa tan, )

2.4.2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen [11]

Nguồn cung cấp nitrogen rất cần cho hoạt động trao đổi chất của nấm men Rh

glutinis Nitrogen sử dụng dưới dạng NH4

+ Có tác dụng kích thích quá trình tích luỹ sinh khối lớn nhất Hàm lượng chất béo trong tế bào và quá trình chuyển hóa đường đạt cực đại khi sử dụng nguồn nitrogen là (NH4)2SO4

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sự tổng

hợp carotenoide của nấm men Rhodotorula sp có quan hệ đặc biệt với khả năng sử

dụng các nguồn nitrogen

Nakagawa và Tatsumi (1960) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitrogen

khác nhau và nhận thấy nấm men Rh-100 cho sản lượng carotenoide cao nhất với

nguồn nitrogen là valine, leucine và asparagine, tỷ lệ nguồn C/N tốt nhất là 50 Vecher

và cộng sự khi dùng nguồn nitrogen là lysine và glutamic acid cho thấy loài Rh

gracilis phát triển và hình thành carotene tốt

Khaled M.Ghanem và cộng sự (1990) hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến lượng chất béo tạo thành và chất béo đạt cực đại khi nồng độ (NH4)2SO4 là 5g/l, tuy nhiên lượng chất béo tạo thành bị giảm đi khi tăng nitrogen Điều này tương tự với quá trình trao đổi chất được ghi nhận ở nhiều loài nấm men và nấm mốc khác nhau Nhiều nấm men lại có khả năng tích luỹ lượng lớn chất béo khi

phát triển trên môi trường có dư carbon và thiếu nitrogen Hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến lượng lipid tạo thành và lipid đạt cực đại khi nồng độ (NH4)2SO4 là 5g/l Tuy nhiên lượng lipid tạo thành bị giảm đi khi tăng lượng nitrogen Điều này tương tự với quá trình trao đổi chất được ghi nhận ở nhiều loài nấm men và nấm mốc khác nhau Nhiều nấm men lại có khả năng tích luỹ lượng lớn lipid khi phát triển trên môi trường có dư carbon và thiếu nitrogen

2.4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon [4],[11]

Nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tổng hợp và thành phần các sắc tố carotenoids cũng như sự tích luỹ sinh khối, các acid béo

của giống nấm men Rhodotorula sp Theo Wittmann (1957) nấm men Rh rubra cho

hiệu suất tổng hợp torularhodin trên môi trường có nguồn nitrogen là asparagine và nguồn carbon là glycerol, nhưng với nguồn carbon là sucrose cho hiệu suất cao nhất là torulene, β-carotene, γ-carotene và sản lượng carotene cao nhất phụ thuộc vào điều

kiện nuôi cấy Nấm men Rh rubra có khả năng cho hàm lượng sinh khối tế bào cao

nhất trên nguồn carbon là glucose nhưng khi sử dụng đường fructose, glycerol và sucrose thu được hàm lượng torularhodin và β-carotene cao hơn so với khi dùng glucose, ngược lại glycerol lại kém hơn glucose ở khả năng hình thành torulene

2.4.2.3 Vai trò của các muối

Theo Zalashko và cộng sự (1984) cho rằng trong môi trường, muối làm gia tăng hàm lượng acid béo, sterol và triglyceride Các tác giả Bhosale P., Grade R.V cũng kết

luận rằng chủng đột biến Rh glutinis mutant 32 cần phải được cung cấp thêm các

khoáng chất là K2HPO4, KH2PO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường nhân giống lẫn môi trường nuôi cấy khi tiến hành lên men nuôi cấy thu nhận sắc tố carotenoide Khi môi trường không có NaH2PO4 nấm men phát triển yếu và hàm lượng lipid thấp Ở nồng

độ NaH2PO4 0,5g/l hiệu suất lên men cao nhất Mặt khác thay đổi hàm lượng các muối

K2SO4, ZnSO4.7H2O và FeCl3 (cùng một thời điểm)

Trong môi trường nuôi cấy hầu hết các thí nghiệm cho thấy các muối này không ảnh hưởng đến hoạt lực lên men

Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula sp bị ức chế ở nồng độ muối trên

