NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Giới thiệu chungKĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối tế bào và các hợp chất c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

A.ĐẶT VẤN ĐỀ

Giới thiệu chung

Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào

ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính

ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối

tế bào và các hợp chất có giá trị cao

Nuôi cấy Nhân sâm Panax ginseng bằng Bioreacter

KẾT LUẬN

Khái niệm, Đặc trưng

 Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức

nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng

 Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng

Sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào

I GIỚI THIỆU CHUNG

• Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn.

• Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào

đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường.

• Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy

truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi

sự kết tập của tế bào là lớn

• Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn.

• Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào

đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi

thành phần môi trường.

• Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy

truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi

sự kết tập của tế bào là lớn

.

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

tb huyền phù có bản chất là tb callus

mt nuôi cấy calus có thể sử dụng để

khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào

cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc.

Các chỉ tiêu sinh trưởng

• Số lượng tế bào:

Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài

phút.

Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.

Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.

• Thể tích tế bào:

Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.

Thu tế bào và đem xác định thể tích.

Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.

•Khối lượng tươi:

Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.

Rửa bằng nước cất vô trùng

Làm khô trong chân không.

Cân để xác định khối lượng.

•Khối lượng khô:

Lấy một thể tích mẫu xác định.

Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi.

•Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):

Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính Nhỏ 1 giọt

Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100 Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào

Tổng số tế bào phân bào x 100

Chỉ số phân bào(%) =

Tổng số tế bào kiểm tra

•Khả năng sống của tế bào:

nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).

II Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy dịch thể động Nuôi cấy bằng

Bioreacter không có cánh khuấy

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS)

Nuôi cấy chìm liên tục Nuôi cấy chìm tuần hoàn

• Khối tế bào ở đầu này được

đưa vào môi trường Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí

 Khả năng nhân sinh khối rất

nhanh, chồi phát triển tương

đối đồng đều

 phù hợp cho những quá trình

nhân sinh khối tế bào và rễ do

khả năng chịu được sự ngập

chìm trong môi trường

 Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục

 Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau

 Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, côn

trùng

 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

(TIS).

• Pha 1: mô không ngập

trong môi trường

• Pha 2: hiện tượng ngập

được hoạt hóa, các van

mở ra cho khí đi qua các

màng lọc đẩy môi trường

lỏng lên ngập mô cấy

• Pha 3: sự trao đổi khí

Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy

• Lá nhỏ hơn lá trong môi trường nuôi cấy lỏng

• Các cụm chồi phát triển thường có hình cầu

• Chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm

một số chồi con có kích thước không lớn Chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn so với nuôi cấy trên môi trường thạch

Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn

• Ứng dụng trên nhiều đối tượng

cây trồng, không bị biến dị với tần

số cao

• sinh trưởng và hệ số nhân cao

• Cây tái sinh và phôi soma thu

được có chất lượng tốt

• Hạn chế hiện tượng thủy tinh thể

• Tiết kiệm công lao động và không

gian nuôi cấy, giảm chi phí sản

suất

• Giảm hoạt tính của các chất độc

• Chưa khảo sát được mật độ nuôi

cấy

• rất đắt, chưa được tự chế tạo

trong nước

• Các thông số kĩ thuật cần được

khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây

Các bước cơ bản

III Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào

trong nhân giống vô tính.

 Nuôi cấy callus: tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi

trường thạch mềm

 Nuôi cấy dịch huyền phù:

• Callus được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động

• Các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường

các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết

Sự phát sinh soma

 sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin, nước dừa,

dùng nhiều xytokinin, myo-inosiol giảm lượng nitrogen

 phôi soma có kích thước tương đối nhỏ và đồng đều kích

cỡ nên chúng không phải cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh

 sau đó cất trữ hoặc tạo ra cây con trực tiếp

Sự nhân chồi

Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy việc nhân chồi:

 chồi sinh trưởng tốt hơn, chất lượng tốt hơn và dài hơn

so với chồi trên môi trường rắn

 chồi có thể tăng trưởng liên tục cho phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng mà không cần cấy chuyền

 Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi trường tự nhiên bình thường như trên môi trường thạch

IV Ứng dụng trong sản suất sinh khối tế bào thực vật

và các hợp chất có giá trị cao

NHÂN SINH KHỐI CALLUS

NHÂN SINH KHỐI CALLUS

NHÂN SINH KHỐI RỄ

NHÂN SINH KHỐI RỄ

 Hiệu suất mang

lại rất cao

 Một số sản phẩm:

• Alkaloid:morphina

• Các hợp chất kháng ung

thư: taxol, saponin

Tốc độ tăng trưởng rất cao

Nđ:

• Nguồn cung cấp Oxy ko đến đc với sinh khối ở giữa Bioreactor

mô bị lão hóa

• Khả năng nuôi cấy rễ thành công phụ thuộc vào việc thiết kế hệ thống Bioreactor phù hợp

1 SỐ HỢP CHẤP THỨ CẤP

Diosgenin: chống viêm; chữa sốt, thấp khớp, đau lưng

Cây củ nâu

Cây Anh túc

Codein : giảm đau và

giảm ho

Cây thông đỏ

hóa trị liệu ung thư

Cây nhân sâm

Saponin và sapogenin:

chữa rối loạn tiêu hóa,

chống suy nhược cơ thể,

tăng cường sinh lực

T axol

V Ứng dụng trong nuôi cấy thông đỏ đê

thu nhận Taxol.

Thông Đỏ

•Nguồn dược liệu rất quý trong y học:

•Năm 1994 công bố: “từ cây thông đỏ

có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa

trị bệnh ung thư cụ thể là Taxol chiết

suất từ vỏ các loài: T brevifolia, T

cuspidata, T.yunnanensis, T baccata

và T wallichiana,…

•Chữa ung thư buồng trứng và ung

thư vú, chống các khối u ác tính, ung

thư phổi và một số dạng khối u rắn

khác

I.Mẫu nuôi cấy: có thể lấy phần ngọn, lá,…mẫu dùng để nuôi cấy phải có những tính chất sau:

•Mẫu tế bào phải được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp chất cần thiết và có khả năng được tổng hợp hay chuyển hoá cao nhất

•Mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất

•Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn, môi trường nuôi cấy ở đây là:

1 Đầu tiên mô sẹo được nuôi cấy

trong các bình tam giác thể tích

200ml có chứa 20ml môi

trường và đặt trên máy lắc có

tốc độ 90-100 vòng/phút, nhiệt

độ 28-30 o C, với ánh sáng 3000

lux, cứ khoảng 2-3 ngày lấy

mẫu ra kiểm tra bằng cách

đếm đưới kính hiển vi, xây

dựng đường cong tăng trưởng

của tế bào.

2 Sau 1-2 tuần trong bình nuôi

cấy sẽ tạo huyền phù tế bào :

• Tế bào có khả năng sinh

phôi

• Tế bào không có khả năng

sinh phôi

1 Đầu tiên mô sẹo được nuôi cấy

trong các bình tam giác thể tích

200ml có chứa 20ml môi

trường và đặt trên máy lắc có

tốc độ 90-100 vòng/phút, nhiệt

độ 28-30 o C, với ánh sáng 3000

lux, cứ khoảng 2-3 ngày lấy

mẫu ra kiểm tra bằng cách

đếm đưới kính hiển vi, xây

dựng đường cong tăng trưởng

của tế bào.

2 Sau 1-2 tuần trong bình nuôi

cấy sẽ tạo huyền phù tế bào :

• Tế bào có khả năng sinh

cứ như vậy nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn, tỷ lệ giống trong sản xuất lớn khoảng 1-5%.

Hiện nay đã thiết kế những thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục

m3 thiết bị lên men ở đây tương tự như

trong công nghệ vi sinh vật Đối với các

thiết bị nuôi cấy tế bào đơn không có hệ thống cung cấp oxygen mà chỉ có cách

khuấy thì cần phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế bào xảy ra.

 cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí

nghiệm nuôi cấy huyền phù tb rất đắt nên việc

áp dụng trong sản xuất còn hạn hẹp

f w

s