5%, hiện tượng này đã giải thích thích vì sao khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao Các tài liệu cho thấy nhiều loài nấm men thuộc

giống Rhodotorula sp khá thích hợp với môi trường nước biển, môi trường muối kim

loại kiềm

2.4.2.4 Ảnh hưởng của các chất tự nhiên và dầu bổ sung vào

Các thí nghiệm cho thấy nấm men Rh glutinis cần bổ sung thêm một số các chất

có nguồn gốc tự nhiên Bột ngô ngâm (CSS – corn steep solid) làm tăng đáng kể khả năng tổng hợp chất béo của nấm men (đạt 62,4% trọng lượng sinh khối) so với khi không bổ sung thêm (37%) Hàm lượng CSS tối ưu cho hàm lượng chất béo và hệ số chuyển hóa chất béo cực đại là 5g/l môi trường Nấm men khi được bổ sung thêm dầu hạt bông với hàm lượng 10g/l cũng làm tăng đáng kể khả năng chất béo có trong sinh khối tế bào nấm men Điều này phù hợp với các tài liệu được công bố trước đây là nhiều loại nấm cần bổ sung thêm các vật liệu chứa chất béo (gồm các loại dầu và các acid béo)

2.4.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn (Solid State Fermentation: SSF) [10], [11], [13]

Quá trình lên men bán rắn liên quan đến sự phát triển vi sinh vật xảy ra trong các phần tử rắn nhỏ ẩm của lớp cơ chất, trong đó có một phần hay nhiều phân tử nước tự

do trên bề mặt của các phần tử cơ chất rắn Cơ chất rắn sử dụng trong lên men bán rắn

là những vật liệu hỗn hợp không đồng nhất, thường là các phế phụ phẩm của ngành công nghệ thực phẩm Nuôi cấy bán rắn thường tiến hành trên các khay, các túi nhựa plastic hay các ống hình trụ và không nhất thiết phải thanh trùng môi trường Quá trình SSF cho đến nay vẫn chưa được hiểu thấu đáo về các quy luật của kỹ thuật sinh học, hóa sinh, vi sinh và sinh học phân tử

độ (aw) Việc giảm aw sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha loãng kéo dài,

giảm tỷ lệ tăng trưởng và kết quả dẫn đến lượng sinh khối bị thấp (Oriol et al., 1988)

 pH ban đầu

Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy nấm men Rhodotorula sp thích hợp ở pH

hơi acid từ 4 – 6 tùy theo điều kiện nuôi cấy khác nhau có thể điều chỉnh pH sao cho phù hợp

 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt

Do cơ chất rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo

ra một gradient về nhiệt gây tích tụ nhiệt và làm tăng hàm lượng ẩm của môi trường trong SSF gây ra những khó khăn trong quá trình truyền nhiệt Chính vì vậy biện pháp giảm nhiệt chủ yếu của SSF theo quy mô công nghiệp thường dùng phương pháp làm lạnh bằng bốc hơi có khả năng làm giảm nhiệt độ của môi trường hiệu quả nhất Chức năng chính của phương pháp này là làm thông khí, cung cấp oxy cho vi sinh vật tăng trưởng và loại bỏ CO2 hoặc cũng có thể hạ nhiệt độ phòng nuôi cấy giúp việc giải nhiệt giữa các lớp cơ chất và không khí Việc duy trì nhiệt và hàm lượng ẩm ổn định trong phương pháp SSF ở quy mô lớn là rất khó, tuy nhiên cũng có thể thực hiện được với các thiết bị phù hợp riêng

 Ảnh hưởng của môi trường không khí [15]

Sự thông khí trong SSF thực hiện 4 chức năng sau: duy trì điều kiện hiếu khí; đuổi CO2 ra khỏi môi trường; duy trì nhiệt độ cho cơ chất; điều hòa mức độ ẩm Năm

1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của O2 và CO2 trong không khí

có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm men khi nuôi trên môi trường bán rắn Nấm men này không thể sống trong điều kiện kỵ khí khi sử dụng glucose như cơ chất Nhưng có thể sống trong điều kiện O2thấp Trong điều kiện thiếu oxy, có sự tạo thành nhiều ethalnol, CO2 và lượng sắc tố được tạo ra ít hơn

 Ảnh hưởng của ánh sáng

Các sắc tố trong tế bào nấm men Rhodotorula sp được tạo thành bắt đầu vào cuối

giai đoạn phát triển cấp số và phụ thuộc vào ánh sáng Ở nhiệt độ thấp khoảng 200C hàm lựơng beta-carotene khi được chiếu sáng tăng không đáng kể so với khi không

được chiếu sáng Theo Tada Mikiro và cộng sự (1982) nấm men Rhodotorula minuta

là loài ít có khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trong tối, khi tế bào được chiếu